Значение митохондриальной дисфункции в стабилизации глаукомного процесса

Многие нейродегенеративные возрастные заболевания, к которым относится глаукома, имеют общие патологические механизмы, такие как окислительное повреждение и митохондриальная дисфункция [1]. Известно, что митохондрии в значительной степени накапливаются в немиелинизированной части аксонов ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) в решетчатой пластинке, которая является основной мишенью повышенного внутриглазного давления, индуцирующего глаукоматозное повреждение зрительного нерва [1, 2]. Возникающая в результате гипоксия сетчатки приводит к увеличению выработки активных форм кислорода, что, в свою очередь, способствует окислению внутриклеточных липидов, белков и ДНК, высвобождению воспалительных цитокинов.

Накопленные за последнее десятилетие результаты исследований указывают, что нарушенная динамика митохондрий, метаболический стресс и/или митохондриальная дисфункция, вызванные факторами риска глаукомы, имеют решающее значение для дегенерации ГКС при экспериментальной глаукоме [3—6].

Диагностика митохондриальных нарушений. В диагностике митохондриальных нарушений определяющее значение имеют цитохимические методы, основанные на определении активности ферментов в лимфоцитах периферической крови. В последние годы появился адекватный, относительно простой и малотравматичный количественный цитохимический метод исследования митохондриальных ферментов, достоверно отражающий полисистемное состояние энергетического обмена клеток и тканей. Работы в области клинической цитохимии с его использованием показали, что метаболические изменения лимфоцитов крови в значительной степени отражают аналогичные сдвиги в других клетках организма [7—9].

Наиболее информативными ферментами, определяющими функциональную активность митохондрий лимфоцитов, являются сукцинатдегидрогеназа (СДГ) и α-глицерофосфатдегидрогеназа (α-ГФДГ). Выбор этих энзимов определяется их ключевой ролью в аэробном и анаэробном энергообеспечении клетки, а также тем, что изменение их активности является маркером митохондриальной дисфункции. СДГ — маркер цикла Кребса митохондрий и основного энергообмена клетки, ее активность характеризует в целом уровень активности ферментов дыхательной цепи. α-ГФДГ — челночный шунт, соединяющий гликолиз и цикл Кребса для полного окисления пирувата в митохондриях, а также отражающий обмен фосфолипидов [9, 10].

Методы лечения митохондриальной дисфункции. Несмотря на широко признанную значимость дисфункции и потери митохондрий при офтальмологических заболеваниях, эффективные методы лечения для предотвращения митохондриальной дисфункции изучены недостаточно. Доступные в настоящее время методы лечения митохондриальных заболеваний ограниченны, однако в обзоре G. Kuang и соавт. (2023) авторы описывают потенциальные стратегии лечения, ориентированные на митохондрии, и обсуждают их полезность для использования при ПОУГ [11].

Ткани глаза постоянно подвергаются воздействию естественного и искусственного света, который является основным источником окислительного повреждения [12, 13]. Эффективными в таких условиях будут препараты, которые не только предотвращают нейрональное повреждение ганглиозных клеток сетчатки, но и воздействуют на все звенья патогенеза, запускаемые ишемией [14].

Одним из таких препаратов является референтный (оригинальный) препарат Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат), относящийся к группе антигипоксантов и антиоксидантов. Наиболее важными компонентами механизма действия препарата являются его антигипоксантные, антиоксидантные, мембранотропные эффекты, способность модулировать функционирование рецепторов и мембраносвязанных ферментов и восстанавливать нейромедиаторный баланс [15—22]. Учитывая широкий спектр фармакологической активности препарата, можно предположить позитивное действие Мексидола при глаукомной оптической нейропатии для выравнивания митохондриального гомеостаза и сохранения жизнеспособности и функциональной активности нейронов сетчатки и зрительного нерва.

Цель исследования — выяснить степень выраженности митохондриальной дисфункции у пациентов с ПОУГ и оценить возможность стабилизации глаукомного процесса за счет улучшения функциональной активности митохондрий, их энергообразующей функции на фоне терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250.

