Влияние полиморфизма генов интерлейкинов и фактора некроза опухолей на уровень цитокинов в сыворотке крови у больных хроническим гнойным средним отитом

Принятые сокращения:

IL-1b — интерлейкин-1b,

IL-6 — интерлейкин-6,

TNF-α — фактор некроза опухолей α.

Большинство болезней мультифакториальны и возникают в результате суммарного влияния наследственных причин и факторов среды. Одной из причин развития хронического гнойного среднего отита (ХГСО) является изменение со стороны общего и местного иммунитета, реализующееся за счет активности лейкоцитов и цитокинов [1]. Согласно современным представлениям, в основе патогенеза многих хронических заболеваний лежит дисбаланс между синтезом провоспалительных и противовоспалительных медиаторов [2]. Различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут влиять на уровень продукции кодируемых белков и тем самым на характер протекания иммунного ответа [3]. В связи с этим функциональный полиморфизм генов интерлейкинов представляет особый интерес, так как именно эти белки — медиаторы воспаления вносят огромный вклад в регуляцию иммунитета [4, 5].

Цель исследования — изучение влияния аллельных вариантов C3953T, T511C и T31C гена интерлейкина-1b (IL-1b), аллеля C174G гена интерлейкина-6 (IL-6) и аллеля G308A фактора некроза опухолей α (TNF-α) на уровень цитокинов в сыворотке крови больных ХГСО.

В исследование были включены 299 больных ХГСО, находящихся на лечении в ЛОР-отделении ККБ Читы. В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964) и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздравсоцразвития Р.Ф. от 19.06.03 № 266.

Пациенты объединялись по характеру течения заболевания в две группы. 1-ю группу составили 146 пациентов с туботимпанальной формой ХГСО (мезотимпанит) с мукозным течением в среднем ухе. 2-я группа представлена 153 больными с эпитимпаноантральной формой хронического отита (эпитимпанит), клинические проявления которой обусловлены кариозно-деструктивными процессами в ухе. В качестве контрольной (3-й) группы было рассмотрено 183 человека, никогда не страдавших патологией среднего уха. Группы были сопоставимы по полу и возрасту.

Всем больным были выполнены стандартные общеклинические исследования. Анализу подвергали геномную ДНК человека, выделенную из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс — кровь» (ООО НТП «Литех», Москва). С образцом выделенной ДНК параллельно проводили две реакции амплификации с двумя парами аллельспецифичных праймеров в режиме реального времени (PCR-rt), гель-электрофорезом в ультрафиолетовом свете.

Для определения концентрации интерлейкинов использовали наборы реагентов ООО «Вектор Бест» (Новосибирск). Измерение уровня цитокинов проводили методом твердофазного ИФА.

Полученные данные обработаны с помощью пакетов программ Biostat, Statistica 6,0 («Stat Soft Inc.», США). Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди—Вайнберга. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с заболеванием сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных, используя критерий χ². Для сравнения частот при нормальном распределении признака применялся t-критерий Стъюдента. Для оценки непараметрических показателей использовали критерий Манна—Уитни, связанных — критерий Вилкоксона. Для оценки ассоциаций рассчитывали относительный риск (OR). Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Молекулярно-генетические исследования показали, что среди здоровых лиц Забайкальского края в большинстве случаев были зарегистрированы гетерозиготное носительство полиморфизма С в позиции 3953 гена IL-1b (56,2%), полиморфизм Т в позиции 511 гена IL-1b в гомозиготном состоянии и аллельный вариант Т в позиции 31 гена IL-1b в гомозиготном состоянии в 41 и 49,2% наблюдений соответственно (табл. 1). Частота встречаемости полиморфизма C174G гена IL-6 в группе контроля была практически равнозначной, в то время как гомозиготное состояние по аллелю G (G308A) гена TNF-α было зарегистрировано в 2/3 случаев.

Обнаружено, что для больных ХГСО характерены генотипы гомозиготы С/С (52%) и гетерозиготное состояние по аллелю С (до 42%) в позиции 3953 гена IL-1b, при этом среди пациентов с доброкачественным и злокачественным течением воспалительного процесса в среднем ухе значимой разницы в распределении вариантов генотипов выявлено не было. Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию аллеля С, что указывает на повышенный риск развития хронического среднего отита у лиц, имеющих генотип С/С (табл. 1).

Исходя из нашего исследования, наличие аллельных вариантов, отвечающих за экспрессию генов, кодирующих повышенную продукцию интерлейкина-1 с последующей активацией всего цитокинового каскада и мононуклеарной инфильтрацией интерстиция с повреждением клеток под их влиянием, присутствует у большей части больных с эпитимпанитом. Так, у 121 (79,1%) человека с кариозно-деструктивным процессом отмечалось гетерозиготное носительство аллельного варианта Т в позиции 511 гена IL-1b и гомозиготное состояние аллеля у 30 (19,6%). При эпитимпаноантральной форме ХГСО наряду с частым обнаружением генотипа Т/С в позиции 511 гена IL-1b (T511C) фиксировалось и преобладание аллеля Т. Относительный риск ее обнаружения составлял 2,085 (CI 95%: 1,531—2,839).

Генотип гомозиготы по аллельному варианту С в позиции 31 (T31C) гена IL-1b (57,5%) при кариозно-деструктивной форме ХГСО ассоциирован с тяжестью течения хронического процесса в среднем ухе. Вероятность выявления этого генотипа в группе эпитимпанита в сравнении со здоровыми лицами составила 7,822 [CI 95%: 4,654—13,148]. Обладатели генотипа Т/С в позиции 31 гена IL-1b (T31C) среди пациентов с туботимпанальной формой ХГСО выявлялись в 55,5% случаев, тогда как среди неболевших и лиц, страдающих эпитимпанитом — в 36 и 31,4% наблюдений соответственно. Маркером злокачественного течения среднего отита выступил генотип Т/С гена в позиции 511 и генотип С/С в позиции 31 гена IL-1b (T31C).

