Рассеянный склероз (РС) - самое распространенное воспалительное демиелинизирующее заболевание ЦНС. Несмотря на многолетнее изучение РС до сих пор не существует ни одного его патогномоничного признака. В связи с этим поиск специфических биомаркеров при РС в настоящее время является актуальной задачей не только клинической медицины, но и нейробиологии.

Биомаркерами называют измеряемые и поддающиеся количественному определению параметры (например, концентрация фермента, распределение фенотипа гена в популяции, присутствие в биологических жидкостях определенных веществ), которые служат для оценки физиологических и патологических процессов в организме, таких как риск возникновения заболевания, воздействие факторов внешней среды и его влияние, диагностика заболевания, метаболические процессы и др.

В настоящее время ведется активный поиск биомаркеров РС, способных предсказать и оценить темп прогрессирования заболевания, помочь в определении тактики лечения и оценить его эффективность, прояснить во многом еще неизученный патогенез заболевания и, наконец, выявить новые мишени для терапии. Кроме того, учитывая неспеци­фичность клинических проявлений РС, исследуются также диагностические маркеры, позволяющие выявить заболевание на раннем этапе развития и своевременно начать патогенетическую терапию и определить группы риска по РС [42].

На данный момент для РС не выявлено биомаркеров, обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью. На сегодняшний день при демиелинизирующих заболеваниях специфичный маркер известен только для оптикомиелита (ОМ), - это антитела к аквапорину-4 (Aqp-4). Их выявление позволяет дифференцировать оптикомиелит Девика от других заболеваний нервной системы. Частота выявления варьирует в различных исследованиях и, вероятно, зависит в том числе от этнической принадлежности изучаемой группы пациентов.

Поиск и валидация биомаркеров РС обусловлены сложностью и гетерогенностью патогенеза этого заболевания. Иммунохимические методы исследования выявили, что формирование бляшки демиелинизации у разных пациентов происходит не одинаково. Было выделено 4 основных морфологических типа (паттерна) демиелинизации при РС. Паттерн I характеризуется интенсивной макрофагальной инфильтрацией, превалирующей над Т-лимфо­ци­тарной. В бляшках паттерна II доминируют иммуноглобулины, также в большом количестве определяется C9neo-антиген. Для бляшек I и II паттернов общими чертами является деструкция всех белков миелина. К особенностям паттерна III относятся преимущественная деструкция миелин-ассоциированного гликопротеина (MAG) в дистальных отделах олигодендроцитарных отростков, фрагментация ядрышек олигодендроцитов. Данный паттерн демиелинизации по своим цитологическим характеристикам очень близок изменениям в белом веществе при ишемии. В бляшках IV паттерна описана первичная олигодендроцитарная дегенерация с равномерным разрушением всех белков миелина и фрагментацией генетического материала.

Таким образом, гистоиммунохимические исследования подтверждают гетерогенность патогенеза РС и диктуют необходимость учитывать, что набор биомаркеров, характеризующих свойства патологического процесса при различных механизмах демиелинизации, также может быть разнородным.

Маркеры воспаления. Воспалительная реакция при РС является одним из центральных звеньев патогенеза. Считается, что первым этапом развития воспалительной реакции является активация обладающих энцефалитогенным потенциалом лимфоцитов и их проникновение в ЦНС через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). По нынешним представлениям, активация лимфоцитов связана с нарушением иммунного гомеостаза и влиянием дополнительных экзогенных сигналов в первую очередь постоянным воздействием бактериальных и вирусных антигенов. При их мигрировании через ГЭБ они экспрессируют металлопротеиназы и различные цитокины, реактивируются с помощью фрагментов миелиновых антигенов, что приводит к дальнейшему увеличению выброса биологически активных молекул и прогрессивному развитию воспалительной реакции в ЦНС. Дополнительными повреждающими факторами являются активно продуцирующиеся в ходе воспаления токсические медиаторы, такие как нитросоединения и активные формы кислорода. Кроме того, происходят активация В-лим­фо­цитов и усиление продукции антител против компонентов миелина, которое обусловливают развитие демиелинизации, что было показано как в экспериментальных моделях, так и у людей [6].

