Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) - воспроизводимое у лабораторных животных заболевание ЦНС с аутоиммунным компонентом, которое широко используется в качестве модели рассеянного склероза (PC) для доклинической апробации новых методов лечения и изучения патогенеза заболевания [1, 2].

Основной гипотезой иммунопатогенеза PC является положение об активном проникновении через гематоэнцефалический барьер аутоагрессивных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. При этом начальные события патогенетической цепи разворачиваются не в ЦНС, а в периферической крови, где происходит сенсибилизация лимфоцитов к антигенам миелина. Одной из ключевых проблем патогенеза PC остается вопрос о механизмах «срыва» иммунологической толерантности и приобретения Т-клетками аутоагрессивных свойств [3-6].

С учетом того что антигензависимая пролиферация лимфоцитов происходит в периферических лимфоидных образованиях, представляет интерес изучение изменений, происходящих в лимфоидной ткани кишечника (ЛТК) при развитии ЭАЭ, в том числе на фоне иммуномодулирующей терапии.

ЛТК, включающая в себя как организованные структуры (пейеровы бляшки, аппендикс, лимфоузлы), так и отдельные клеточные элементы, является одной из наиболее значимых составляющих системы иммунитета. Известно, что слизистая кишечника на 25% состоит из иммунологически активной ткани, в которой локализуется около 80% всех иммунокомпетентных клеток организма [7]. Подобная иммунологическая «вооруженность» кишечника обусловлена его значением как органа, который напрямую контактирует с многочисленными внешними антигенами и принимает активное участие в формировании иммунного ответа [8, 9].

Все большее внимание исследователей привлекает возможная роль кишечника и ЛТК в патогенезе различных аутоиммунных заболеваний, в том числе демиелинизирующих. Так, известно, что при ЭАЭ пероральное назначение миелина и его компонентов способно предотвращать и подавлять уже развившийся иммунопатологический процесс [10, 11]. Опубликован ряд работ, описывающих позитивное влияние гельминтных инфекций пищеварительного тракта на течение PC, в основе которого, вероятно, лежит иммуномодулирующий эффект [12-14]. Обсуждается возможная роль в развитии демиелинизирующих процессов микрофлоры кишечника (МК), тесно связанной в иммунологическом плане с ЛТК [8, 9, 15]. Так, в работе F. Westall [16] было показано, что среди нескольких сотен наиболее распространенных бактерий и вирусов антигенными детерминантами, наиболее близкими по свойствам к антигенам миелина, обладают бактерии MK. В других исследованиях на модели ЭАЭ со спонтанным развитием было установлено, что у животных, выращенных в стерильных условиях и лишенных МК, ЭАЭ не развивается, несмотря на их генетическую предрасположенность к развитию демиелинизации. При заселении кишечника таких животных бактериями-представителями МК наблюдалось развитие аутоиммунного процесса с характерной патоморфологической и клинической картиной ЭАЭ [17, 18]. Также на модели ЭАЭ было показано, что пероральная антибиотикотерапия, вызывающая элиминацию МК, тормозит развитие аутоиммунного воспаления в ЦНС и приводит к регрессу клинических симптомов [19]. Авторы этих работ, проводя параллели между ЭАЭ и PC, рассматривают МК и ее антигены в качестве возможного триггерного фактора, инициирующего развитие аутоиммунного демиелинизирующего процесса по механизму «молекулярной мимикрии» у генетически предрасположенных лиц [17-19]. Таким образом, именно ЛТК может являться той частью иммунной системы, где происходит «перекрестная» сенсибилизация лимфоцитов к антигенам бактерий МК и миелина.

С периферической лимфоидной тканью связан и механизм действия финголимода - первого и наиболее изученного представителя инновационного класса препаратов-модуляторов сфингозин-1-фосфат (S1P)-рецепторов. Прием финголимода приводит к ингибированию S1Р-рецепторов на Т- и В-лимфоцитах и, как следствие, к селективной задержке аутоагрессивных Т- и В-лимфоцитов в лимфоузлах, предотвращению их миграции в ЦНС и ограничению степени повреждения нервной ткани [20]. Большинство публикаций, связанных с изучением механизма действия финголимода, посвящено исследованию клеточного состава периферических лимфоузлов, при этом экспериментальные данные о влиянии финголимода на ЛТК при ЭАЭ отсутствуют, равно как и клинические работы о состоянии ЛТК при РС.

Цель работы - установление характера изменений клеточного состава пейеровых бляшек и периферических (паховых) лимфоузлов при развитии ЭАЭ у мышей без лечения и при приеме финголимода.

