Нейрогенные стволовые клетки (НСК) интенсивно изучаются в качестве терапевтического инструмента для стимуляции репаративных процессов в мозге после инсульта. В экспериментальных исследованиях на моделях инсульта у животных показано, что применение НСК из различных источников, в различные сроки и при разнообразных путях введения способствует улучшению функциональных показателей ЦНС [1]. Результаты клинических исследований тем не менее не позволяют однозначно судить об эффективности этого метода лечения [2, 3]. К настоящему времени не сформировано единого представления о том, какие стратегии клеточной терапии инсульта имеют перспективы клинического применения. Предполагается, что преимущества использования НСК могут быть связаны с участием этих клеток в процессах ремоделирования нейрональных сетей, ответственных за реализацию определенных функций ЦНС [3]. Однако задача доказательства непосредственного влияния клеточной терапии на восстановление отдельных функций ЦНС еще не решена, хотя экспериментальные возможности для этого есть. В частности, при исследованиях нейрорепаративных свойств лекарственных средств используют модели повреждения отдельных полей коры мозга, вызывающих дефицит специфических функций ЦНС, например моторики передней лапы. В ряде таких работ показано, что процесс восстановления моторики передней конечности связан с пластическими изменениями нейрональных сетей в периинфарктной зоне коры [4-7]. Имеются лишь единичные исследования влияния трансплантаций НСК при экспериментальном повреждении «парциальных» функций ЦНС [8-10]. Остаются нерешенными вопросы безопасности и специфичности действия таких клеточных препаратов. Определенными преимуществами обладают НСК обонятельной выстилки человека (НСКовч), представляющие собой прямые предшественники нейронов. НСКовч можно заблаговременно получать у родителей пациента методами малоинвазивной интраназальной биопсии и затем наращивать эти клетки в достаточном количестве для последующей трансплантации [11].

Цель настоящего исследования заключалась в оценке эффективности трансплантации аллогенных и ксеногенных НСК на восстановление функций передней лапы у крыс с локальным инсультом в сенсомоторной зоне коры головного мозга. При этом необходимо было сравнить влияние на репаративные процессы стволовых (прогениторных клеток) и препаратов дифференцированных фибробластов, т.е. клеток без прогениторных свойств.

Эксперимент проведен на 62 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 300-350 г. Животные содержались в клетках Tecniplast (Италия) по 5 шт. в условиях с естественным световым циклом и свободным доступом к воде и пище. Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с действующими этическими требованиями, с соблюдением правил гуманного обращения с лабораторными животными.

Общая схема эксперимента включала: 1) обучение крыс и анализ базового уровня выполнения цилиндр-теста, плавания и вибрисс-теста, определение функциональной асимметрии передних лап в тесте доставания пищи, отбор животных для эксперимента (49 крыс); 2) моделирование ишемического инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга (38 крыс); 3) трансплантацию клеточных препаратов (26 крыс): НСКовч (7), эмбриональной нервной ткани крыс (ЭНТкр, 7 крыс) и фибробластов крысы (Фкр) - в качестве клеточного контроля (12); 4) мониторинг функций ЦНС; 5) морфологические исследования: оценку ишемического повреждения и организации нервной ткани через 4, 16 и 30 сут после моделирования инсульта (6 крыс); определение объема дефицита нервной ткани через 8 нед после моделирования инсульта (38 крыс); исследование жизнеспособности клеточных препаратов через 4, 16 и 30 сут после трансплантации (18 крыс).

Перед проведением хирургических манипуляций для определения доминантности полушария мозга использовали тест на захват пищи передней лапой через отверстие в клетке по ранее описанной методике [12]. В случае, если крыса пользовалась одной лапой более чем в 29 попытках из 50, ее относили к особям, характеризующимся доминантностью соответствующего контралатерального полушария головного мозга [13]. Крыс, захватывающих корм одной из лап в 22-28 попытках из 50, относили к амбидекстрам и в дальнейших экспериментах не использовали.