Биомаркеры, выявляющиеся в крови и ЦСЖ пациентов с РС, являются отражением описанных реакций. Об активации процесса говорит изменение уровней цитокинов, молекул адгезии, миграции и других маркеров, отражающих текущую воспалительную реакцию, нарушение целостности ГЭБ в биологических жидкостях больных РС. В ряде исследований было отмечено повышение провоспалительных цитокинов TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-23, IL-2, IL-1β, IL-17, CXCL12, CXCL13, IP-10,CCL-5 и др., молекул адгезии sICAM, sVCAM, VLA-4, LFA-1 и др., а также матриксных металлопротеиназ ММР2, ММР8 и ММР9 во время обострения. В то же время выявлено снижение уровней других цитокинов, таких как IL-4, IL-10. Показана связь уровней указанных молекул как с клинической активностью заболевания, так и с количеством накапливающих контраст очагов при магнитно-резонансной томографии (МРТ). Однако в других работах существенного изменения концентрации цитокинов при РС отмечено не было. В связи с этим был сделан вывод, что изменение уровней провоспалительных цитокинов - неспецифическое явление, которое наблюдается как при РС, так и при других воспалительных заболеваниях нервной системы [5, 18, 32, 53, 54, 58, 59, 73, 75]. Достаточно много исследований было посвящено изучению изменения уровней провоспалительных цитокинов в ответ на лечение. При терапии препаратами интерферона-β происходило снижение уровней TNF-α, IFN-γ, VLA-4, повышение IL-4, IL-5, IL-10, CCR-7 [14, 48, 64, 65]. При лечении метилпреднизолоном - снижение уровней VLA-4, LFA-1, VCAM-1 и Е-селектина [16]. После терапии натализумабом снижались уровни IL-1β, IL-6, IL-8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL22 [49].

Об активации В-лимфоцитов у больных РС говорит характерное для них выявление интратекального синтеза иммуноглобулинов, которые являются основным компонентом, образующим олигоклональные полосы (ОСВ), выявляемые при иммуно­электрофорезе (ИЭФ) ЦСЖ у 95-97% больных. При наличии ОСВ в ЦСЖ у пациентов с клинически изолированным синдромом (КИС) значительно увеличивается вероятность перехода в ремиттирующую форму РС, независимо от результатов МРТ. Кроме того, было показано, что у пациентов с РС без ОСВ в ЦСЖ течение заболевания более доброкачественное и часто характеризуется атипичной клинической картиной и данными МРТ [30]. В то же время стоит отметить, что ОСВ могут встречаться при других аутоиммунных, а также инфекционных и онкологических заболеваниях ЦНС [39]. Интересно, что ОСВ появляются в начале заболевания, и в дальнейшем, независимо от течения, активности процесса и лечения, их набор не меняется [39, 80]. Выявление IgM ОСВ, особенно направленных на липидные антигены, коррелирует с более агрессивным течением заболевания (высокая доля прогредиентных форм, ранняя инвалидизация) и худшим ответом на терапию иммуномодуляторами [8, 10, 45, 70, 72, 79].

Другим маркером активации В-лимфоцитов являются легкие каппа-цепи иммуноглобулинов (FLC-&kgr;), представляющие собой белки, продуцируемые В-клетками в процессе выработки антител.

В последующем изучению чувствительности и специфичности указанного маркера для диагностики и дифференциальной диагностики РС было посвящено достаточно много работ. Во многих исследованиях [22, 31, 56] было показано, что определение уровней FLC-&kgr;, а также определение отношения легких мономерных цепей &kgr; к легким димерным цепям λ по диагностической значимости не уступает ОСВ в ЦСЖ. Считается, что состав FLC в течение заболевания стабильный, кроме того, он не меняется в ходе лечения иммуномодуляторами [60, 61]. Наконец, стоит отметить, что в одном исследовании [61] также было показано прогностическое значение FLC-&kgr;: пациентам, имевшим высокую концентрацию маркера в ЦСЖ, раньше требовалась опора при ходьбе.

