Согласно современным представлениям [1], рассеянный склероз (РС) - хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание ЦНС, возникающее вследствие активации аутореактивных Т-клеток, специфичных против компонентов миелина, что приводит к повреждению миелиновой оболочки, олигодендроцитов и аксонов. РС относится к аутоиммунным заболеваниям, в основе патогенеза которых лежит генетически детерминированное нарушение иммунитета [5]. Развитие аутоиммунных заболеваний связано с нарушением супрессорных механизмов, которые контролируют толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам.

Ключевую роль в механизмах иммуносупрессии играют Т-регуляторные клетки с фенотипом CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ (Т-рег). В норме Т-рег составляют 5-10% от общего числа CD4⁺ T-клеток в периферической крови и лимфоидных тканях. Т-рег созревают в тимусе и на 3-4-й день неонатального развития расселяются в кровь и периферические лимфоидные органы [11]. Т-рег играют важную роль в развитии различных типов иммунного ответа, включая иммунитет к аутоантигенам, трансплантатам, аллергенам, опухолям и инфекциям [2].

У больных аутоиммунными заболеваниями выявлено значительное снижение содержания Т-рег и нарушение их функции. Дефект Т-рег показан у больных системной красной волчанкой, сахарным диабетом 1-го типа, болезнью Крона, псориазом, ревматоидным артритом [3, 8].

Проведенные в настоящее время исследования показали, что имеется возможность увеличить количество Т-рег, выделенных из крови пациента, культивированием их в условиях ex vivo [13]. При этом полученные культивированием Т-рег высокостабильны, долго живущи, обладают супреcсорными свойствами, неспецифичны и неиммуногенны, и введение этих клеток пациенту с целью восстановления Т-рег в крови больного до уровня нормы может стать инструментом коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях [9, 14].

Проведены пилотные испытания по введению аутологичных культивированных Т-рег больным системной красной волчанкой [8], диабетом 1-го типа [6], пациентам с реакцией трансплантант-против-хозяина после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [10]. При этом получено достоверное увеличение количества Т-рег в периферической крови этих больных, которое коррелировало с улучшением клинических показателей и не вызывало побочных реакций у больных.

Установлено, что Т-рег играют определенную роль в нарушении регуляторных механизмов в аутоиммунитете, приводящем к развитию и прогрессированию РС. В то же время результаты исследований количества и функциональной активности Т-рег при РС отличаются значительной разноречивостью, что обусловлено недостаточностью сопоставлений количества и функциональной активности Т-рег с клинической картиной заболевания. Помимо этого, в настоящее время имеются лишь единичные описания результатов культивирования Т-рег больных РС, а попыток использования Т-рег в терапевтических целях при этом заболевании не проводилось.

Цель настоящего исследования - определение количества Т-рег при РС.

Обследовали 50 больных с достоверным диагнозом РС; 19 пациентов из этой группы изучены в динамике как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии; 10 больным РС проведено исследование функциональной активности Т-рег в смешанной культуре лимфоцитов.

Выращено 5 клеточных линий CD4⁺ Т-клеток 5 больных РС и 3 здоровых доноров для индукции ex vivo (культивирования) Т-рег; выращенные Т-рег подкожно были введены 5 больным РС.

У больных была детально изучена клиническая картина заболевания с использованием данных анамнеза, неврологического и соматического статуса, проведена магнитно-резонансная томография (МРТ) головного и/или спинного мозга. Все 50 пациентов, включенных в исследование, имели достоверный диагноз ремиттирующего РС согласно диагностическим критериям С. Poser (1998) и W. McDonald (2005).