Неврологическое тестирование проводили с помощью цилиндр-теста, плавания и вибрисс-теста по описанной ранее методике [12]. В цилиндр-тесте определяли активность лапы, контралатеральной повреждению мозга, в исследовании вертикальных поверхностей прозрачного цилиндра по формуле: активность лапы (правой или левой) = количество касаний лапой (правой или левой)/ количество касаний правой лапой + количество касаний левой лапой × 100%.

В тесте плавания оценивали активность включения передних лап в процессе прямолинейного плавания, в баллах: 0 баллов - крыса совершает активные гребки лапой, контралатеральной повреждению мозга (другая лапа не совершает гребков); 1 - крыса активно гребет одной лапой, однако кратковременно способна удержать лапу в неподвижном положении; 2 - лапа удерживается в неподвижном положении, но совершает 1-2 гребка за дистанцию; 3 - крыса проплывает дистанцию, не совершая гребков, в следующих попытках при легком удерживании крысы во время плавания животное совершает активные гребки одной лапой; 4 - крыса не использует передние лапы для гребли как при свободном плавании, так и при легком удерживании в процессе плавания [12].

В вибрисс-тесте оценивали реакцию поиска опоры лапой в ответ на раздражение вибриссов, в баллах: 0 баллов - крыса не тянется лапой к столу в ответ на стимуляцию вибриссов в течение 5 с; 0,5 - крыса ставит лапу, но после раздражения вибриссов в течение более 3 с, или животное тянется лапой, но не касается стола; 1 - нормальное выполнение теста. Учитывали общее количество баллов в 10 сеансах тестирования с каждой стороны.

Клеточные препараты ЭНТкр и НСКовч получали согласно описанным ранее методикам [14, 15]. В качестве клеточного контроля использовали линию фибробластов крысы Rat2. Фибробласты идентифицировали по способности поглощать коллагеновые наночастицы (Collagen nanoparticles, Invitrogen). Для фенотипической идентификации культур ЭНТкр, НСКовч клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида на фосфатном буфере (ФБ, 0,05 М) 30 мин при 4°С. После промывки в ФБ культуры инкубировали в течение 24 ч при 4оС с первичными моноклональными антителами к β-III-тубулину (1:300; «Chemicon»), нестину (1:100; «Chemicon»), О4 (1:500; «Chemicon»), нейрофиламенту-200 (1:300; «Chemicon»), GFAP (1:500; собственного производства). Затем культуры промывали ФБ и последовательно обрабатывали вторичными антимышиными или антикроличьими антителами (1:200; «Chemicon»), коньюгированными с флюоресцентными метками Alexa 488, Alexa 543 или флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Ядра докрашивали 4’,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) 1:1000. Полученные препараты исследовали и фотографировали на флуоресцентном микроскопе Leica DLMB. По данным иммуногистохимического анализа, клеточный препарат ЭНТкр состоит из нестин-положительных клеток (до 95%), небольшое количество клеток (около 5%) экспрессируют маркер астроцитов GFAP, единичные клетки экспрессируют маркер нейронов нейрофиламент-200. Клеточный препарат НСКовч, полученный диссоциацией нейросфер, до 90% состоит из нестин-положительных клеток, около 60% β-III-тубулин-положительных клеток, около 4% клеток экспрессировали маркер астроцитов GFAP, отдельные клетки (не более 2%) экспрессировали маркер олигодендроцитов О4 или нейрофиламент-200 - специфичный маркер нейронов.

Клеточные препараты готовили непосредственно перед процедурой трансплантации. Жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева по реакции вытеснения трипанового синего, которая составляла не менее 90%. Затем готовили суспензию в концентрации 1 млн клеток в 12 мкл раствора PBS.

Моделирование ишемического инсульта в сенсомоторной зоне коркового представительства передней лапы проводили по методу В. Kolb и соавт. [16]. Операцию осуществляли на полушарии, контралатеральном лапе, которую крысы использовали для захвата пищи (см. ниже). Крыс наркотизировали (кетамин 120 мг/кг и диазепам 5 мг/кг внутрибрюшинно), выполняли краниотомию по координатам +4; –5 мм от брегмы и 1,5; 4,5 мм слева или справа от средней линии. Прямоугольный костный фрагмент удаляли. По периметру костного окна вскрывали твердую и паутинную мозговые оболочки u-образно, оставляя нетронутой латеральную сторону. Образовавшийся лоскут отгибали свободным концом кнаружи. Далее удаляли мягкую мозговую оболочку с сосудами, питающими кору мозга, с помощью стерильного ватного тампона, смоченного физиологическим раствором. После тщательного гемостаза оставшийся лоскут твердой мозговой оболочки возвращали на прежнее место и рану ушивали. Антибиотики не использовали.