В исследование эффективности и безопасности последовательного применения препарата Мексидол у пациентов с ПОУГ (протокол заседания этического комитета ТюмНЦ СО РАН №9 от 01.09.23) было включено 80 пациентов с ПОУГ развитой стадии и 20 «условно здоровых» добровольцев без глаукомы. По возрастным и гендерным признакам группы пациентов с ПОУГ и контрольная группа были репрезентативны. Среди пациентов с глаукомой было 48 женщин и 32 мужчины (средний возраст — 57,05±4,2 года), среди добровольцев без глаукомы — 12 женщин и восемь мужчин (средний возраст — 58,75±4,9 года). Всем пациентам с глаукомой проводили комплекс морфофункциональных и лабораторных методов. Для исследования световой чувствительности зрительного анализатора и выявления изменений в поле зрения проводилась статическая автоматическая периметрия (САП), регистрация индекса осцилляторных потенциалов (ИОП), зрительно вызванных корковых потенциалов на реверсивный шахматный паттерн (ПЗВП); паттерн-электроретинография (ПЭРГ). Исследование структурно-топографических изменений слоя нервных волокон и комплекса ганглиозных клеток сетчатки проводилось с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ).

О степени выраженности митохондриальной дисфункции судили по уровню активности митохондриальных ферментов — СДГ и α-ГФДГ.

Цитохимическое исследование активности митохондриальных ферментов осуществляли методом светового микроскопирования с помощью наборов реактивов производства компании «Химтехмаш» и Федерального государственного унитарного предприятия «ИРЕА» (Россия) по методике Пирса в модификации Р.П. Нарциссова [23]. Активность ферментов выражали в условных единицах (гранулы/клетка), соответствующих среднему числу гранул формазана в клетке. Кроме светового микроскопирования продукты реакции при выявлении активности СДГ исследовали в анализаторе изображения клетки «ДиаМорф» цитоморфоденситометрическим методом [10]. В связи с локализацией СДГ только в митохондриях геометрические размеры депозитов мы рассматривали как размеры митохондрий, а оптическую плотность депозитов — как интенсивность ферментативной реакции, т.е. активность фермента или функциональную активность митохондрий. Если в световом микроскопе подсчитывали количество гранул продукта реакции — формазана — независимо от их размера и интенсивности ферментной реакции, то в анализаторе исследовали размеры митохондрий, их оптическую плотность.

Общая группа пациентов с глаукомой была разделена на две группы сравнения: основную (n=40) и контрольную (n=40). Пациентам основной группы дополнительно к местному гипотензивному лечению назначена последовательная терапия по следующей схеме: Мексидол раствор для внутривенного и внутримышечного введения, 50 мг/мл по 300 мг внутримышечно (в/м) 1 раз в сутки в течение 14 дней с последующим назначением таблеток Мексидол ФОРТЕ 250 по 1 таблетке 3 раза в день на 56 дней [21]. Внутриглазное давление в обеих группах было компенсировано назначением местных бета-адреноблокаторов 2 раза в день и аналогов простагландина 1 раз в день вечером. По соматическому статусу и местному гипотензивному лечению группы были сопоставимы.

Критериями исключения пациентов из исследования были дегенеративные заболевания центральной нервной системы, сахарный диабет, наследственные заболевания, ассоциированные с врожденными мутациями в митохондриальном геноме (первичная митохондриальная дисфункция), острые и хронические воспалительные заболевания глаз (переднего и заднего отделов), оперативные вмешательства и повреждения органа зрения, наследственные дегенеративные заболевания глаз (переднего и заднего отделов), декомпенсация сопутствующих соматических заболеваний, прием антиоксидантов и/или ноотропных препаратов за 6 мес до включения в исследование, гиперчувствительность к этилметилгидроксипиридина сукцинату или к любому из вспомогательных веществ.

В качестве критериев эффективности последовательной терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 использовали клинико-функциональные, морфометрические и цитохимические показатели.