В стадии ремиссии находился 31 человек, в стадии обострения - 19 человек. Среди обследованных преобладали женщины в соотношении 1:2,3. Возраст больных варьировал от 19 до 56 лет. Тяжесть неврологического дефицита оценивали с использованием расширенной шкалы инвалидизации EDSS (The Expanded Disability Status Scale), которая у больных в стадии обострения РС находилась в пределах от 1,0 до 5,0 балла, в стадии ремиссии РС - от 1,0 до 2,5 балла. У 19 больных были взяты образцы крови в динамике, т.е. как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания. До забора крови для определения иммунофенотипического состава крови этим больным были проведены неврологический осмотр, при котором выявлено нарастание или появление новой неврологической симптоматики, и МРТ головного и/или спинного мозга, позволяющая выявить активные очаги демиелинизации. После выявления обострения аутоиммунного процесса больным проводилась пульс-терапия метилпреднизолоном (суммарная доза 3000-5000 мг). Повторное взятие крови осуществлялось спустя не менее 4 нед после окончания гормональной терапии. У пациентов, изученных в динамике в стадии обострения и в стадии ремиссии, средний возраст составил 34,9±9,76 года (от 25 до 56 лет), балл по шкале EDSS находился в пределах от 1,5 до 5,0, в стадии ремиссии степень выраженности неврологического дефицита у этих больных составила 1,55±0,57 [1,0;3,0] балла.

У всех 50 больных была проведена оценка периода от момента постановки диагноза РС до начала исследования. В целом по группе длительность РС варьировала от 3 до 207 мес. Выделено 2 группы больных по длительности течения РС. 1-ю группу составили 28 больных, страдающих РС менее 36 мес, 2-ю - 22 больных, страдающих РС более 36 мес. При этом средняя длительность заболевания в первой и второй группах была равна 15,29 ±11,12 (от 3 до 35) и 110,5±51,17 (от 44 до 208) мес соответственно. В качестве контрольной группы исследован иммунофенотип крови 21 здорового, соответствующих больным по возрастному и половому составу.

Определение функциональной активности Т-рег проведено 10 больным РС, 7 женщинам и 3 мужчинам, из них 7 пациентов находились в стадии обострения и 3 - в стадии ремиссии. Возраст этих больных РС варьировал от 24 до 39 лет. Группа больных РС, у которых были взяты образцы крови для культивирования аутологичных Т-рег и последующего их подкожного введения, состояла из 5 человек, 4 женщин и 1 мужчины, возраст пациентов был от 26 до 37 лет, средний балл по шкале EDSS - 2,9 [2,5±3,0].

Все измерения проводились на проточном цитометре FACS Calibur(tm) («BD Biosciences»). Для оценки количества клеток CD3⁺, CD8⁺, CD4⁺, CD4⁺, CD25⁺, CD19⁺, CD16⁺, CD56⁺ в мононуклеарной фракции клеточную суспензию окрашивали соответствующими антителами. Оценка экспрессии поверхностных маркеров проводилась в соответствии с протоколом, разработанным производителем набора антител BD Multitest IMK Kit(tm) («BD Biosciences», США). Процентное содержание позитивных по специфическим маркерам клеток подсчитывалось при помощи программного обеспечения MACSQuantify(tm) («Miltenyi Biotec GmbH», Германия). Выделение Т-рег из периферической крови больных РС осуществлялось инкубацией Т-рег с PE-мечеными анти-человеческими антителами к FoxP3, клон PCH101 («BD Biosciences», США).

Метод определения функциональной активности Т-рег включал забор 40 мл периферической крови у испытуемого, выделение субпопуляций регуляторных и эффекторных Т-лимфоцитов и АПК донора, окраску эффекторных Т-лимфоцитов витальным красителем карбоксифлуоресцеин-сукцинимидиловым эфиром (Carboxyfluorescein succinimidyl ester - CFSE) и пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов (mixed lymphocyte reaction - MLR), которая оценивается по редукции внутриклеточного красителя CFSE методом проточной цитометрии.

Для культивирования Т-рег применяли среду RPMI-1640, содержащую феноловый красный, L-глутамин и 25мМ HEPES («Gibco», Великобритания) c добавлением 5-10% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллин-стрептомицина («Gibco», Великобритания). В культуральную среду добавляли интерлейкин-2 (ИЛ-2, «R&D Systems», Великобритания), мышиные моноклональные антитела к человеческому рецептору CD3 («МедБиоСпектр», РФ) и мышиные моноклональные антитела к человеческому рецептору CD28 («BD Pharmingen», США). Клетки культивировали во флаконах 25 см³ или 75 см³ в CO₂-инкубаторе при 370 °С в атмосфере 5% СО₂. Свежую среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 дня. Время культивирования составляло 5-8 дней. Далее оценивались фенотипические характеристики (экспрессия маркеров) и экспансия (увеличение количества) Т-рег после культивирования с помощью проточной цитометрии и изучалась супрессорная активность нативных и индуцированных ex vivo Т-рег.

