Аномальный апоптоз наблюдается при многих заболеваниях [1], в том числе и при ишемическом инсульте (ИИ) [2-4]. Усиление процесса апоптоза является одним из основных механизмов повреждения нервной ткани в зоне ишемической полутени (пенумбры), приводящего к расширению зоны инфаркта и, соответственно, повышению степени неврологического дефицита у лиц, перенесших ИИ [2-4]. Кроме того, усиление апоптоза при ИИ, также как и развитие непосредственно связанных с ним воспалительных иммунных реакций, наблюдается не только на уровне головного мозга, но и в периферической крови и других тканях [5-7]. Молекулярные механизмы интенсификации апоптоза при ИИ еще не до конца ясны. Поскольку ИИ является заболеванием многофакторным с полигенным типом наследования, в наблюдаемое при этом заболевании нарушение процесса апоптоза могут вносить вклад как факторы окружающей среды, так и генетические факторы [8, 9]. Так, была обнаружена ассоциация комбинаций полиморфизмов генов, кодирующих белки рецепторного и митохондриального путей индукции апоптоза, с тяжестью состояния больных в остром периоде ИИ и объемом инфаркта мозга [10-12]. Показано, что изменение экспрессии генов, вовлеченных в механизмы регуляции апоптоза, может играть важную роль в развитии ишемического повреждения мозга [13, 14].

В последние годы в работах по изучению на­рушений апоптоза большое внимание уделяется белку аннексину-А5. Этот белок способен связываться с отрицательно заряженными фосфолипидами, включая фосфатидилсерин, который уже на ранних этапах апоптоза переходит с внутреннего на наружный слой мембраны клетки, претерпевающей апоптоз. Мембранная форма аннексина-А5 - важнейший модулятор процесса фагоцитоза апоптотических клеток и воспалительных реакций, направленных на удаление гибнущих клеток [15-18]. Растворимая форма аннексина-А5 рассматривается как маркер апоптоза. Ее источником служат апоптотические клетки и их фрагменты. Повышение содержания растворимой формы аннексина-А5 в крови свидетельствует об ускорении апоптоза, и, напротив, низкое, по сравнению с нормой, содержание этого белка в крови свидетельствует о замедлении апоптоза [15-18].

Цель настоящей работы - изучение связи между ИИ и однонуклеотидной (–1C/T) функциональной заменой (полиморфизм rs11575945) в консенсусной последовательности Козак регуляторного участка гена аннексина-А5 (ANXV), играющей ключевую роль в инициации трансляции [19]. Определены также содержание аннексина-А5 в сыворотке крови больных c ИИ в 1-й день от начала заболевания в сравнении со здоровыми лицами и зависимость между уровнями этого белка в крови и генотипами полиморфизма rs11575945.

В исследование включены 94 больных в остром периоде ИИ, 35 мужчин и 59 женщин, средний возраст 67±9 лет, находившихся на лечении в Республиканском медицинском центре «Армения». Контрольную группу физически и психически здоровых лиц составили добровольцы - сотрудники институтов НАН РА, 110 человек, 48 мужчин и 62 женщины, средний возраст 57±9 лет. Диагноз ИИ устанавливался согласно МКБ-10 [20] на основе анамнеза, неврологического обследования, компьютерной томографии (КТ) головного мозга и базисного лабораторного исследования. Патогенетические подтипы инсульта определяли на основе классификации TOAST [21]. В данное исследование были включены только больные с кардиоэмболическим (n=17) или атеротромботическим (n=77) подтипами ИИ. В исследование не включали пациентов с повторным ИИ, с другими патогенетическими подтипами инсульта, с черепно-мозговыми травмами, церебральными геморрагиями или опухолями головного мозга. Степень неврологического дефицита инсульта определялась по шкале Национального института здоровья США (NIHSS) [22], в исследование включены пациенты со средней степенью тяжести инсульта (средний исходный балл неврологического дефицита - 17). Контрольная группа состояла из здоровых лиц, которые в прошлом не переносили инсульт и не имели наследственной отягощенности по этому заболеванию. Никто из субъектов исследования не страдал воспалительными, аутоиммунными, психическими, метаболическими (сахарный диабет и др.) или онкологическими заболеваниями; не переносил инфаркт миокарда, острых инфекционных либо каких-либо других серьезных заболеваний, не подвергался хирургическому вмешательству и не принимал препараты иммуномодулирующего, про- либо антиапоптотического действия как минимум за 12 мес до забора крови. Все обследованные были этническими армянами, проживающими на территории Армении. Все они были проинформированы врачами о предстоящем исследовании и дали согласие на взятие крови. Исследование одобрено Комитетом по этике Института молекулярной биологии НАН РА.

