Введение

Проблема регенерации тканей является актуальной проблемой хирургии. Необходимость выполнения традиционного лапаротомного оперативного доступа повышает риск развития осложнений, в том числе в области лапаротомной раны. Нарушение процесса заживления сопровождается формированием рубцов, хронических ран, нарушением функции ткани и органа [1].

Особую актуальность данная проблемы приобретает в аспекте восстановления ткани после хирургического лечения [2]. Частота развития осложнений лапаротомной раны в раннем послеоперационном периоде составляет почти 60% [3, 4]. Следует отметить, что любые осложнения значительно снижают качество жизни пациента и увеличивают продолжительность его пребывания в стационаре. Таким образом, новые подходы к объективизации оценки состояния послеоперационных ран и стимуляции репаративного потенциала тканей для контроля процесса заживления находятся в фокусе научного поиска исследователей и клинических специалистов [5].

В последнее десятилетие препараты обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) находят все большее признание и используются в различных областях медицины в аспекте применения персонифицированных подходов для восстановления тканей после хирургических операций [6]. Несмотря на популярность данного метода репаративных влияний, существует ряд неясных и дискутабельных аспектов проблемы, касающихся его применения.

Один из нерешенных вопросов — эффективность PRP терапии у пожилых пациентов. С возрастом отмечается снижение регенеративной способности тканей и повышение количества осложнений в области лапаратомных ран, что связывают с формированием сенесцентного фенотипа клеток (SASP) (т.е. клеток, прекративших деление в результате полученных необратимых повреждений) [7]. Согласно современной концепции антагонистической плейотропии клеточного старения, роль данного феномена неоднозначна с позиций физиологии и патологии регенерации и его роли в онтогенезе [8, 9]. Активно высказывается предположение, что SASP может стимулировать пластичность клеток путем паракринной регуляции клеток микроокружения и иммунной системы.

Таким образом, изучение клеточного ответа in vitro после стимуляции культуры PRP доноров разного возраста является неотъемлемым компонентом понимания роли сенесцентных факторов в регенерации, а также способом определения эффективности доноров PRP пожилого возраста.

Цель исследования — изучить в возрастном аспекте регенеративный потенциал обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) in vitro в культуре клеток дермальных фибробластов с оценкой пролиферативной, миграционной и метаболической активности клеток после их стимуляции PRP доноров разного возраста.

Материал и методы

Приводим описание процедуры приготовления образцов PRP. Для приготовления PRP использовали цельную кровь 20 доноров. Все обследуемые были разделены на 2 группы по возрасту. В 1-ю группу вошли 10 доноров крови (5 мужчин и 5 женщин) в возрасте от 30 до 40 лет (средний возраст Me [IQR]: 36 [33; 39] лет); 2-ю группу составили 10 доноров крови (5 мужчин и 5 женщин) в возрасте от 60 до 70 лет (средний возраст Me [IQR]: 64 [62; 68] года). Критерии включения в группы: согласие участия в исследовании. Критерии невключения: хронические соматические заболевания в стадии декомпенсации, наличие ревматических и аутоиммунных болезней, онкологических и эндокринных заболеваний, острых и хронических инфекционных болезней, послеоперационный период, беременность и лактация. Все исследования одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева».

Общий анализ крови выполняли на анализаторе Mindray BC-3600 (Китай), содержание форменных элементов крови — в пределах референсных значений, количество тромбоцитов цельной крови (Me [IQR]): 1-я группа — 239,00 [232,75; 245,25] в 1 мкл, 2-я группа — 217,50 [210,50; 248,00] в 1 мкл (p>0,05). Для приготовления PRP использовали один из классических протоколов одноэтапного центрифугирования [10], количество тромбоцитов в готовых образцах составило (Me [IQR]): 647,0 [615; 663] в 1 мкл в 1-й группе, 639,0 [611; 672] в 1 мкл во 2-й группе (p>0,05). Плазму замораживали и хранили до 1 мес при температуре –20°C.

Клеточная линия hTERT-HDFa (d220) иммортализованных дермальных фибробластов человека была предоставлена УНУ «Коллекция клеточных культур» ИБР РАН. Исследование проводили в условиях культивирования согласно паспорту культуры. В опытные лунки вносили размороженную активированную 10% CaCl₂ (20 мкл/мл) PRP доноров в концентрации 10%. Пробы без внесения PRP — отрицательный контроль — группа 0 (К). В качестве положительного контроля использовали аналогичную среду без PRP с добавлением 10% FBS — группа 0 (К 10% FBS) (рис. 1).

Рис. 1. Схема эксперимента оценки влияния обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) на культуру дермальных фибробластов человека в зависимости от возраста донора плазмы.

МТТ-тест — анализ метаболической активности клеток; АФК — активные формы кислорода.