Дизайн исследования включал четыре визита: первый — для отбора пациентов, отвечающих критериям включения, второй — через 14 дней после окончания парентерального введения препарата Мексидол, третий — через 56 дней после окончания перорального приема препарата, заключительный — через 90 дней после завершения курса последовательной терапии.

В исследовании были определены две первичные конечные точки на фоне лечения: 1) уменьшение выраженности митохондриальной дисфункции — повышение основного энергообмена митохондрий за счет повышения активности митохондриальных ферментов (СДГ, α-ГФДГ) и увеличение оптической плотности митохондрий при цитоморфоденситометрическом исследовании лимфоцитов периферической крови; 2) число пациентов, у которых наблюдалась стабилизация глаукомной оптической нейропатии на основании динамических изменений индекса среднего отклонения фоточувствительности сетчатки (mD) по данным САП, индексов глобальных и фокальных потерь объема ганглиозных клеток (GLV и FLV) по данным ОКТ. Эти конечные точки были оценены для пациентов с ПОУГ обеих групп сравнения.

Кроме того, в исследовании было оценено несколько вторичных конечных точек влияния длительной последовательной терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 на динамику: нейронной активности сетчатки и зрительного нерва (улучшение амплитудных и фазовых характеристик компонентов ПЭРГ и ПЗВП) и ретинальной гипоксии на фоне последовательной терапии (улучшение ИОП).

Статистический анализ был выполнен в программе IBM SPSS 28. Количественные переменные представлены в виде среднеарифметического значения со стандартным отклонением (M±SD) при нормальном распределении, оцененном с помощью критерия Колмогорова—Смирнова с поправкой Лиллиефорса. При сравнении динамики количественных переменных в зависимости от распределения использовали многомерный анализ дисперсии (MANOVA) или критерий Фридмана. Корреляционный анализ был выполнен с расчетом коэффициента корреляции Пирсона. За достоверность различий изучаемых параметров принимали уровень значимости p<0,05.

Результаты сравнительного анализа активности ферментов СДГ и α-ГФДГ лимфоцитов периферической крови, периметрических индексов, морфометрических и электрофизиологических показателей у «условно здоровых» добровольцев соответствующего возраста без глаукомы и у пациентов с ПОУГ развитой стадии представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительный анализ оцениваемых параметров у пациентов с ПОУГ и лиц без глаукомы соответствующего возраста

Данные цитохимических исследований исходного состояния клеточного метаболизма у пациентов с ПОУГ сопоставляли с показателями метаболической активности лимфоцитов периферической крови «условно здоровых» добровольцев соответствующего возраста без глаукомы (табл. 2).

Таблица 2. Показатели активности СДГ и α-ГФДГ лимфоцитов периферической крови у пациентов с ПОУГ и «условно здоровых» добровольцев

Примечание. Условные единицы ферментативной активности лимфоцитов соответствуют среднему числу гранул формазана, являющегося продуктом цитохимической реакции. p — значимые различия с группой «условно здоровых» добровольцев без глаукомы аналогичного возраста.

На основании полученных результатов установлено, что у 75 (94%) пациентов с глаукомой средняя активность СДГ статистически значимо ниже уровня средней активности СДГ «условно здоровых» добровольцев (p<0,001). У 71 пациента с ПОУГ (89%) снижена активность α-ГФДГ (p<0,001).

Цитоморфоденситометрические показатели митохондриальной активности лимфоцитов периферической крови у пациентов с ПОУГ и «условно здоровых» добровольцев (по активности СДГ) представлены на рис. 1.

Рис. 1. Цитоморфоденситометрические показатели митохондриальной активности лимфоцитов периферической крови у пациентов с ПОУГ и «условно здоровых» добровольцев (по активности СДГ).

В данной работе мы хотели проследить взаимосвязь активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови, структурных изменений митохондрий с морфофункциональными характеристиками сетчатки и зрительного нерва у пациентов с глаукомой, что могло бы косвенно отражать функциональную активность митохондрий нейронов сетчатки (табл. 3).