Изменения «профиля» антител при РС обнаруживаются как в крови, так и в ЦСЖ. При этом соотношение между «профилями» антител в ЦСЖ и сыворотке при РС бывает разным. У большей части пациентов с ремиттирующим течением профили антител указывают на синтез антител только в пределах ЦНС. У 10% пациентов с ремиттирующей или вторично-прогредиентной формой и практически у всех пациентов с первично-прогредиентной часть ОСВ обнаруживается только в ЦСЖ, однако есть полосы, которые встречаются и в ЦСЖ, и в сыворотке крови, что указывает на повреждение ГЭБ [72].

Мишени антител при РС неизвестны. Основные белки, липиды и другие соединения-кандидаты приведены в табл. 1.

В то же время было отмечено, что антитела к сульфатидам чаще встречаются при вторично-прогредиентном течении [28], а IgG к GD1a - при первично-прогредиентном [1]. Кроме того, некоторые антитела к липидам могут иметь прогностическое значение. Так, выявление антител к галактоцереброзиду у пациентов с КИС является предиктором его перехода в РС с ремиттирующим течением [50]. Обнаружение антител к кардиолипину было связано с проявлением заболевания в виде медленно прогрессирующей миелопатии или нейропатии зрительного нерва [33]. Была выявлена корреляция повышения антител к GM3 с аксональным повреждением и изменением инвалидности в сторону утяжеления при прогредиентных формах РС [62]. Наконец, повышение титров антител к GM1 и фосфолипидам было связано с активностью заболевания, появлением очагов, накапливающих контраст при МРТ [7, 81].

В связи с тем, что в работах на животных моделях многие белки миелина вызывали аутоиммунный аллергический энцефалит (ЕАЕ) [64], было выдвинуто предположение, что они могут быть потенциальными биомаркерами при РС. Было проведено много исследований, посвященных изучению антител к белкам миелина или отдельным их эпитопам. Результаты часто оказывались противоречивыми, однако было показано, что наиболее перспективными биохимическими маркерами среди белков миелина являются MOG (олигодендроцитарный белок миелина) и МВР (основной белок миелина), однако также проводились исследования, посвященные OSP (специфический олигодендроцитарный белок), MAG и др. Антитела к этим компонентам могли выявляться чаще у пациентов с РС, но не имели существенного прогностического значения [3, 12]. На достаточно крупных выборках больных с КИС было продемонстрировано, что выявление антител к MOG и МВР не связано с более высокой частотой перехода заболевания в РС [37]. Титры антител к MOG и МВР в сыворотке и ЦСЖ у пациентов с РС были, как правило, выше, чем у группы контроля, причем более высокими были уровни MOG, в некоторых исследованиях была показана связь с активностью заболевания или более тяжелым течением (при первично-прогредиентном и вторично-прогредиентном РС) [15, 21, 35]. Повышение IgA-титров к МВР и MOG было связано с прогредиентным течением. Поскольку данный вид иммуноглобулинов не может инициировать воспалительную реакцию, считается, что их эффект обусловлен ингибированием ремиелинизации [15].

В связи с предположением, что одним из этиологических факторов при РС являются различные инфекционные агенты, проведено много исследований, направленных на выявление инфекционных маркеров, в том числе антител к вирусным и бактериальным антигенам и определение их диагностического и прогностического значения. Наибольшее число работ посвящено вирусу Эпштейна-Барр (ВЭБ). При РС отмечена более высокая доля серопозитивности к ВЭБ (99% против 90-95% в общей популяции), кроме того, была показана связь РС с инфекционным мононуклеозом [57]. Во многих исследованиях выявлено повышение ассоциированного с латентным течением инфекции ядерного антигена EBNA-1 и 2 в сыворотке крови и ЦСЖ пациентов с РС, в том числе до дебюта заболевания, отмечена связь с активностью заболевания и неблагоприятным прогнозом [2, 13, 17]. Однако подобная ассоциация не была подтверждена другими исследователями [29]. Поэтому на сегодняшний день диагностическое и прогностическое значение определения антител к EBNA при РС остается предметом дискуссий. Еще более противоречивы данные относительно других инфекционных агентов, таких как вирусы кори, ветрянки, краснухи, простого герпеса, цитомегаловируса, HHV-6, хламидии, микоплазмы, стрептококков.

Важным звеном в патогенезе РС является распространение активности процесса на окружающие ткани. Астроглия является максимально метаболически активным компонентом нервной системы, ее изменения при воспалительных заболеваниях, несомненно, более выражены, чем при прочих патологиях ЦНС [82].