Трансплантацию клеточных суспензий проводили сразу после моделирования ишемии на границе зоны удаления сосудов коры мозга в 2 точки: +3 мм и –4 мм от брегмы, латерально от срединного шва 2,7 мм и в глубину 2,2 мм от поверхности мозга. Введение клеток проводилось с помощью шприца со стальной иглой диаметром 0,6 мм, соединенного с микропомпой («Stoelting Co.», США), закрепленного в микроманипуляторе стереотаксического аппарата («Narishige», Япония). Скорость введения и выведения иглы – 10 мкм/с. Скорость введения клеточных препаратов - 1 мкл/мин. Выведение иглы начинали через 5 мин после окончания введения препаратов.

Анализ морфологических изменений мозга осуществляли через 4, 16, 30 и 56 сут после моделирования инсульта. Животных глубоко наркотизировали (кетамин 200 мг/кг внутрибрюшинно). Перфузию мозга выполняли трансаортально 150 мл раствора ФБ с pH 7,4, после чего вводили 600 мл 4% нейтрального фиксирующего раствора параформальдегида, охлажденного до 4°С. Крыс декапитировали, головной мозг извлекали, помещали на 24 ч в тот же фиксирующий раствор, после чего готовили замороженные серийные коронарные срезы толщиной 80 мкм. Срезы окрашивали по методу Ниссля. Все окрашенные коронарные серийные срезы снимали на камеру, подключенную к стереомикроскопу («Olimpus», Япония), под увеличением ×8. Оцифрованное изображение передавалось на монитор персонального компьютера, где средствами программы Adobe Photoshop 8.0 («Adobe Systems», США) выделяли контуры неокортекса. Площадь измеряли в пикселях, затем пересчитывали в мм².

Для расчета размеров постинсультного дефицита нервной ткани отбирали 12 коронарных срезов мозга между 4,7 мм и –5,3 мм относительно брегмы. Постинсультный дефицит нервной ткани вычисляли по формуле:

D = 0,8 ((S_здор– S_повр)1+…(S_здор–S_повр)₁₂),

где D - дефицит нервной ткани; 0,8 - расстояние между срезами (мм); S_здор - площадь неокортекса здорового полушария (мм²) на каждом срезе мозга; S_повр - площадь неокортекса поврежденного полушария (мм²) на каждом срезе мозга.

Отдельная часть работы была посвящена исследованию жизнеспособности клеточных препаратов in vivo. Для этого перед трансплантацией клетки метили витальным красителем СFDA SE (карбоксифлуоресцеин-диацетат сукцинимидный эфир, «Invitrogen», США). Окраску проводили непосредственно перед процедурой трансплантации. Клетки инкубировали с 15мМ раствором СFDA в диметилсульфоксиде (1:100) на 0,1 М PBS в течение 15 мин при 37°С, после чего раствор красителя заменяли на среду DMEM и выдерживали 30 мин в инкубаторе при 37°С. Клетки ресуспендировали, определяли их жизнеспособность в камере Горяева по реакции вытеснения трипанового синего, которая составляла не менее 90%. Готовили клеточную суспензию для трансплантации, которая также содержала 1 млн клеток в 12 мкл раствора PBS.

Забор материала для визуализации трансплантированных клеток производили через 4, 16 и 30 сут. После перфузии наркотизированных животных 4% раствором параформальдегида в PBS выделяли головной мозг вместе с оболочками и помещали в тот же фиксирующий раствор на 24 ч, затем в 30% раствор сахарозы на 24 ч. На замораживающем микротоме готовили серийные срезы толщиной 40 мкм, которые монтировали на предметных стеклах («SuperFrost», Канада) наносили каплю 50% водного раствора глицерина и закрывали покровными стеклами.

С помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMLB визуализировали введенные ранее клетки, меченые CFDA-SE, по характерному ярко-зеленому свечению (пик эмиссии 517 нм, пик возбуждения 492 нм) и отсутствию свечения в других цветовых диапазонах.

Для статистического анализа различий показателей функциональных тестов между группами применялся непараметрический тест Краскала-Уоллиса для множественных сравнений с достоверностью 95%. Анализ различий массы крыс и размеров атрофии коры мозга проводился с помощью однофакторного параметрического анализа Шеффе с достоверностью 95%.

Из 49 крыс, подвергнутых обучению и тестированию, было исключено из эксперимента 7 животных: 3 крысы имели односторонний неврологический дефицит в вибрисс-тесте (<9 баллов); у 2 крыс отмечался неврологический дефицит в цилиндр-тесте (активность передней лапы <43,4%, т.е. меньше нижней границы 95% доверительного интервала для нормальных значений показателя); 2 крысы использовали передние лапы для гребли в тесте плавания.

Исследование асимметрии передних лап в тесте доставания пищи показало, что из отобранных 42 крыс 13 (31%) являются правшами, 24 (57%) - левшами и 5 (12%) - амбидекстрами. Остальным животным инсульт моделировали на соответствующем контралатеральном полушарии. Все крысы, не вошедшие в группы мониторинга функций ЦНС, использованы для исследований жизнеспособности трансплантатов.

Прирост массы тела животных в течение 8 нед мониторинга в экспериментальных группах был одинаковым. Он составил в группе с инсультом без клеточной терапии, с трансплантацией Фкр, ЭНТкр и НСКовч 118±12, 116±15, 122±9 и 126±14 г соответственно (р<0,01). Гибели крыс в течение эксперимента не было.

Морфологические исследования выявили картину острого ишемического повреждения нервной ткани с последующей организацией очага инфаркта.

На 4-е сутки на коронарных срезах мозга, окрашенных по Нисслю, в зоне удаления мягкой мозговой оболочки визуализировались деструкция тел нейронов и глиальных клеток, дефрагментация хроматина. В периинфарктной зоне в пределах приблизительно 800 мкм от области инфаркта определялся цитоплазматический отек, гиперхромная окраска ядер клеток и гиперхромия цитоплазмы клеток пирамидного слоя (рис. 1, А).

Через 16 сут зона инфаркта четко ограничена астроглиальным валом, определяются единичные клетки с гиперхромными ядрами в периинфарктной зоне (см. рис. 1, Б).

Через 30 сут и через 8 нед визуализируется четко организованная киста, окруженная астроглиальным валом, деформация окружающих структур мозга и увеличение бокового желудочка (см. рис. 1, В).

Размеры постинсультной атрофии коры мозга, рассчитанные через 8 нед после операции, существенно не различались у крыс с инсультом без клеточной терапии, с трансплантацией фибробластов, ЭНТкр и НСКовч. Атрофия неокортекса составила 36,8±7,2; 37,3±11,6; 33,4±8,1 и 36,2±12,2 мм³ соответственно.

У животных, перенесших трансплантацию клеток, меченных витальным красителем CFDA SE, через 4 и 16 сут клетки обнаружены в паренхиме мозга вблизи инъекционного трека. На 16-е сутки часть меченых ЭНТкр и НСКовч формировали сеть отростков, что свидетельствует о жизнеспособности клеток и признаках их дифференцировки (рис. 2).

Результаты мониторинга функций ЦНС (моторики передних лап) приведены в табл. 1.

Функциональные показатели у крыс, которым проводилась трансплантация фибробластов (клеточный контроль), не отличались от соответствующих уровней у животных с инсультом, не получавших клеточную терапию (p<0,05). Трансплантация ЭНТкр позитивно повлияла на выполнение крысами цилиндр-теста и теста плавания. Показатели этих тестов достоверно превышали контрольные на протяжении практически всего периода наблюдения (p<0,05). При этом уровень функционального восстановления приближался к дооперационному. В вибрисс-тесте подобных отличий не отмечалось.

Эффективность клеточной терапии, рассчитанная как относительное изменение показателей функциональных тестов по сравнению с группой крыс, получавших фибробласты, к 8-й неделе составила 14-25% (табл. 2).