Работа выполнена на 40 инбредных мышах, C57Bl/6, 5-6 недель, самках, составивших две экспериментальные группы: группа «ЭАЭ без лечения» - мыши с ЭАЭ, не получавшие лечения финголимодом - 18 животных; группа «ЭАЭ-финголимод» - мыши с ЭАЭ, получавшие финголимод (ЗАО «Биокад», Россия), - 17 животных. Контрольной группой служили интактные мыши - 5 животных.

ЭАЭ моделировали путем однократного введения 100 мкг/кг MOG 35-55 (Sigma) и двукратного введения 300 нг коклюшного анатоксина. Оценку тяжести возникавшей симптоматики проводили с использованием клинического индекса.

Забор биологического материала производили на 10-е, 15-е, 20-е, 30-е и 50-е сутки развития модели ЭАЭ в подгруппах по 3-5 животных. Финголимод вводили перорально с 11-х по 25-е сутки в дозе 0,3 мг/кг 1 раз в сутки. Влияние финголимода на клеточный состав ЛТК оценивали на 15-е, 20-е, 30-е и 50-е сутки развития модели, что соответствовало 5-м, 10-м, 20-м и 40-м суткам от начала терапии.

Паховые лимфоузлы были взяты для исследования в качестве типичной группы периферических лимфоузлов, пейеровы бляшки - как пример организованной ЛТК. Общее количество лимфоцитов подсчитывали на окрашенных гематоксилином Майера срезах на стандартной площади в случайно выбранных полях зрения (50 полей в каждом случае), что позволяло получить показатель относительной плотности (ОП) лимфоцитов. При иммуногистохимическом исследовании в паракортикальной зоне паховых лимфоузлов и Т-зоне пейеровых бляшек типировали клетки двух субпопуляций - CD4 и CD8, играющих важную роль в развитии демиелинизации при ЭАЭ и РС [21-24]. Оценивали ОП субпопуляций и их соотношение на фиксированной площади среза в стандартизированных участках. При статистическом анализе данных для сравнения двух независимых групп использовали критерий Стьюдента: критический уровень значимости составлял p<0,05.

Развитие модели ЭАЭ, оценивавшееся по возникновению клинической симптоматики, отмечалось у 100% лабораторных животных. На 20-е сутки наблюдения в группе «ЭАЭ без лечения» двигательные нарушения наблюдались у 66,7% животных, зрительные - у 50%, чувствительные - у 66,7%; в группе «ЭАЭ-финголимод» двигательные расстройства наблюдались у 47,1% животных, зрительные - у 29,4%, чувствительные - у 82,4%. В дальнейшем выраженность неврологического дефицита, оставаясь достоверно ниже в группе «ЭАЭ-финголимод», уменьшалась в обеих группах, что может быть объяснено закономерным регрессом клинической симптоматики при монофазном течении ЭАЭ. При патоморфологическом исследовании ЦНС обнаруживалась «классическая» картина ЭАЭ с явлениями демиелинизации и воспалительной инфильтрации. Развитие ЭАЭ сопровождалось визуально определяемой гиперплазией периферических лимфоузлов (в том числе паховых) и ЛТК. При анализе плотности распределения лимфоцитов, CD4 и CD8a были выявлены групповые и топические различия.

На стандартной площади паракортикальной зоны паховых лимфоузлов средние показатели ОП составляли: для лимфоцитов - 37,6±2,77 клеток, для CD4-лимфоцитов - 24,3±1,94 клеток, для CD8-лимфоцитов - 16,5±1,67 клеток; отношение CD4/CD8 = 4,47.

Показатель ОП лимфоцитов значительно увеличивался уже на 10-е сутки, а на 15-е сутки достигал максимума - 76,3±4,51 клеток (в 2 раза выше показателя контрольной группы), оставаясь в дальнейшем без значительных изменений вплоть до 50-х суток наблюдения, когда отмечалось его снижение до 67,0±4,76 клеток.

Показатель ОП CD4-лимфоцитов также значительно увеличивался уже на 10-е сутки и достигал максимальных значений на 15-е сутки - 49,9±3,79 клеток (в 2,1 раза выше показателя контрольной группы). Однако в дальнейшем, на 20-е сутки он значительно снижался (до 33,1±4,23 клеток) и сохранялся на этом уровне до окончания периода наблюдения.

Достоверное увеличение показателя ОП CD8-лимфоцитов происходило лишь на 15-е сутки, а максимальные значения регистрировались на 30-е сутки (35,4±5,66 клеток, т.е. в 2,15 раза выше уровня в контрольной группе). В дальнейшем, до окончания периода наблюдения, значимых изменений ОП CD8-лимфоцитов не отмечалось.

Отношение CD4/CD8 на 10-е сутки возрастало до 2,39 за счет увеличения показателя ОП CD4-лимфоцитов, а затем на фоне увеличения ОП CD8-лимфоцитов постепенно уменьшалось до 0,98 к 20-м суткам, оставаясь без существенных изменений до окончания периода наблюдения.