Глиальный кислый протеин (GFAP) - большой структурный белок промежуточных филаментов астроцитов. Увеличение его концентрации связано с высокой активностью астроглии, что чаще всего сопровождает воспалительный процесс в ЦНС, сопровождающейся астроцитозом. Показано, что в острый период заболевания концентрация GFAP в ЦСЖ повышается при обширном поражении, какое бывает при оптикомиелите, и является неблагоприятным прогностическим маркером [74]. Среди пациентов с РС увеличение GFAP в ЦСЖ выявлено у больных вторично-прогредиентным РС и редко с ремитирующим РС, положительно коррелирует с выраженностью неврологического дефицита [25, 43, 44, 55].

S100 - кислый кальций-связывающий протеин, экспрессируется преимущественно астроглией, является маркером острого повреждения ЦНС, его повышение выявлялось в острый период инсульта и при черепно-мозговой травме [20, 52]. Данные же по изменению уровня данного пептида у больных РС в период обострения недостаточно убедительны [38, 55].

Наконец, одним из важнейших повреждающих факторов при РС, как и при любом воспалении, является увеличение экспрессии мРНК NO-синтазы в астроцитах, клетках микроглиально-макрофагального ряда, эндотелиальных клетках, причем, как правило, подобные изменения характерны для активных очагов, тогда как в старых очагах и очагах у пациентов с вторично-прогредиентным РС подобной активности не наблюдается [41]. Взаимодействие NO и продуктов его метаболизма с белками приводит к образованию нитрованных аминокислотных остатков, S-нитрозотиолов (RSNOs), N-нитрозаминов (RNNOs), нитрозогемоглобина.

В большинстве исследований показано увеличение уровня нитритов в биологических жидкостях по сравнению с группой контроля: уровень нитритов выше при обострении, зависит от типа течения РС. Пероксинитрит и активные формы кислорода (АФК) приводят к повреждению митохондрий, которое лежит в основе одного из возможных механизмов нейродегенерации при РС.

Маркеры нейродегенерации. Нейродегенерация до недавнего времени рассматривалась как причина стойких симптомов при прогредиентном течении РС. Однако, благодаря расширению возможностей биохимических и нейровизуализационных методов, было выявлено, что нейродегенерация имеет место уже на самых ранних этапах заболевания. При патоморфологических исследованиях было установлено, что потеря аксонов при РС происходит не только в очагах, но и в окружающем белом веществе, причем не было выявлено корреляции между распространенностью очагов и степенью аксонального повреждения. Методом МР-спектроскопии in vivo было обнаружено снижение количества N-ацетил­аспартата в неизмененном на Т2 белом веществе, что подтверждает деструкцию аксонов. Таким образом, можно предположить, что потеря аксонов в белом веществе может происходить по двум механизмам. С одной стороны, повреждение аксонов может протекать по типу дегенерации в очагах вследствие периодически возникающего воспаления и демиелинизации. С другой стороны, повреждение аксонов может протекать по типу диффузной аксонопатии, не коррелирующей с демиелинизацией, что выражается в постоянном нарастании неврологического дефицита, чаще при прогрессирующем течении РС. Согласно гистохимическим исследованиям, в бляшках и в области диффузно-измененного белого вещества происходят идентичные изменения аксонов, представленные увеличением степени фосфорилирования нейрофиламентов и изменением их конформации. Вероятно, оба варианта аксонопатии могут в разной степени присутствовать у разных пациентов и в различных проводящих путях ЦНС, что может обусловливать значительную гетерогенность в течении болезни.

Существует целый ряд исследований, направленных на изучение изменений в сером веществе головного мозга при РС методами МРТ, была показана значимая корреляция степени повреждения серого вещества с баллом EDSS уже на ранних стадиях заболевания [61]. В ходе клинических наблюдений отмечено, что возникающий у больных когнитивный дефицит, как правило, длительно не превышает степени умеренного и не регрессирует в ходе лечения. При нейровизуализационном исследовании больных с когнитивным дефицитом показано значимое снижение объема серого вещества неокортекса. Таким образом, нейродегенеративные изменения происходят и в коре головного мозга больных РС.

