Рассеянный склероз (РС) - тяжелое заболевание нервной системы, характеризующееся разрушением миелиновой оболочки, хроническим воспалением, патологическими изменениями аксонов и олигодендроцитов и прогрессирующей неврологической дисфункцией. РС считается заболеванием мультифакториальной природы. В его этиологии большую роль играет взаимодействие внешних факторов и особенностей структуры большого количества генов, каждый из которых вносит незначительный вклад в реализацию заболевания. Выявление факторов риска развития РС, к числу которых относятся и генетические факторы, может осуществляться в рамках эпидемиологических исследований.

Для изучения заболеваний, встречающихся в популяции с низкой частотой, таких как РС, наиболее часто используются эпидемиологические исследования по дизайну «случай-контроль». Одним из ключевых звеньев поиска факторов риска при проведении эпидемиологических исследований является корректная интерпретация результатов. После статистической обработки данных получают два параметра - «отношение шансов» (OR) и его уровень статистической значимости (p-value или просто p).

В терминах клинической практики OR характеризует шанс попасть в группу больных («случаев»), при условии носительства индивидуумом аллеля риска. Точность этой оценки зависит от многих парамет­ров, например размера выборки. По этой причине кроме расчета OR обычно вычисляют доверительный интервал (95%CI, confidence interval) и уровень значимости (p). Принято считать результаты с p<0,05 статистически значимыми; чем меньше значение p, тем выше уровень доверия к полученным результатам. Только в случае статистически значимого p допустима интерпретация величины OR.

Важным этапом оценки качества результатов проведенного исследования является также оценка его мощности. Мощность исследования, а точнее мощность статистического анализа результатов исследования, характеризует вероятность того, что мы увидим реально существующую ассоциацию в спланированном исследовании. Мощность исследования выражается в процентах. Приемлемым уровнем принято считать 80% и более. Мощность исследования зависит от многих параметров: распространенность заболевания в популяции, частота исследуемого полиморфного локуса, степень связи полиморфного локуса с заболеванием, размер исследуемых групп. Чем слабее связь полиморфного локуса с заболеванием, тем большего размера группы требуются для достижения приемлемой мощности. Например, если распространенность заболевания 0,001 (1 случай на 1000 человек), частота аллеля риска полиморфного локуса 0,3, то для того чтобы с мощностью 80% и уровнем статистической значимости 0,05 выявить ассоциацию с OR>1,25, необходимо сформировать группу больных и контрольную группу численностью не менее 900 человек каждая. Более слабые ассоциации (OR<1,25) по результатам такого исследования, скорее всего, будут не выявлены.

Таким образом, учитывая многофакторную природу РС, для успешного проведения эпидемиологического исследования необходимы группы пациентов с РС и контрольная не менее 900 человек каждая. Вследствие низкой частоты заболевания в популяции выборки такого размера можно сформировать только в рамках объединенного общероссийского исследования. В настоящее время получены первые результаты подобного исследования, подтверждающие необходимость объединения данных разных исследователей-клиницистов для повышения мощности исследования.

В группу пациентов с РС вошли 1684 человека, 1124 женщины и 560 мужчин (средний возраст - 36,7±11,2 года).

У 1176 человек был ремиттирующий тип (РРС), у 73 - первично-прогрессирующий тип (ППРС), у 403 - вторично-прогрессирующий тип течения заболевания (ВПРС), у 22 пациентов - дебют, у 10 - клинически изолированный синдром (КИС).

Пациентов обследовали на базе следующих учреждений: Московский городской центр рассеянного склероза (на базе Городской клинической больницы №11) - 508 человек; Омская областная клиническая больница - 305; Кемеровская областная клиническая больница - 224; кафедра неврологии и нейрохирургии Сибирского государственного медицинского университета, Томск - 152; Краевая клиническая больница, Барнаул - 146; Государственная новосибирская областная клиническая больница - 248; Республиканская больница №2, Якутск - 101.