Таблица 3. Корреляции активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови, структурных изменений митохондрий с длительностью глаукомного процесса и морфофункциональными характеристиками сетчатки и зрительного нерва у пациентов с глаукомой

Более глубокой депрессии основного фермента энергетического обмена соответствует большая длительность глаукомного процесса.

Оценка результатов последовательного лечения пациентов с ПОУГ препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250. На фоне последовательной терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 у пациентов основной группы с ПОУГ установлено увеличение активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови — СДГ и α-ГФДГ (табл. 4), увеличение площади и оптической плотности гранул и депозитов, количества митохондрий при цитоморфоденситометрическом исследовании, что свидетельствует о повышении основного энергообмена митохондрий и уменьшении выраженности митохондриальной дисфункции.

Таблица 4. Динамика активности митохондриальных ферментов у пациентов с глаукомой в группах сравнения, M±SD

Примечание. Здесь и в табл. 5, 6: * — значимость отличия показателя в пределах группы по сравнению с исходным уровнем, p<0,05; ^ — значимость различия между группами в один и тот же временной промежуток, p<0,05; ^# — значимость отличия показателя по сравнению с нормой, p<0,05.

Результаты цитохимического исследования митохондриальной активности лимфоцитов периферической крови у пациентов с ПОУГ на фоне лечения (по активности СДГ) представлены на рис. 2.

Рис. 2. Гистограмма распределения активности СДГ лимфоцитов периферической крови (гранул на лимфоцит, гр/лф) у пациентов основной группы с ПОУГ на фоне лечения: А — до лечения, В — после лечения, С — возрастная норма.

Сравнение параметров цитоморфометрического исследования лимфоцитов у пациентов основной группы до и после лечения позволило выявить увеличение количества митохондрий, площади и оптической плотности гранул и депозитов, увеличение очагов ферментативной активности по сравнению с исходным уровнем, что свидетельствует о повышении функциональной активности митохондрий на фоне последовательной терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 (рис. 3). В группе контроля наблюдали постепенное снижение активности митохондриальных ферментов, уменьшение количества митохондрий и их размера, что свидетельствует о нарастании энергетического дефицита митохондрий и усугублении митохондриальной дисфункции без энергопротекции.

Рис. 3. Динамика цитоморфоденситометрических показателей митохондриальной активности лимфоцитов периферической крови (по активности СДГ) у пациентов основной группы с ПОУГ на фоне лечения.

Результаты исследования выявили стабилизацию глаукомного процесса у пациентов основной группы по динамике морфофункциональных параметров, а именно: улучшение фоточувствительности сетчатки по данным САП, отсутствие отрицательной динамики показателей комплекса ГКС по данным ОКТ на фоне последовательной терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250. В контрольной группе пациентов с ПОУГ наблюдали снижение индекса среднего отклонения фоточувствительности сетчатки (mD), толщины комплекса ГКС и повышение индексов глобальных и фокальных потерь объема ганглиозных клеток к концу периода наблюдения (90 дней), что свидетельствует о прогрессировании глаукомной оптической нейропатии (табл. 5).

Таблица 5. Динамика морфофункциональных показателей у пациентов с глаукомой в группах сравнения, M±SD

Кроме того, в исследовании было оценено несколько вторичных конечных точек влияния длительной последовательной терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 на динамику биоэлектрической активности сетчатки и зрительного нерва (улучшение амплитуды и латентности волн P50 и N95 ПЭРГ и ПЗВП и уменьшение выраженности ретинальной ишемии на фоне последовательной терапии — улучшение ИОП; табл. 6).