Высокоспецифичными маркерами разрушения аксона являются субъединицы нейрофиламентов. Данные гетерополимерные белки состоят из трех пептидов, называемых легкой, средней и тяжелой цепями (NfL, NfM и NfH, соответственно). В предыдущих работах были получены разрозненные сведения о содержании NfL и NfH в ЦСЖ и крови больных РС: концентрация NfL в ЦСЖ выше у больных РС с ремиттирующим течением заболевания в период обострения в сравнении с периодом ремиссии и пациентами с первично-прогредиентным РС. Максимальная концентрация NfL была выявлена на 3-й неделе от начала обострения. Терапия натализумабом приводила к значительному снижению интратекального уровня NfL [25]. Антитела к NfL чаще обнаруживаются у больных с первично-прогредиентным РС [44]. Также было показано, что уровень NfL в ЦСЖ выше в период обострения у больных с ремиттирующим течением заболевания, чем при остальных вариантах [44]; обнаружена положительная корреляция уровня NfL с когнитивными изменениями у пациентов с КИС, показано наличие антител к NfL [19].

Другим компонентом цитоскелета являются микротрубочки, состоящие из α- и β-тубулиновых субъединиц. С микротрубочками ассоциированы tau-протеин и микрофиламенты, в том числе актин. Уровень тубулина и актина в ЦСЖ выше у пациентов с прогредиентными формами заболевания в сравнении с ремиттирующим РС и коррелирует с оценкой по шкале EDSS [66]. Таким образом, актин и тубулин являются маркерами прогрессирования заболевания. Tau-протеин выполняет роль стабилизатора структуры и организации микротрубочек, его повышение в ЦСЖ ранее было описано при болезни Альцгеймера. Данный протеин локализован преимущественно в нейронах и клетках глии. Об ассоциации tau-протеина со стадией РС получены противоречивые данные [69]. Повышение tau-протеина и NfH может быть обнаружено уже в дебюте заболевания, уровень NfH является предиктором перехода демиелинизирующего заболевания в достоверный РС [11].

Для нейродегенеративного процесса характерно изменение активности ферментов и, как следствие, формирование β-амилоида из мембранного белка предшественника амилоида. При РС растет синтез в нейронах белка предшественника амилоида, увеличивается мобильность мембранной секретазы, участвующей в формировании нейротоксичного амилоида 1-42 [27, 40] и β-амилоида 1-40, чаще ассоциированного с микроангиопатией [23]. Данные по уровню пептидов β-амилоида в ЦСЖ больных РС немногочисленны и противоречивы по результатам: не было обнаружено разницы между больными и контрольной группой [67, 77].

Амилоид 1-42 является внеклеточным нерастворимым белком, чем объясняется его снижение в ЦСЖ пациентов с болезнью Альцгеймера. Его снижение также выявлено у пациентов с РС, показана корреляция с когнитивным дефицитом и снижением пластичности, индуцируемой транскраниальной магнитной стимуляцией [51]. Пептиды амилоида также могут являться новыми антигенами, сформированными в результате патологического ферментативного процесса. Была показана нейропротективная роль β-амилоида 1-40 и 1-42 на примере экспериментального аутоиммунного энцефалита [24].

Белок 14-3-3 - растворимый белок цитоплазмы, содержащийся в большинстве тканей млекопитающих, участвующий в регуляции процессов клеточного цикла, апоптоза и сигнальной трансдукции. Белок 14-3-3 является маркером болезни Крейтц­фельдта-Якоба, показано повышение его концентрации у пациентов с синдромом Гийена-Барре. При ремиттирующем РС выявлено увеличение белка 14-3-3 в ЦСЖ, по данным протеомных методов исследования (2D-электрофореза и MALDI-MS), белок 14-3-3 является маркером фазы обострения при РС [69].

Цель настоящего исследования - исследование тяжелых цепей нейрофиламентов и антител к сульфатидам при РС.

В исследование были включены 3 группы больных с РС, а также соответствующие им по полу и возрасту здоровые.

В группу изучения иммуноглобулинов класса IgG к сульфатиду в сыворотке вошел 51 пациент с РС, 15 с вторично-прогредиентным РС, 36 с ремиттирующим РС и 22 соответствующих по полу и возрасту здоровых. Характеристика групп представлена в табл. 2.