В настоящем исследовании в остром периоде ишемического инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга крыс трансплантировали клеточные препараты ЭНТкр, НСКовч и Фкр в периинфарктные области коры. Анализировали жизнеспособность клеток после трансплантации, размеры повреждения нервной ткани коры мозга и динамику восстановления моторики передней лапы.

Данные литературы [16] свидетельствуют о том, что нейрональные прогениторные клетки обнаруживаются в периинфарктных областях мозга пациентов, перенесших ишемический инсульт, в экспериментальных исследованиях у животных продемонстрированы феномены позитивного влияния этих клеток на течение репаративных процессов в мозге. Предложены различные стратегии клеточной терапии: трансплантация в стриатум и кору поврежденного полушария, стриатум противоположного полушария, боковые желудочки, внутривенное и внутриартериальное введение нейрогенных клеток в различные сроки после моделирования ишемии [1]. Такое разнообразие терапевтических подходов тем не менее не выявило отчетливой связи функционального эффекта с путем введения стволовых клеток или присутствием трансплантата в той или иной области мозга. При этом из-за отсутствия клеточного контроля в подавляющем большинстве исследований невозможно было судить, обусловлен ли эффект именно нейрогенными свойствами клеточного препарата. При этом регистрация отдельных феноменов, таких как миграция клеток трансплантата и экспрессия тех или иных дифференцировочных маркеров, не может служить адекватным объяснением механизма восстановления функций ЦНС. В связи с этим для оценки эффекта нейрогенных клеток в настоящем исследовании использовалась модель инсульта в сенсомоторной коре, позволяющая воспроизводить изолированные нарушения моторики контралатеральной передней лапы и клеточный контроль, не обладающий нейрогенными свойствами - Фкр.

Мы трансплантировали клетки в кору мозга на границе зоны удаления сосудов сразу после моделирования инсульта. Хотя в ряде исследований [18, 19] было показано, что ишемия и воспаление отрицательно сказываются на состоянии стволовых клеток, в других исследованиях [20, 21] был продемонстрирован противовоспалительный эффект нейрогенных клеток, а также их жизнеспособность после трансплантации в периинфарктную область [8, 10, 22]. В нашем исследовании клетки были жизнеспособны после трансплантации по меньшей мере в течение 16 сут. Через 30 сут меченые клетки в мозге не визуализировались, что может быть связано со снижением содержания красителя в клетках (например, распределением красителя при их делении), либо с гибелью трансплантата. При анализе срезов мозга, окрашенных по Нисслю, выполненных через 8 нед, трансплантат также не визуализировался. Крысы в проведенном исследовании не получали иммуносупрессивную терапию, и гибель трансплантата нельзя исключить, особенно в свете недавно опубликованных данных о развитии иммунного ответа на аллогенные НСК, приводящего почти к полной элиминации трансплантата в течение 2 мес [9]. Развитие иммунного ответа также может объяснять отсутствие эффекта ксеногенных НСКовч. Трансплантация фибробластов, т.е. клеток без прогениторных свойств, на восстановление после инсульта существенно не повлияла. Вместе с тем у крыс, получавших ЭНТкр (прогениторные клетки), выявлено уменьшение функционального дефицита в цилиндр-тесте и тесте плавания.

Уровень функционального восстановления в исследованиях с применением стволовых клеток на моделях инсульта ряд авторов [8, 23-26] расценивают как умеренный. По 18-балльной шкале, применяемой для интегральной оценки неврологического дефицита в моделях корково-подкоркового инсульта (вследствие окклюзии средней мозговой артерии), восстановление функций после клеточной терапии по сравнению с контролем (без введения клеток) достигало 1,5-3 баллов [23, 24, 27-29]. В другом исследовании [30] приведены относительные уровни восстановления функций ЦНС у крыс с инсультом после внутривенного введения клеток пуповинной крови, составлявшие 16-22%, по разным тестам. При этом стоит отметить, что клетки пуповинной крови в мозге не обнаруживались и авторы показали, что терапевтический эффект обусловлен выделением клетками пуповинной крови факторов роста.