На 7-12-й дни культивирования клетки концентрировали, подсчитывали количество живых клеток в гемоцитометре и отмывали центрифугированием в 50 мл конических стерильных пробирках в фосфатном солевом буферном растворе без Са²⁺ и Mg²⁺ в течение 10 мин при 300 g. Осадок разводили в 2-3 мл стерильного физиологического раствора или 6% раствора полиглюкина и сразу набирали в стерильный одноразовый шприц, который помещали в стерильную упаковку и в специальный контейнер для переноса клеток, который незамедлительно транспортировался в Научный центр неврологии РАМН. После доставки в этот центр клетки немедленно вводили пациенту подкожно в область передней брюшной стенки. После введения клеток пациент находился на стационарном лечении в НЦН РАМН в течение 2 нед. В течение последующего года наблюдение за пациентами осуществлялось в амбулаторном порядке, с явкой на осмотр 1 раз в 3 мес.

Статистическую обработку проводили с использованием программы «Statsoft» Statistica 6.0.

Количество Т-рег в крови больных РС составило 1,33 ±0,95%, в то время как у здоровых в среднем определялось 3,43±1,6%, что указывает на достоверно значимое снижение количества этих клеток у больных РС (р<0,005).

Обследована группа больных и в ремиссии, и в стадии обострения РС. В среднем у больных, включенных в исследование, число Т-рег в стадии обострения составило 0,9±0,56%, а в стадии ремиссии увеличивалось до 2,21±1,72%. Этот результат приближается к показателям здоровых, но несмотря на это, сохраняется статистически значимое снижение количества Т-рег у больных РС (р<0,005).

Далее мы провели сопоставление между показателями тяжести заболевания и уровнем Т-рег в крови больных РС. Результаты продемонстрировали очевидную обратную зависимость (r=–0,717) между количеством Т-рег и степенью неврологического дефицита по шкале EDSS. Данная корреляционная зависимость свидетельствует о том, что нарастание выраженности неврологической симптоматики сопровождается повышением активности аутореактивных Т-клеток и, как следствие этого, снижением количества Т-рег.

Корреляционный анализ между длительностью заболевания и количественным содержанием Т-рег также выявил обратную зависимость (r=–0,647), свидетельствующую о том, что чем больше длительность заболевания, тем ниже количество Т-рег. Установлено, что у лиц, страдающих РС меньше 36 мес, количество Т-рег составило 1,97±0,9%, в то время как у пациентов, страдающих РС более 36 мес, - 0,73±0,4% (р<0,05).

Следующим этапом нашего исследования явилась оценка супрессорной активности, выраженная в способности Т-рег подавлять эффекторные функции CD4⁺ - Т-клеток (в тесте смешанной культуры лимфоцитов) у больных РС на разных стадиях. В результате получено, что супрессорная активность Т-рег у больных в стадии ремиссии составляет 55,94±7,76%, в стадии обострения - 65,20±4,92%, в то время как у здоровых она равна 86,92±4,41%. Таким образом, наблюдается достоверное снижение функциональной активности Т-рег у больных РС как в стадии обострения (р<0,05), так и в стадии ремиссии (р<0,05) по сравнению с группой здоровых. Статистически значимого отличия супрессорной фунуции Т-рег на разных стадиях аутоиммунного процесса при РС не получено.

В результате культивирования CD4⁺ Т-клеток больных получено увеличение количества регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ в десятки раз (95,08±41,80 [49,22;149,5%]). С целью изучения супрессорной активности Т-рег после экспансии мы сравнили способность культивированных и нативных Т-рег ингибировать пролиферацию клеток-мишений (CD4⁺) в смешанной культуре лимфоцитов. Установлено, что у больных РС супрессорная активность нативных (53,04±4,03 [48,2;56,8%]) и культивированных Т-рег (55,04±4,66 [50,20;60,10%]) достоверно не отличалась (р=0,94). На основании полученных результатов мы предположили, что введение аутологичных (собственных) Т-рег больным РС с целью восстановления количества этих клеток до уровня нормы может использоваться в качестве способа коррекции иммунных нарушений при этом заболевании.