Исследование NfH в сыворотке было проведено у 25 пациентов с ремиттирующим РС, у 21 - с вторично-прогредиентным РС, группы сравнения - 13 пациентов с боковым амиотрофическим склерозом. В контрольную группу вошли 13 пациентов без патологии со стороны нервной системы, которым проводилось хирургическое вмешательство с применением спинальной анестезии. Характеристики групп пациентов представлены в табл. 3.

Забор крови проводился в утренние часы. Сразу после забора проводилось центрифугирование (2000 об/мин, 15 мин). Полученные сыворотки хранились при температуре -80°С до момента использования.

Определение антител к сульфатиду проводилось с помощью ELISA (human sulfatide ELISA kit, Cusabio), согласно инструкции производителя. Уровень NfH и амилоида 1-42 определялся в сыворотке крови пациентов с вторично-прогредиентным РС, сыворотке и ЦСЖ контрольной группы, пациентов с ремиттирующим РС и пациентов с боковым амиотрофическим склерозом. Определение NfH проводилось с помощью ELISA (ELISA kit for the Sensitive Detection of the Heavily Phosphorylated, Axonal Variants of the Major Neurofilament subunit NF-H, EnCor Biotechnology Inc.), амилоида 1-42 - с помощью ELISA (ELISA kit for Human Aβ42, Invitrogen). Анализ выполнялся строго согласно инструкции производителей.

В предшествующих работах выявление у больных антител к галактоцереброзидам было предвестником перехода из КИС в РС, его сульфатиды чаще обнаруживались у пациентов с вторично-прогредиентным РС [28, 34]. Эти данные могут указывать на неблагоприятное прогностическое значение при выявлении подобных антител в биологических жидкостях больных, в связи с чем исследовали антитела к сульфатиду в сыворотке больных с РС.

Антитела к сульфатиду были выявлены у 8 (36%) здоровых и 24 (47%) пациентов с РС. При этом они определялись с одинаковой частотой при ремиттирующем (47%) и вторично-прогредиентном (47%) течении РС, но не были обнаружены ни у одного больного во время первого обострения заболевания. Выявление антител к сульфатидам было связано с более ранним наступлением вторично-прогредиентного течения (40 мес у положительных по IgG к сульфатиду против 115 мес у отрицательных).

Учитывая данные о значении нейродегенерации на всех этапах развития заболевания, вклад дегенеративных процессов в формирование стойкого неврологического дефицита, нарастание визуализационных признаков дегенерации при длительном течении заболевания, нами было проведено исследование концентрации NfH и амилоида 1-42 в сыворотке и ЦСЖ пациентов с ремиттирующим РС и боковым амиотрофическим склерозом (группа сравнения), сыворотке крови пациентов с вторично-прогредиентным РС, сыворотке и ЦСЖ контрольной группы.

При сравнении уровня pNFh в ЦСЖ исследуемые группы достоверно отличались между собой. Было выявлено повышение уровня нейрофиламентов в ЦСЖ больных с ремиттирующим РС (p=0,015) и у больных боковым амиотрофическим склерозом (p=0,005) при сравнении с контрольной группой, при этом между группами больных ремиттирующим РС и боковым амиотрофическим склерозом не было статистическим достоверных различий. Для получения данных, сопоставимых с результатами ранее проведенных в этой области исследований [19, 25, 44], наши результаты были представлены в процентной доле от контрольных образцов. При сравнении уровня pNFh в сыворотке отличия между теми же группами и группой вторично-прогредиентного РС найдено не было.

При исследовании уровня β-амилоида 1-42 в ЦСЖ больных ремиттирующим РС в момент обострения (14 пациентов) и период ремиссии (5 пациентов) выявлено, что в период обострения концентрация амилоида достоверно возрастает в 2 раза - 157,5 [97,8; 199,7] и 71,8 [19,7; 86,3] пг/мл соответственно (p=0,02).

Полученные данные позволяют предполагать постепенное развитие процесса нейродегенерации в ходе формирования свойственного РС патологического процесса вопреки представлению о ней, как об отдаленном процессе и следствии демиелинизации.