Анализ метаболической активности клеток проводили с помощью МТТ-теста через 24 ч, 48 ч и 72 ч инкубации клеток. Жизнеспособность клеток в образце оценивали относительно данных контроля (группа 0), показатели которого принимали за 100%. Уровень продукции активных форм кислорода (АФК) фибробластами оценивали по интенсивности окисления 2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата (Lumiprobe, Россия) после инкубации с образцами плазмы доноров в течение 2 ч, 4 ч и 24 ч.

Протокол исследование раны in vitro (scratch assay). Морфологическую оценку клеток и фотографирование дефекта проводили через 0 ч и 24 ч с помощью инвертированного микроскопа «Микромед-И» (Россия) и камеры Toupcam (Китай). Расчет процентов закрытия раны поводили в программе Fiji ImageJ (Research Services Branch of the National Institute of Mental Health USA).

Морфологическую оценку, а также определение механизмов гибели клеток проводили с помощью флуоресцетной микроскопии при двойном окрашивании акридиновым оранжевым (АО) 100 мкг/мл и йодистым пропидием (PI) 100 мкг/мл через 24 ч инкубации в программе Fiji ImageJ (Research Services Branch of the National Institute of Mental Health USA).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли в программе StatTech v. 4.1.7 («Статтех», Россия). Для оценки соответствия нормальному распределению использовали критерий Шапиро—Уилка. Сравнение групп проводили с применением критерия Краскела—Уоллиса, апостериорные сравнения — с помощью критерия Данна с поправкой Холма. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Формат описания данных медиана (Me), нижний и верхний квартили [Q₁; Q₃].

Результаты

Оценка средних показателей жизнеспособности клеток линии hTERT-HDFa после добавления PRP доноров различного возраста продемонстрировала наличие достоверных межгрупповых различий (табл. 1). Следует отметить, что при внесении плазмы доноров старшей возрастной группы культура клеток дермальных фибробластов показала менее выраженную метаболическую активность и жизнеспособность. Указанные параметры были статистически значимо ниже результатов группы положительного контроля на всех сроках наблюдения. Достоверных различий среднего показателя МТТ-теста по всем срокам наблюдения между группами доноров разного возраста не выявлено. Расчет среднего показателя теста генерации АФК выявил максимальные значения в группе доноров 30—40 лет.

Таблица 1. Средние показатели жизнеспособности клеток культуры hTERT-HDFa после добавления PRP доноров разного возраста (по данным МТТ-теста)

Анализ влияний PRP доноров разного возраста на жизнеспособность культуры дермальных фибробластов на разных сроках наблюдения показал, что внесение обогащенной тромбоцитами плазмы доноров 60—70 лет существенно снижало метаболическую активность культуры hTERT-HDFa в 1-е сутки эксперимента. Этот показатель во 2-й группе был ниже такового в 1-й группе на 85,5% (p<0,05). Показатель жизнеспособности в 1-й группе был сопоставим с контрольными данными (рис. 2).

Рис. 2. Показатель жизнеспособности культуры на разных сроках наблюдения после добавления обогащенной тромбоцитами плазмы доноров разного возраста.

* — достоверность отличий 1-й группы от 2-й группы при p<0,001.

Оценка способности генерировать АФК дермальными фибробластами показала, что в первые часы после внесения плазмы доноров 30—40 лет отмечалось повышение интенсивности окислительных процессов. Этот показатель на сроках 2 ч и 4 ч превышал контрольные цифры в 3,3—5,6 раза для положительного контроля и в 2,3—4,8 раза (p<0,05) для отрицательного контроля. К концу 1-х суток наблюдения отмечали увеличение продукции АФК клетками в группе отрицательного контроля. Интенсивность генерации АФК фибробластами после добавления плазмы доноров 30—40 лет в динамике наблюдения проявила тенденцию к снижению, в то время как в группе после добавления плазмы доноров 60—70 лет интенсивность генерации АФК в динамике возрастала (рис. 3).

Рис. 3. Уровень продукции активных форм кислорода (АФК; единица измерения: RFU — relative fluorescence units) фибробластами после внесения обогащенной тромбоцитами плазмы доноров разного возраста.

* — достоверность отличий от группы 0 (К 10% FBS), # — достоверность отличий от группы 0 (К) при p<0,05.

При микроскопическом исследовании (табл. 2) установлено, что наибольший процент жизнеспособных клеток отмечался в группе 0 (К 10% FBS) и 1-й группе (доноры 30—40 лет). Следует отметить, что в 1-й группе при оценке количества некротических клеток таковых выявлено не было в отличие от данных других групп. Апоптоз выявлялся одинаково часто в группах контроля и 1-й группе (доноры в возрасте 30—40 лет). Наибольший процент некроза и апоптоза зарегистрирован во 2-й группе (доноры в возрасте 60—70 лет).