Таблица 6. Динамика электрофизиологических показателей у пациентов с глаукомой в группах сравнения, M±SD

Как известно, только неповрежденные митохондриальные мембраны обеспечивают функциональность митохондриальной цепи переноса электронов. Таким образом, замороженная или поврежденная ткань не даст точной картины функции митохондрий. В ряде работ было показано, что активность ферментов лимфоцитов может отражать состояние ферментативного статуса клеток различных тканей организма [24, 25]. Данные литературы свидетельствуют, что вызванные патологией изменения в биоэнергетике митохондрий могут происходить системно. Биомаркеры системы крови уже давно используются в клинической практике для диагностики заболеваний и прогнозирования из-за уникального свойства крови взаимодействовать (через перфузию) с каждой системой органов, а также отвечать на воздействие факторов окружающей среды и эндогенных нейрогуморальных сигналов. В соответствии с этой концепцией использование клеток периферической крови рассматривается как реализуемая опция для измерения функции митохондрий в трансляционной медицине [26]. Результаты ряда контролируемых исследований демонстрируют измененную биоэнергетику клеток крови при тромбоэмболии легочной артерии [27], сепсисе [28], бронхиальной астме и болезни Паркинсона [8, 29], инфаркте миокарда [30, 31], болезни Альцгеймера [32].

В данной работе мы хотели проследить взаимосвязь активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови, структурных изменений митохондрий с морфофункциональными характеристиками сетчатки и зрительного нерва у пациентов с глаукомой, что могло бы косвенно отражать функциональную активность митохондрий нейронов сетчатки. При проведении множественной пошаговой регрессии между данными проведенного обследования и показателями ферментного статуса лимфоцитов у пациентов с ПОУГ установлено, что изменения ферментного статуса лимфоцитов по активности СДГ коррелируют с длительностью глаукомы (R= –0,756; p<0,01), светочувствительностью сетчатки (mD) по данным САП (R=0,721; p<0,01) и амплитудой компонентов P и N ПЭРГ (R=0,634; p<0,01). Активность α-ГФДГ взаимосвязана с ИОП, характеризующим выраженность ретинальной гипоксии (R=0,538; p<0,01). Основные цитоморфометрические показатели (количество гранул и депозитов, их площадь, оптическая плотность и разнородность по оптической плотности, площадь и оптическая плотность отдельно лежащих гранул) значимо коррелировали с параметрами ОКТ — индексами глобальных (GLV,%) и фокальных (FLV,%) потерь ГКС. Множественный коэффициент корреляции составлял 0,230—0,756.

Результаты проведенного цитохимического исследования свидетельствуют о возможных перспективах использования метода мониторинга течения заболевания и эффективности лекарственных средств, влияющих на разные уровни энергетического метаболизма и функционирование электронной цепи митохондрий.

Включение в комплексную терапию ПОУГ последовательного назначения препаратов Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 оказало положительный клинический эффект, который проявлялся в повышении активности митохондриальных ферментов лимфоцитов при цитохимическом исследовании, увеличении размеров и оптической плотности митохондрий при цитоморфоденситометрическом исследовании, улучшении светочувствительности сетчатки, стабилизации толщины комплекса ганглиозных клеток сетчатки, улучшении нейрональной активности сетчатки и зрительного нерва, снижении выраженности ретинальной гипоксии по данным комплексного офтальмологического исследования.

Таким образом, системная оценка биоэнергетической функции лимфоцитов периферической крови для выяснения степени выраженности митохондриальной дисфункции не только способна обеспечить понимание некоторых патогенетических механизмов развития и прогрессирования ПОУГ, но и может быть применима в качестве инструмента персонализированной медицины для диагностики, мониторинга динамики и оценки эффективности терапевтической стратегии у пациентов с глаукомой.

Как показало наше исследование, проведение последовательного курса метаболической коррекции препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 способствует своевременному назначению патогенетически оправданной терапии выявленных нарушений биоэнергетического обмена, а также восстановлению энергетического баланса митохондрий и стабилизации клинико-функциональных и морфометрических параметров у пациентов с глаукомой.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.М., С.Ю.П.

Сбор и обработка материала: А.В., Ю.Ф.

Статистическая обработка: С.А.П., Д.Г.

Написание текста: А.В.

Редактирование: Т.М., Д.Г., С.Ю.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.