Введение

Стромально-васкулярная фракция (СВФ) жировой ткани представляет собой перспективный клеточный продукт, который можно получить непосредственно в ходе хирургического вмешательства без необходимости длительного культивирования клеток. Известно, что СВФ содержит разнообразные клеточные популяции, включая мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, перициты, клетки эндотелия, такневые макрофаги и лейкоциты, это делает ее универсальным инструментом регенеративной медицины [1, 2]. Применение СВФ ассоциировано с активацией процессов неоангиогенеза, восстановления трофики тканей, модуляции иммунного ответа и воспаления, а также с поддержанием жизнеспособности клеток в местах воспалительных процессов [3, 4]. Основные механизмы действия СВФ связаны с ее паракринной активностью, благодаря которой клетки секретируют ключевые факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и трансформирующий фактор роста β (TGF-β). Эти молекулы играют важную роль в заживлении ран, ангиогенезе и ремоделировании тканей, а наличие в составе СВФ клеток-мишеней для указанных цитокинов обусловливает ее эффективность и объясняет перспективность для использования в регенеративной медицине и хирургии [5].

СВФ нашла широкое применение в различных областях медицины, включая травматологию, ортопедию, урологию, гинекологию, кардиологию и пластическую хирургию [6]. Благодаря своей способности стимулировать процессы регенерации СВФ используется как для местного применения, так и для системного введения, например при лечении хронических ран, ожогов, дегенеративных заболеваний суставов и другой патологии [7—10]. В пластической хирургии СВФ применяется для улучшения приживаемости жировых трансплантатов, а также для регенерации тканей после лучевых повреждений или хирургических вмешательств [11]. В ортопедии и травматологии СВФ эффективно используется для стимуляции регенерации хрящевой и костной ткани при остеоартрозе и других дегенеративных заболеваниях [12].

Однако для широкого клинического применения СВФ необходимы стандартизация и масштабирование процесса ее получения. Текущие методы выделения СВФ из жировой ткани часто связаны с вариабельностью результатов, что обусловлено различиями в условиях проведения процедур, используемыми материалами и оборудованием [13, 14]. Нестандартизированные методы затрудняют воспроизводимость, что ограничивает возможности клинического использования СВФ [15]. Таким образом, разработка стандартизированных и масштабируемых методов выделения СВФ является ключевым шагом к ее интеграции в рутинную клиническую практику.

Настоящее исследование направлено на разработку стандартизированной и масштабируемой методики получения СВФ из жировой ткани. Такая методика должна обеспечивать высокую воспроизводимость результатов, соответствовать требованиям безопасности и быть адаптированной к применению в условиях операционной, что позволит использовать СВФ сразу после забора липоаспирата, минимизируя время между изъятием жировой ткани и введением клеточного продукта пациенту.

Цель исследования — разработать стандартизированную и масштабируемую методику получения СВФ из жировой ткани.

Материал и методы

Фермент коллагеназа

Ключевым компонентом для получения СВФ является протеолитический фермент коллагеназа, который расщепляет волокна соединительной ткани межклеточного матрикса и разрушает мембраны адипоцитов.

В рассматриваемой методике использована коллагеназа на основе штамма Clostridium sporogenes 11, который депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Фермент производился компанией ООО «Обл-Био» (Россия) с удельной активностью 125 КЕ/мг, что обеспечивает высокую эффективность разрушения внеклеточного матрикса для высвобождения ядросодержащих клеток. Материал поставлялся в виде лиофилизированного порошка во флаконах, каждый из которых содержал определенное количество активных единиц, что позволило точно контролировать концентрацию фермента в растворе.

Пробирка для сепарации клеток жировой ткани

Пробирка для сепарации клеток жировой ткани (рисунок) представляет собой изделие, предназначенное для стандартизации процесса выделения СВФ из жировой ткани. Разработка этого устройства направлена на упрощение и стандартизацию процедур сепарации клеток для их дальнейшего клинического применения в регенеративной медицине.

Состав и габаритные размеры пробирки для сепарации клеток жировой ткани.

1 — корпус; 2 — крышка; 3 — колпачок сепаратора; 4 — фильтрующее клеточное сито; 5 — шкала на корпусе.

Пробирка общим объемом 50 мл выполнена из биосовместимого медицинского полипропилена, который обладает высокой прочностью и устойчивостью к химическим воздействиям. Полипропилен широко используется в медицинской технике благодаря своим физико-химическим свойствам, включая биосовместимость, герметичность и устойчивость к стерилизации. Прозрачность пробирки позволяет визуально контролировать процесс выделения клеток в реальном времени.

Корпус пробирки цилиндрический, с коническим сужением на нижнем конце. На верхней части корпуса имеется резьба для герметичного закрытия пробирки крышкой. В нижней части корпуса пробирки встроено фильтрующее клеточное сито, выполненное из нержавеющей стали, с размером ячеек 100—120 мкм. Нижний колпачок сепаратора объемом 5 мл служит для сбора осажденной СВФ. Этот колпачок снабжен резьбой для герметичного соединения с конической частью корпуса пробирки, что предотвращает утечку биоматериала.