Нами однократно проведено введение культивированных аутологичных Т-рег 5 больным РС. После введения выращенных ex vivo аутологичных Т-рег у всех больных РС через 2 нед выявлено увеличение содержания этих клеток в периферической крови в среднем с 0,6±0,14 [0,4;0,8%] до 1,4±0,44 [1,1;1,9%], (p=0,009).

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что в крови больных РС более чем в 2 раза снижено количество Т-рег по сравнению с группой здоровых лиц. Функциональная активность Т-рег, выделенных из периферической крови больных, также существенно снижена. Наши результаты подтверждают данные других авторов [12, 15], но при этом целый ряд исследователей [4, 7, 16] считают, что у больных РС нарушена только функция, но не количественное содержание Т-рег. Однако перечисленные выше авторы приводят данные анализа Т-рег без учета стадии, степени тяжести и длительности РС. Напротив, наши данные получены у группы больных, обследованных как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии. В результате показано, что в стадии обострения количество Т-рег значительно снижено, тогда как в стадии ремиссии их содержание увеличивается. По данным K. Venken [15], уменьшение количества и функциональной активности Т-рег связано со снижением уровня экспрессии гена Foxp3, в стадии же ремиссии этот уровень увеличивается и происходит активация и увеличение числа Т-рег, и, как следствие этого, подавление пролиферации CD4⁺ и CD8⁺ - Т-клеток.

Нами впервые установлена значимая корреляция между низким количеством Т-рег и степенью тяжести РС. Вероятно, это связано с активацией патологического процесса и срывом механизмов иммунологической толерантности, обеспечивающихся Т-рег. Это, в свою очередь, приводит к большей распространенности воспалительного процесса в ЦНС и проявляется нарастанием неврологического дефицита у пациентов.

Отмечено, что чем больше времени прошло от начала заболевания, тем ниже уровень Т-рег. Снижение уровня и функции Т-рег у больных РС отражает активацию аутоиммунного процесса в обострении болезни вследствие нарушения баланса между аутоагрессивными Т-клетками и Т-рег [17]. По нашему мнению, увеличение длительности аутоиммунного процесса при РС и, соответственно, наличие у пациентов большего количества обострений за всю историю заболевания приводят к истощению регуляторных механизмов и к количественному и функциональному дефициту Т-рег у данной категории больных.

Таким образом, полученные нами данные показывают снижение количества и функциональной активности Т-рег у больных РС на разных стадиях аутоиммунного процесса при РС, что имеет непосредственную связь с тяжестью демиелинизирующего процесса и его длительностью. Выявленное увеличение содержания Т-рег у больных РС в стадии ремиссии свидетельствует о том, что Т-рег играют роль в поддержании иммунологической толерантности при РС. Исходя из этого, проведенное исследование количества Т-рег в крови больных РС и определение их супрессорной активности может служить дополнительным лабораторным тестом определения степени активности патологического процесса при РС.

Следует также отметить, что при культивировании Т-рег установлено, что выращенные ex vivo Т-рег по фенотипическим и функциональным характеристикам полностью идентичны нативным Т-рег, выделенным из периферической крови больного, и их количество после экспансии возрастает в десятки раз.

В результате проведенного пилотного исследования получено достоверное увеличение содержания Т-рег в крови больных РС после подкожного введения культивированных аутологичных Т-рег, что свидетельствует о возможности миграции этих клеток в кровь. Причем у пациентов не наблюдалось никаких побочных реакций в ответ на инъекцию выращенных ex vivo Т-рег как в первые дни, так и в течение последующих 12 мес наблюдения, что указывает на безопасность и потенциальную возможность применения культивированных аутологичных Т-рег в клинике для коррекции иммунных нарушений у больных РС.