Таким образом, в группе «ЭАЭ без лечения», по сравнению с контрольной, отмечались стабильно более высокие показатели ОП лимфоцитов на протяжении всего периода наблюдения, а также фазные изменения ОП исследуемых субпопуляций: с 10-х по 20-е сутки наблюдалось преимущественное повышение показателя ОП CD4-лимфоцитов, а с 20-х по 30-е сутки - показателя ОП CD8-лимфоцитов.

Введение финголимода в течение 5 суток приводило к увеличению показателя ОП лимфоцитов до 86,3±7,51 клеток (против 76,3±4,51 клеток в группе «ЭАЭ без лечения»). К моменту окончания введения финголимода и в течение всего последующего периода наблюдения значительного снижения показателя ОП лимфоцитов не отмечалось, при этом сохранялись достоверные различия с группой «ЭАЭ без лечения» (82,3±8,33 против 67,0±4,76 клеток на 50-е сутки наблюдения).

Показатель ОП CD4-лимфоцитов после 5 суток введения финголимода увеличивался до 54,9±3,45 клеток (по сравнению с 49,9±3,79 клеток в группе «ЭАЭ без лечения»), а к моменту окончанию терапии снижался до уровня в группе «ЭАЭ без лечения» и сохранялся без значительных колебаний до окончания периода наблюдения.

Показатель ОП CD8-лимфоцитов уже на 5-е сутки введения препарата значительно (в 1,7 раза) превышал аналогичный показатель в группе «ЭАЭ без лечения» (49,3±7,54 против 29,3±7,32 клеток). На 10-е сутки введения финголимода и на 5-е сутки после прекращения терапии показатель ОП CD8-лимфоцитов также превышал этот же показатель в группе «ЭАЭ без лечения», но различия были недостоверными. В конце периода наблюдения различия между группами вновь достигали уровня статистической достоверности: 40,9±6,03 против 31,1±4,43 клеток.

Отношение CD4/CD8 на 10-е сутки увеличивалось до 2,39 за счет возрастания показателя ОП CD4-лимфоцитов, но уже на 15-е сутки оно уменьшалось до 1,10 за счет значительного увеличения ОП CD8-лимфоцитов. Весь последующий период наблюдения отношение CD4/CD8 имело значения от 0,73 до 0,88 - существенно ниже, чем в контрольной группе, что отражало стабильно высокие показатели ОП CD8-клеток.

Таким образом, в группе «ЭАЭ-финголимод» в течение всего периода наблюдения показатель ОП лимфоцитов превышал аналогичные показатели в группах «ЭАЭ без лечения» и контрольной. По сравнению с группой «ЭАЭ без лечения» введение финголимода сопровождалось значительно более выраженным увеличением ОП CD8-лимфоцитов и соответственно более низкими значениями отношения CD4/CD8.

На стандартном поле среза пейеровой бляшки показатели ОП составляли: для лимфоцитов - 31,4±3,01 клеток, для CD4-клеток - 18,5±3,11, для CD8-клеток - 12,1±2,07; отношение CD4/CD8 = l,52.

Показатель ОП лимфоцитов увеличивался, достигая максимальных значений на 20-е сутки - 54,0±5,01 клеток (в 1,72 раза выше, чем в контрольной группе), а в дальнейшем снижался до 37,3±3,76 клеток на 50-е сутки, сохраняясь тем не менее на уровне, достоверно превышающем показатель в контрольной группе.

Показатель ОП CD4-лимфоцитов на 10-е сутки достоверно увеличивался до 27,8±4,05 клеток (в 1,5 раза выше, чем в контрольной группе) и сохранялся без значительных колебаний на протяжении всего периода наблюдения.

Показатель ОП CD8-лимфоцитов достоверно возрастал уже к 10-м суткам, достигал максимума к 15-м суткам - 22,09±1,9 клеток (в 1,83 раза выше, чем в контрольной группе) и постепенно уменьшался к 50-м суткам до 17,9±2,45 клеток (в 1,48 раза выше, чем в контрольной группе).

Отношение CD4/CD8 первоначально снижалось, достигая минимальных значений к 20-м суткам - 1,08, а затем постепенно увеличивалось до уровня в контрольной группе (1,58 на 50-е сутки, рис. 1).

Показатель ОП лимфоцитов увеличивался на 5-е сутки введения препарата, достигал максимума к 10-м суткам терапии - 65,5±4,12 клеток (достоверно выше, чем в группе «ЭАЭ без лечения» - 54,0±5,01 клеток) и оставался на высоком уровне весь последующий период наблюдения.