Герметичность конструкции поддерживается при центрифугировании, это позволяет использовать пробирку в стандартных лабораторных центрифугах при ускорении до 400g. В процессе центрифугирования липоаспирата клетки проходят через фильтрующее клеточное сито и оседают в нижнем колпачке. Благодаря своей конструкции колпачок сепаратора позволяет легко извлечь ядросодержащие клетки после фильтрации для дальнейших манипуляций.

Стерилизация

Все компоненты набора для получения СВФ, включая пробирку для сепарации клеток жировой ткани и фермент коллагеназу, должны быть стерильны для обеспечения безопасности и соответствия стандартам клинического применения. Стерилизация фермента осуществлялась радиационным методом. Этот метод является наиболее подходящим для стерилизации лиофилизированных ферментных препаратов, так как обеспечивает полное уничтожение патогенных микроорганизмов без нарушения активности фермента. Радиационная стерилизация проведена с использованием оптимальной дозы облучения 25 кГр с целью обеспечения стерильности и сохранения активности коллагеназы.

Стерилизация пробирки для сепарации клеток жировой ткани выполнена с применением оксида этилена. Этот метод обеспечивает эффективное уничтожение микроорганизмов, не нарушая целостности полимерных материалов, таких как полипропилен, из которого изготовлена пробирка. При этом перед процедурой части пробирки в разомкнутом состоянии упаковывались в индивидуальные герметичные упаковки, предназначенные специально для процесса этиленоксидной стерилизации.

Биоматериал

Материалом для процедуры служила жировая ткань человека в форме липоаспирата, который получен в результате липосакции.

Зона забора жировой ткани определялась хирургом на основании физикального осмотра до проведения манипуляции с учетом индивидуальных анатомических особенностей донора. В зависимости от степени выраженности и распределения жировой ткани забор выполняли в области передней брюшной стенки, боковых поверхностей туловища, поясничной области, ягодиц или внутренней поверхности бедер.

Перед проведением забора жировой ткани операционное поле трижды обрабатывали йодно-спиртовой смесью для соблюдения правил асептики. Для местной анестезии использовали 2% раствор лидокаина, вводимый методом инфильтрации. При наличии у донора аллергии на лидокаин применяли другой анестетик, схожий по фармакологическим свойствам. Выполняли небольшой разрез или прокол анестезированной кожи (не более 0,5 см). Далее через этот разрез в подкожное пространство вводили раствор Кляйна. Через 15 мин после введения раствора Кляйна в подкожное пространство вводили отсасывающую канюлю диаметром 3 мм, с помощью которой жировую ткань аспирировали в шприц объемом 60 мл. Общий объем аспирированной жировой ткани составлял 100 мл. Жировую ткань после забора тщательно осматривали для оценки пригодности к дальнейшей обработке. По завершении процедуры канюлю извлекали и на место разреза накладывали асептическую повязку. Весь процесс забора жировой ткани занимал около 30 мин.

Источником материала была жировая ткань пациентов, проходивших процедуру эстетической липосакции в Научно-клиническом центре №2 ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского». Полученный в результате выполнения шприцевой липосакции материал обычно утилизируют как медицинский отход класса Б.

В соответствии с задачами нашего исследования разработана форма информированного добровольного согласия пациентов на использование их биологического материала в научно-исследовательских целях. Форма информированного добровольного согласия одобрена локальным этическим комитетом.

В исследовании использовано 38 образцов жировой ткани, полученных от добровольцев в возрасте от 35 до 75 лет.

Методика выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани

Процедура выделения СВФ представляла собой последовательное выполнение следующих шагов.

1. Шприцы, содержащие жировую ткань, обрабатывали стерильными спиртовыми салфетками и устанавливали вертикально в штатив для пассивного разделения фракций (отстаивание). Жировая ткань концентрировалась в верхней части шприца, водная фракция — в нижней. Не изменяя положения шприца, аккуратно снимали защитный колпачок и удаляли водную фракцию путем надавливания на поршень, оставляя жировую ткань в шприце.

2. Инфузионный мешок извлекали из стерильной упаковки, закрывали все порты магистралей, присоединяли шприц с жировой тканью через порт с креплением типа луер-лок, открывали порт магистрали и переносили жировую ткань в инфузионный мешок посредством надавливания на поршень шприца. Процедуру повторяли для всех шприцев с жировой тканью.

3. Шприцем набирали раствора Рингер 100 мл и через магистраль переносили его в инфузионный мешок с жировой тканью, после чего порт магистрали закрывали. Содержимое инфузионного мешка тщательно перемешивали, затем устанавливали вертикально для разделения фракций на 3—5 мин. После этого жидкую фракцию удаляли обратно в шприц путем оттягивания поршня.

4. Процедуру промывания жировой ткани раствором Рингера повторяли еще раз.