Таблица 2. Морфологическая картина и механизмы гибели клеток (данные флуоресцентной микроскопии, 48 ч)

Для оценки влияния PRP доноров разного возраста на деление и миграцию клеток был проведен тест «раны in vitro». Исследования показали, что миграция клеток происходила во всех группах (рис. 4), и дефекты закрылись на ²/₃ в течение 24 ч, через 48 ч регистрировали полное закрытие раны. Достоверных различий между группами не выявлено.

Рис.4. Процент закрытия (а) и структура дефекта (б) через 24 ч после внесения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP).

Достоверных различий между группами не отмечалось. Scale bar=100 мкм. AO — акридиновый оранжевый; PI — йодид пропидия.

Обсуждение

Результаты исследования показали, что жизнеспособность и метаболическая активность фибробластов зависят от возраста донора PRP. Данный эффект отмечается в первые 24 ч после внесения плазмы в среду. В группе доноров 60—70 лет отмечали снижение жизнеспособности культуры клеток. Этот эффект может быть обусловлен как повышенным содержанием токсических метаболитов, сенесцентных молекул, так и снижением продукции клетками факторов роста у лиц пожилого возраста. Так, в исследовании C. Giraldo и соавт. [11] выявлено снижение концентрации тромбоцитарного фактора роста (PDGF) в PRP у старых животных относительно молодых особей. Показано также, что увеличение концентрации провоспалительных цитокинов при старении может негативно влиять на метаболическую активность клеток [12].

Оценка интенсивности и типа гибели клеток в культуре дермальных фибробластов показала увеличение процента некроза и апоптоза клеток в первые 24 ч после внесения плазмы доноров 60—70 лет. После стимуляции культуры плазмой молодых доноров (1-я группа) процент апоптоза был достоверно ниже, некротических клеток не выявлено. Во многом аналогичный эффект регистрировали M. Moussa и соавт. [13], выявив пролиферативное влияние PRP молодых здоровых доноров на культуру хондроцитов, отмечено также снижение апоптоза и увеличение аутофагии.

При выявлении перечисленных эффектов в 1-е сутки эксперимента исследование показало, что на более поздних сроках наблюдения (48 ч и 72 ч) достоверных различий между влиянием плазмы от доноров разных групп не выявлено; вероятно, это связано с включением компенсаторных систем клеток и адаптации к новой среде. Кроме того, не отмечалось различий по миграционной способности клеток при внесении в среду PRP доноров разного возраста.

Интересные результаты получены при изучении генерации дермальными фибробластами АФК в ответ на внесение PRP доноров разного возраста. Выявлено стимулирующее прооксидантное действие плазмы молодых доноров с первых часов эксперимента с последующим снижением выработки АФК и адаптацией клеточной культуры. Указанный эффект с учетом его сопряженности с пролиферативной активностью культуры, вероятно, связан с физиологическими эффектами свободнорадикального окисления и его ролью в функционировании внутриклеточных сигнальных путей и генерации митогенного ответа при низких/умеренных концентрациях [14]. Внесение PRP пожилых доноров не давало выраженного прооксидантного эффекта в первые часы наблюдения, но имело тенденцию к нарастанию к окончанию 1-х суток после внесения плазмы.

Заключение

Таким образом, при оценке биологических эффектов обогащенной тромбоцитами плазмы доноров разного возраста на культуру дермальных фибробластов человека в первые 24 ч выявлено прооксидантное стимулирующее действие плазмы молодых доноров, которое сопровождается повышением метаболической активности и отсутствием некроза клеток. Внесение обогащенной тромбоцитами плазмы пожилых доноров в 1-е сутки сопровождалось снижением метаболической активности культуры, увеличением процента некроза и апоптоза клеток. Различий по миграционной активности дермальных фибробластов при внесении плазмы доноров разного возраста не выявлено. В последующем (48 ч, 72 ч) отмечали адаптацию клеточной культуры: достоверные различия между эффектами плазмы молодых и пожилых доноров по жизнеспособности и метаболической активности клеток hTERT-HDFa отсутствовали.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Власова Т.И., Власов А.П.

Сбор и обработка материала — Бродовская Е.П., Мадонов К.С., Коваленко Е.Н., Мякушин С.С., Полозова А.И.

Написание текста — Бродовская Е.П., Мадонов К.С.

Редактирование — Власова Т.И.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Vlasova T.I., Vlasov A.P.

Data collection and processing — Brodovskaya E.P., Madonov K.S., Kovalenko E.N., Myakushin S.S., Polozova A.I.

Text writing — Brodovskaya E.P., Madonov K.S.

Editing — Vlasova T.I.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда №24-25-00278, https://rscf</em>.ru/project/24-25-00278