Показатель ОП CD4-лимфоцитов уже на 5-е сутки введения финголимода превышал аналогичный в группе «ЭАЭ без лечения» в 1,23 раза (30,2±2,05 против 24,5±4,96 клеток) и достигал максимальных значений на 10-е сутки введения препарата - 38,0±1,90 клеток. После прекращения введения финголимода показатель ОП CD4 снижался почти вдвое к 30-м суткам (до 20,1±2,62 клеток) и оставался без значительных изменений до окончания наблюдения, будучи достоверно ниже показателя ОП в группе «ЭАЭ без лечения».

Показатель ОП CD8-лимфоцитов уже на 5-е сутки введения финголимода достоверно превышал таковой в группе «ЭАЭ без лечения» (27,0±2,00 против 22,09±1,9 клеток) и в дальнейшем продолжал заметно увеличиваться, причем эта тенденция сохранялась и после прекращения терапии, что отразилось в максимальных различиях с этим показателем в группе «ЭАЭ-финголимод» в конце периода наблюдения - на 50-е сутки (36,5±3,71 против 17,9±2,45 клеток, рис. 2, 3).

Отношение CD4/CD8 на фоне введения финголимода претерпевало разнонаправленные изменения. После окончания терапии наблюдалось его значительное уменьшение по сравнению со значениями в контрольной группе и в группе «ЭАЭ без лечения», отражающее снижение ОП CD4 на фоне продолжающегося увеличения ОП CD8-клеток (рис. 4).

В группе «ЭАЭ без лечения» в паховых лимфоузлах и пейеровых бляшках во все сроки наблюдения показатели ОП лимфоцитов значительно (в 1,5-2 раза) превышали аналогичные показатели в контрольной группе, достигая максимальных значений к 10-15-м суткам развития модели. Также наблюдалось увеличение показателей ОП CD4- и CD8-лимфоцитов с достижением максимальных значений для CD4 к 10-15-м суткам, для CD8 - к 20-м суткам. Последующее снижение показателей до значений, близких к значениям в контрольной группе, наблюдалось к моменту окончания периода наблюдения. Повышение и снижение показателей ОП лимфоцитов и субпопуляций CD4 и CD8, наблюдавшиеся параллельно с возникновением и регрессом клинических симптомов ЭАЭ, свидетельствуют об активном участии ЛТК в развитии аутоиммунного демиелинизирующего процесса в ЦНС.

В группе «ЭАЭ-финголимод» введение финголимода сопровождалось более значительным (в 1,2-1,5 раза) в сравнении с группой «ЭАЭ без лечения» повышением показателей ОП лимфоцитов и субпопуляций CD4, CD8 в паховых лимфоузлах и пейеровых бляшках. Динамика изменения показателей ОП этих субпопуляций обнаруживала некоторые особенности: на 5-10-й дни введения финголимода наблюдался значительный подъем показателей ОП и CD4, CD8, после чего плотность CD4 начинала снижаться и после прекращения введения препарата достигала уровня в контрольной группе. Снижение показателя ОП CD8-клеток в паховых лимфоузлах после прекращения введения препарата было не столь быстрым и значительным, а в пейеровых бляшках ОП CD8-клеток продолжала увеличиваться и после окончания терапии. Это может свидетельствовать о преимущественном и пролонгированном влиянии финголимода на «задержку» в периферической лимфоидной ткани аутоагрессивных, «МОГ-определенных» CD8-клеток, играющих важную роль в патогенезе демиелинизирующего процесса [21, 23, 25] (см. рис. 3, 4). Клинический индекс, отражающий тяжесть симптоматики, в группе «ЭАЭ-финголимод» на фоне введения препарата имел более низкие значения по сравнению с группой «ЭАЭ без лечения», что, вероятно, отражает терапевтическую эффективность финголимода.

На основе данных, полученных в настоящем исследовании, можно сделать следующие выводы.

При моделировании ЭАЭ у мышей развитие и регресс клинических симптомов сопровождалось фазными изменениями ОП лимфоцитов и субпопуляций CD4 и CD8 в паховых лимфоузлах и пейеровых бляшках, что свидетельствует о типичной системной реакции лимфоидной ткани (с некоторыми «органными» особенностями) и, вероятно, отражает ее активное участие в развитии аутоиммунного демиелинизирующего процесса в ЦНС.

Введение лабораторным животным с ЭАЭ финголимода (ЗАО «Биокад», Россия) сопровождалось более значительным и длительным повышением показателей ОП лимфоцитов, CD4- и в особенности CD8-клеток в исследуемых лимфоидных образованиях, а также формированием менее выраженного неврологического дефицита, что свидетельствует об эффективности проводившейся терапии.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ЛТК (пейеровы бляшки) активно реагирует на развитие аутоиммунного демиелинизирующего процесса в ЦНС и иммуномодулирующую терапию. Это косвенно подтверждает предположение о том, что именно в ЛТК под действием антигенов МК может происходить первичная сенсибилизация лимфоцитов к антигенам миелина.