5. Раствор коллагеназы готовили в 2 шприцах объемом 50 мл. Для этого в каждый из двух стерильных флаконов с коллагеназой производства ООО «Обл-Био» (Россия) вносили 10—15 мл стерильного раствора Рингера и после полного растворения набирали в стерильные шприцы, содержащие 35—40 мл раствора Рингера соответственно.

6. Подготовленный раствор коллагеназы объемом 100 мл вводили в инфузионный мешок через магистраль. После этого порт магистрали закрывали и содержимое тщательно перемешивали. Мешок с жировой тканью и ферментом помещали в шейкер-инкубатор, где инкубировали при 37°C в течение 30 мин.

7. По окончании инкубации инфузионный мешок извлекали из инкубатора, обрабатывали стерильной салфеткой для удаления влаги с поверхности и антисептическим раствором для обеспечения стерильности. Затем через магистраль в инфузионный мешок вводили 200 мл раствора Рингера и перемешивали содержимое.

8. В штатив устанавливали 8 пробирок для сепарации клеток жировой ткани. Открывали их крышки и через магистраль инфузионного мешка переносили клеточную суспензию в пробирки. Крышки плотно закрывали.

9. Пробирки для сепарации помещали в центрифугу и центрифугировали в течение 7 мин при 400g.

10. В штатив устанавливали 4 чистые пробирки для сепарации. После центрифугирования пробирки для сепарации клеток жировой ткани переносили в штатив, удаляли надосадочную жидкость и откручивали верхнюю часть пробирки. Стерильной пипеткой Пастера клеточный осадок из двух пробирок переносили в одну пробирку объемом 50 мл. В каждую пробирку добавляли раствор Рингера до объема 50 мл.

12. Пробирки для сепарации с клеточными осадками вновь помещали в центрифугу и центрифугировали в течение 7 мин при 400g.

13. В штатив устанавливали одну чистую обычную центрифужную пробирку объемом 50 мл. После завершения центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, а к клеточному осадку добавляли по 10 мл раствора Рингера. Стерильной пипеткой Пастера клеточные осадки из четырех пробирок объединяли в одну пробирку.

14. Пробирку с клеточным осадком центрифугировали в течение 7 мин при 400g, обеспечивая равновесие пробиркой с раствором Рингера.

15. По завершении центрифугирования пробирку переносили в штатив, сливали надосадочную жидкость и добавляли 5 мл раствора Рингера к клеточному осадку, перемешивая его стерильной пипеткой Пастера.

16. Полученный клеточный осадок переносили в стерильный шприц для дальнейшего применения.

Результаты

По описанной выше методике из всех 38 образцов липоаспирата объемом 100 мл выделена СВФ. Конечный объем СВФ составлял 5 мл.

Среднее количество клеток, выделенных из каждого образца, составляло 1,5—2 млн ядросодержащих клеток на 1 мл липоаспирата, что соответствует заявленным целям исследования. Жизнеспособность клеток, оцененная методом трипанового синего, составила 90—95%, что свидетельствует о высокой эффективности ферментативной обработки и бережного выделения клеточной фракции. Применение радиационной стерилизации фермента коллагеназы и этиленоксидной стерилизации пробирок обеспечило безопасность клеточного материала. Полученные результаты подтверждают, что предложенная методика выделения СВФ из жировой ткани является эффективной и может быть рекомендована как стандартная для использования в регенеративной медицине, а также для клинических и научных целей.

Заключение

В рамках выполнения государственного задания по разработке медицинских изделий для получения и применения стромально-васкулярной фракции жировой ткани создана пробирка для сепарации клеток жировой ткани, а также предложен метод ее применения.

Исследование показало, что предложенная методика выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани является эффективной, безопасной и воспроизводимой. Процедура позволяет получать высококачественный клеточный материал с высокой жизнеспособностью и минимальным риском контаминации. Особое значение имеет то, что данная методика может быть адаптирована к использованию непосредственно в условиях операционной, это позволяет осуществлять введение стромально-васкулярной фракции жировой ткани пациенту сразу после изъятия липоаспирата.

В настоящее время проводятся подготовительные мероприятия для регистрации изделия в качестве медицинского, что обеспечит его скорую доступность для широкого использования в медицинских учреждениях. Ожидается, что внедрение этого устройства позволит повысить эффективность процедур, связанных с получением минимально манипулированных клеточных продуктов. Возможность быстрого выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани без необходимости дополнительной транспортировки материала и его промежуточной обработки открывает новые перспективы для использования данной методики, в особенности в регенеративной медицине.

Таким образом, предложенный подход к выделению стромально-васкулярной фракции жировой ткани из жировой ткани может стать основой для дальнейшего внедрения клеточных технологий в практическую медицину, обеспечивая высокую эффективность и безопасность процедур получения минимально манипулированных клеточных продуктов.

Работа выполнена в рамках государственного задания FURG-2023-0098 «Разработка медицинских изделий для получения минимально манипулированных клеточных продуктов» Минобрнауки России для ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.