Кровь забирали из локтевой вены и охлаждали во льду. У больных с ИИ забор крови проводили в течение 24 ч от начала заболевания, до проведения какого-либо медикаментозного лечения. Часть крови помещали в пробирки без антикоагулянта и использовали для получения сыворотки, другую часть - в пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта EDTA. Для получения сыворотки кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и отбирали надосадочный раствор. ДНК из крови выделяли по ранее описанному методу с использованием смеси фенола и хлороформа [23]. Образцы сыворотки и ДНК хранили при –30 °С. Все исследуемые образцы анализировали в двух повторах.

Полиморфизм rs11575945 гена аннексина-А5 определяли путем генотипирования образцов ДНК больных и здоровых лиц при помощи полимеразной цепной реакции с аллель-специфичными праймерами (PCR-SSP) [24]. Олигонуклеотидные праймеры конструировали на основе базы данных Международного биотехнологического центра (GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov, GeneID:308). Получены и использованы следующие праймеры: специфичный для C-аллеля - CCTGACCTGAGTAGTCGCC; для T-аллеля - CCTGACCTGAGTAGTCGCT; константный праймер - GCCACGTCACCAGCTGTTGC.

В качестве контрольных праймеров использовали последовательности TGCCCAAGTGGAGCACCCAA и GCATCTTGCTCTGTGCAGAT. В десятой части произвольно отобранных образцов генотипирование проводили дважды для проверки воспроизводимости данных и было показано, что повторы всех произвольно выбранных образцов одинаковы. Электрофорез продуктов амплификации ДНК проводили в 2% агарозном геле с использованием 0,045 М трис-боратного буфера, рН 8,0, содержащего 0,001 М EDTA и бромистый этидий (0,7 мкг/мл). Полосы в геле визуализировали при помощи контактной УФ-лампы.

Концентрацию аннексина-А5 в сыворотке крови определяли, используя метод твердофазного иммуноферментного анализа и коммерческий набор реагентов («USCN Life Science Inc.», США) согласно инструкции производителя.

Статистическую обработку данных проводили при помощи программного пакета GraphPad Prism 3.03 («GraphPad Software Inc.», США). При обработке данных генотипирования распределение генотипов rs11575945 в исследуемых группах проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга. Частоту генотипов, аллелей и носителей мутантных аллелей в исследуемых группах рассчитывали, основываясь на данных электрофореза (по числу и местоположению соответствующих полос в геле). Значимость различий по отмеченным параметрам между больными и здоровыми определяли по критерию &khgr;², рассчитывая отношение шансов (OR), 95% доверительный интервал (CI) и доверительную вероятность Пирсона (р). Значения р<0,05 были приняты как статистически значимые. Статистическую мощность исследования определяли как описано ранее [25]. При обработке данных по содержанию аннексина-А5 в крови субъектов исследования использовали порядковую статистику и непарный двухконцевой t-тест Стьюдента. Значения р<0,05 были приняты как статистически значимые.

В таблице представлены результаты генотипирования полиморфизма rs11575945 гена аннексина-А5. Распределение его генотипов в группах больных и здоровых лиц соответствует уравнению Харди-Вайнберга (р>0,05). Частота мутантного T-аллеля у больных в среднем в 2,6 раза выше этого параметра у здоровых (р<0,000008, OR=3,06, 95% CI: 1,85-5,06). Соответственно число носителей отмеченного аллеля в группе больных также достоверно выше (в среднем в 2 раза), чем аналогичный параметр в группе здоровых (р<0,0001, OR=4,41, 95% CI: 2,94-6,62). Статистическая мощность данного исследования составляет 99,09%.

Концентрация аннексина-А5 в сыворотке крови больных с ИИ в среднем в 3 раза превышала аналогичный параметр в группе здоровых (4,74±1,64 нг/мл против 1,55±0,53 нг/мл; р<0,0001). Результаты этой части исследования представлены на рисунке.

Ген аннексина-А5 имеет длину 29 кб и содержит 12 экзонов, которые кодируют одну полипептидную цепь, состоящую из 319 аминокислот [26, 27]. Консенсусная последовательность Козак гена аннек­сина-А5 (как и любого другого гена) включает специфическую последовательность нуклеотидов, окружающую старт-кодон гена с обеих сторон. Эта последовательность важна для инициации трансляции [28]. Было показано, что замена С на Т в позиции-1 последовательности Козак гена аннексина-А5, т.е. полиморфизм rs11575945, положительно ассоциируется с сердечно-сосудистыми заболеваниями [19], а также является фактором риска развития венозных тромбозов [29]. Ранее мы также обнаружили положительную связь между этим полиморфизмом и шизофренией [30]. Результаты настоящего исследования однозначно свидетельствуют о положительной ассоциации rs11575945 полиморфизма гена аннексина-А5 с ИИ, что позволяет рассматривать мутантный аллель этого полиморфизма как фактор риска развития данного заболевания.