На моделях коркового инсульта трансплантация в мозг блоков эмбриональной нервной ткани или суспензий нейрогенных клеток оказывала ограниченный или временный эффект [8, 31, 32] или позитивные изменения наблюдались только в условиях обогащенного окружения [10, 33]. Таким образом, полученные нами результаты, показавшие отсутствие эффекта НСКовч и ограниченный эффект ЭНТкр, не превышающий 25%, соответствуют данным других авторов.

Механизмы положительного влияния трансплантации нейрогенных клеток на восстановление функций ЦНС недостаточно ясны. У крыс, которым пересаживали блоки эмбриональной нервной ткани, было продемонстрировано формирование связей трансплантата с ипсилатеральной и контралатеральной корой, таламусом и подкорковыми ганглиями [34]. Сенсорная стимуляция повышала метаболическую активность трансплантата, свидетельствуя о наличии функциональных связей [35]. В исследованиях с использованием клеточных суспензий, содержащих нейрогенные клетки, наличие таких связей не было убедительно показано [36], тем не менее отмечалось функциональное восстановление, и этот эффект авторы, как правило, объясняли нейрональной дифференцировкой и миграцией клеток трансплантата.

Выраженные положительные изменения моторики передней лапы при корковом инсульте наблюдались при внутрижелудочковом введении факторов роста (EGF и EPO) [16]. Эти факторы стимулировали миграцию клеток-предшественников из субвентрикулярной зоны в область инфаркта, где клетки дифференцировались в нейроны и астроциты и заполняли всю область повреждения. Для того чтобы оценить функциональное значение нейрогенеза, авторы удалили регенерировавшие участки коры мозга. Через 1 нед после операции моторика передней лапы крыс не изменилась. Однако через 2 нед у животных наблюдался практически полный регресс положительных изменений неврологических функций, достигнутый терапией факторами роста. Полученные результаты свидетельствуют не в пользу участия нейрогенных клеток в формировании функциональных нейрональных ансамблей, а, скорее, демонстрируют трофическую роль нейрогенеза в периинфарктных зонах мозга. Раннее обнаружение положительных изменений функций ЦНС после трансплантации нейрогенных клеток (в нашем исследовании - на 1-2-й неделях) также не является аргументом в пользу полноценной дифференцировки и встраивания клеток трансплантата в нейрональные сети.

Для исследования возможного нейропротективного эффекта клеточной терапии был проведен морфологический анализ срезов мозга через 8 нед после моделирования инсульта. Трансплантация клеточных препаратов существенно не повлияла на размеры атрофии коры, хотя в группе с введением ЭНТкр этот показатель был несколько ниже. В исследовании [33] с трансплантацией блоков эмбриональной коры крысам с корковым инсультом также не было выявлено существенных изменений атрофии коры, хотя при содержании крыс в условиях обогащенного окружения клеточная терапия способствовала уменьшению атрофии таламуса. Это свидетельствует о том, что нейропротективный эффект клеточной трансплантации не очевиден, и не исключено, что для его реализации требуются определенные условия (обогащенное окружение?).

В целом полученные данные и использованные методы оценки моторики лапы представляются перспективными для исследования механизмов эффекта клеточной терапии в модели ишемического инсульта. Анатомо-функциональная структура сенсо-моторной коры крысы хорошо изучена. Ограниченные размеры инфаркта позволяют выбирать участок трансплантации относительно зоны ишемии, а расположение инфаркта на конвекситальной поверхности мозга удобно для проведения электрофизиологических и допплерометрических исследований. Кроме того, трансплантат вместе с окружающей тканью может быть прецизионно извлечен, что можно использовать, в частности, для оценки содержания трофических факторов в этой зоне - ведущего из предполагаемых механизмов эффекта стволовых клеток.

Таким образом, исследование влияния трансплантации двух препаратов нейральных прогениторных клеток на моторику передней лапы при корковом инсульте выявило стойкий специфический эффект лишь одного из них - ЭНТкр. Использованные методы исследования и полученные результаты открывают возможности для дальнейшего прецизионного исследования механизмов эффекта клеточной терапии - основной задачи на пути к клиническому применению этого метода лечения.