Статистически значимых различий в распределении генотипов и полиморфизмов генов IL-6 (C174G) и TNF-α (G308A) в группах контроля и формах ХГСО отмечено не было (см. табл. 1).

При ХГСО содержание IL-1b в сыворотке крови повышалось до 16,8±0,2 пкг/мл в период активных клинических проявлений со стороны среднего уха и до 10,7±0,24 пкг/мл на 10-е сутки лечения в отличие от 0,0 пкг/мл в группе контроля (р<0,001). Уровень исследуемого медиатора воспаления при тимпаноантральной форме ХГСО оказался достоверно выше — 18,5±0,29 пкг/мл, чем при туботимпанальной форме — 14,2±0,35 пкг/мл (табл. 2). Длительное повышенное содержание провоспалительного цитокина в сыворотке крови пациентов — результат постоянно текущего патологического процесса в среднем ухе с усугубляющимися морфологическими изменениями, что особенно характерно для кариозно-деструктивного течения ХГСО. При наличии у лиц гомо- или гетерозиготных по высокопродуцирующему аллелю в позиции 3953 гена IL-1b (C3953T) синтезируется в 2—3 раза большее количество этого цитокина, чем у лиц, гомозиготных по аллельному варианту T в позиции 31 гена IL-1β (T31C), что может являться одной из главных причин дисрегуляции воспалительного ответа с соответствующей клинической картиной [5].

Возможно, уменьшение продукции интерлейкина выступает в качестве защитного механизма в виде снижения активности воспалительного ответа. Однако, с другой стороны, у пациентов с отсутствием данного аллельного варианта низкое количество цитокина приводит к снижению процессов острофазного ответа и в условиях повышенной выработки противоспалительных цитокинов — к хронизации процесса в среднем ухе.

Уровень IL-6 также оказался увеличенным у наблюдаемых больных по сравнению с контролем до 8,0±0,53 пкг/мл в 1-й день лечения с эпитимпаноантральным средним отитом и до 4,2±0,21 пкг/мл у больных с туботимпанальной формой ХГСО. После курса комбинированного лечения (консервативная терапия и хирургические вмешательства) у лиц, страдающих эпитимпанитом, показатели стали ближе к показателям в контрольной группе — 5,5±0,34 и 2,5±0,07 пкг/мл соответственно. Также в работе выявлена прямая связь между продукцией IL-6 и интенсивностью воспалительного ответа в среднем ухе (табл. 2).

Содержание TNF-α у пациентов с ХГСО повышалось относительно контрольных показателей в 6 раз в период обострения заболевания независимо от типа аллельных вариантов гена и оставалось на уровне цифр, превышающих контрольные в 3 раза к концу стационарного лечения (р<0,001). Этот полипептид оказывает стимулирующее влияние на синтез других провоспалительных цитокинов, пролонгирует внутрисосудистые нарушения за счет накопления свободных радикалов и перекиси водорода, что неблагоприятно сказывается на фиброгенезе в виде фактора, активизирующего склероз тканей. Повышенный уровень фактора некроза опухолей и IL-6 при ХГСО, скорее, обусловлен действием внешнесредовых факторов, чем полиморфизмом G308A гена TNF-α и C174G гена IL-6, так как различий в соотношении генотипов исследуемых генов по сравнению с группой здоровых лиц не наблюдалось.

Итак, в ходе молекулярно-генетического исследования выявлены носители аллелей в гомо- и гетерозиготном состоянии изучаемых генов. Содержание цитокинов может значительно отличаться при сравнении двух групп лиц с ХГСО с одинаковым полиморфизмом генов. Для адекватного иммунного ответа необходима определенная реакция со стороны про- и противовоспалительных цитокинов, и нарушение их продукции приводит к глубоким дефектам в противоинфекционной защите [6]. Так, по данным литературы, полиморфизм гена IL-10 в позиции –1082А, –819Т, –592А ассоциирован с низкой продукцией этого интерлейкина, что может приводить к относительному повышению синтеза таких провоспалительных цитокинов, как IL-1, IL-6 и TNF-α. Следовательно, полученные результаты могут лишь свидетельствовать о различном влиянии полиморфизма генов провоспалительных цитокинов на особенности протекания ХГСО, что требует дальнейших разработок в отношении прогнозирования биологических эффектов при взаимодействии генов про- и противовоспалительных цитокинов [7].

1. Среди здоровых жителей Забайкалья генотип С/Т в позиции 3953 гена IL-1b (C3953T) встречался в 56,2% наблюдений, генотип С/С в позиции 511 гена IL-1b (T511C) и генотип Т/Т в позиции 31 гена IL-1b (T31C) — в 41 и 49,2% соответственно.

2. У пациентов с кариозно-деструктивным течением ХГСО в 79,1% случаев было выявлено носительство аллеля T в гетерозиготном состоянии в позиции 511 гена IL-1b, ассоциированного с высоким содержанием провоспалительного цитокина в сыворотке крови больных.

3. Высокий уровень концентрации IL-6, TNF-α при эпитимпаноантральной форме ХГСО обусловлен кариозно-деструктивным течением воспалительного процесса в среднем ухе и не зависит от полиморфизмов генов IL-6 (C174G), TNF-α (G308A).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.