Диагноз РС ставился согласно критериям МакДональда [3] в версии 2001 г.

В контрольной группе были 879 человек (346 мужчин и 533 женщины, средний возраст 33,0±12,0 лет) без воспалительных заболеваний центральной нервной системы. Они проживали в Новосибирске - 576 человек, Барнауле - 118, Москве - 112, Якутске - 60 и Омске - 22.

Исследование было одобрено этическими комитетами перечисленных учреждений. Все пациенты и лица, вошедшие в контрольную группу, подписывали информированное согласие на участие в эксперименте.

Для молекулярно-генетического исследования ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК смесью фенола с хлороформом и осаждение ДНК этанолом. Генотипирование полиморфных локусов rs6074022, rs1883832, rs1535045 и rs11086996 проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов. Это исследование было выполнено в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (Новосибирск).

Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия; http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl). Ассоциацию генотипа с РС исследовали с помощью логистического регрессионного анализа (функция «glm» статистического пакета R, www.r-project.org). Статистическую мощность исследования вычисляли с помощью программы Genetic Power Calculator (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/gpc/cc2.html).

В 2009 г. по результатам полногеномного исследования была выявлена ассоциация РС и полиморфного локуса rs6074022 хромосомы 20q13 расположенного выше гена CD40 [5]. Ранее ассоциация полиморфных локусов гена CD40 была установлена с рядом таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка [6], ревматоидный артрит [4], болезнь Крона [1], болезнь Грейвса [2]. Важная роль гена CD40 в развитии аутоиммунного процесса показана на модельной линии мышей K/BxN, у которых спонтанно развивается ревматоидный артрит. Нокаутные по гену CD40 мыши (K/BxN-CD40-/-) не страдают от ревматоидного артрита. Ассоциация РС и полиморфного локуса rs6074022 гена CD40 согласуется с аутоиммунной природой заболевания. Однако приводимые здесь данные были получены на жителях Австралии, Великобритании и Новой Зеландии, и они требуют верификации в других странах.

Для исследования ассоциации с РС были выбраны 4 полиморфных локуса: rs6074022, rs1883832, rs1535045, rs11086996. Два полиморфных локуса, rs6074022 и rs1883832, лежат выше старта транскрипции гена, rs1535045 - в интроне гена и rs11086996 - в экзоне. Генотипы всех полиморфных локусов были определены у пациентов с РС и в контрольной группе. Эффективность генотипирования составила ≥99,9% для каждого полиморфного локуса. Пять пациентов были исключены из дальнейшего анализа из-за отсутствия результатов генотипирования. Распределение генотипов статистически значимо не отличалось от равновесия Харди-Вайнберга для всех исследованных полиморфных локусов. Наличие ассоциации полиморфных локусов с РС исследовалось с помощью логистического регрессионного анализа (табл. 1).

Предположим, что исследование проводилось одновременно в двух разных местах на выборках из жителей РФ, но меньшего объема, например в Москве, Сибирском федеральном округе и Республике Саха (СФО и РС). Данное обстоятельство потенциально могло бы повлиять на результаты (табл. 2).

Важным является тот факт, что частоты встречаемости аллелей как в контрольной группе, так и в группе пациентов с РС между жителями Москвы и СФО и РС статистически значимо не отличаются. Причина различий в получаемых данных обусловлена не генетической гетерогенностью групп, а исключительно случайным набором данных и низкой мощностью исследования.

По результатам всего исследования можно сделать вывод, что полиморфные локусы rs6074022 и rs1883832 ассоциированы с РС. Однако для того чтобы понять, как именно реализуется связь полиморфных локусов гена CD40 с развитием патологии, необходимо выявить причинный полиморфный локус и механизм его реализации. Выявление причинного полиморфного (-ых) локуса (-ов) в гене CD40 позволит лучше понять механизм участия в развитии аутоиммунных патологий.

Работа поддержана Российской федеральной программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2012-1.5-12-000-1002). Государственный контракт №8490.