В семейство аннексинов входит более 160 сходных по структуре белков, способных в присутствии Ca⁺⁺ связываться с отрицательно заряженными фосфолипидами, в частности с фосфатидилсеринами [15, 31]. Самым распространенным белком этого семейства является аннексин-А5, который был обнаружен во многих тканях, включая кровь [23].

В нормальных клетках отрицательно заряженные фосфолипиды, с которыми связан этот белок, находятся преимущественно на внутренней поверхности плазматической мембраны, а в апоптотических клетках уже на ранних этапах апоптоза фосфатидилсерин экспонируется на наружной поверхности клеточной мембраны. Этот процесс является неотъемлемой частью апоптоза независимо от типа клеток и пускового механизма активации программы клеточной гибели [24, 25]. Источником внеклеточной (растворимой) формы аннексина-А5 в сыворотке/плазме являются апоптотические клетки крови и сосудистого эндотелия [15-18]. Следует отметить, что данные литературы относительно содержания в крови растворимой формы этого белка при патологических состояних организма человека довольно ограничены. Так, низкие уровни растворимого аннексина-А5 в крови по сравнению с нормой были обнаружены при самопроизвольном прерывании беременности (спонтанный аборт) [32], у больных с инфарктом миокарда [33] и при посттравматическом стрессовом расстройстве [34]. Высокие уровни растворимого аннексина-А5 в крови по сравнению с нормой наблюдались при некоторых психических заболеваниях [35], патологиях, связанных с дисфункцией сосудистого эндотелия [36], шизофрении [30] и семейной средиземноморской лихорадке [37].

Результаты настоящего исследования показали, что уровень аннексина-А5 при ИИ в среднем в 3 раза превышает таковой у здоровых (р<0,0001), что в определенной степени обусловлено большей частотой у больных ИИ мутантного аллеля rs11575945 полиморфизма гена аннексина-А5. Повышенные уровни аннексина-А5 в крови больных с ИИ по сравнению с нормой могут являться также и результатом интенсификации процессов запрограммированной гибели клеток, циркулирующих в центральном кровотоке, как это наблюдалось в случае глубокой депрессии [28], или/и эндотелиоцитов, что было выявлено при патологии сосудистого эндотелия [29], или/и отражать характерную для ИИ интенсификацию нейронального апоптоза [38].

Не следует также исключать возможную функциональную значимость повышенных по сравнению с нормой уровней растворимого аннексина-А5 в крови больных с ИИ, поскольку этот белок выполняет широкий спектр функций, большинство из которых связано с его высоким сродством к фосфолипидам [23, 31]. В частности, способность аннек­сина-А5 связывать кислые фосфолипиды тесно связана с его физиологически важной ролью в гемо­статической системе, так как отрицательно заряженные головки этих фосфолипидов формируют поверхность, на которой происходит сборка начальных комплексов внутреннего каскада коагуляции [39]. При этом связанный с фосфолипидами аннексин-А5 предотвращает образование протромбиназного комплекса и связывание с ним теназы - одного из главных стимуляторов процесса свертывания крови. Было также обнаружено, что аннексин-А5 повышает эффективность действия фибринолитических лекарственных препаратов [40].

Кроме того, имеются свидетельства, что нестабильность атеросклеротической бляшки, ее разрыв и образование тромба обусловлены апоптозом [41-43]. На поверхности апоптотических клеток при участии фосфатидилсерина активируются прокоагулянтные реакции: образование протромбиназного комплекса и тромбиногенез [44]. Аннексин-А5, связываясь с фосфатидилсерином, формирует «антитромботический щит» и снижает риск тромбоза, обусловленного апоптозом [29]. Следовательно, аннексин-А5 обладает антитромботическми свойствами, и не исключено, что его высокие уровни при ИИ по сравнению с нормой могут отражать компенсаторный ответ организма на характерную для этого заболевания повышенную свертываемость крови [45].

Таким образом, механизмы, ответственные за высокие уровни растворимого аннексина-А5 в крови при ИИ, могут быть обусловлены не только генетическим фактором, но также и воздействием ряда эндогенных патогенных факторов, связанных с развитием ИИ, как это наблюдается при биполярном аффективном расстройстве [46], или/и компенсаторными реакциями организма, как описано выше.