Фибротизация является одним из наиболее важных патологических состояний в процессе заживления ран при хирургических вмешательствах, в частности после дакриоцисториностомии (ДЦР) — создания соустья между слезным мешком и полостью носа. Избыточное рубцевание вновь созданного пути оттока приводит к его закрытию и регрессу эффекта операции [1]. Причиной этого может быть сохраняющаяся после окончания фазы ремоделирования активность миофибробластов. Эта фаза — конечная и наиболее продолжительная в процессе заживления любых ран в организме человека. Начинаясь приблизительно на 15-й день после появления раны, она может продолжаться до 6 мес и включает процессы замещения грануляционной ткани более плотной рубцовой [2, 3]. Считается, что «созревание» коллагена и уплотнение ткани, происходящие в это время, обеспечиваются активностью миофибробластов [4]. Отсутствуя в неповрежденных тканях, миофибробласты появляются в ране, «активируясь» из ряда других типов клеток, прежде всего фибробластов, а после заживления ран подвергаются апоптозу или деактивируются [5]. Трансформация клеток-предшественников в миофибробласты происходит в ответ на воздействие ряда цитокинов, в том числе таких, как трансформирующий фактор роста β (transforming growth factor β, TGF-β) и фактор роста соединительной ткани (connective tissue growth factor, CTGF) [6, 7].

Данные ряда исследований указывают на то, что «центральными» медиаторами процесса фиброза являются изоформы TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3) [6, 8]. Важным регулятором фиброгенеза является и CTGF. Он стимулирует процессы коллагеногенеза и облегчает активацию латентной формы TGF-β по интегринзависимому пути [9]. И, хотя CTGF не оказывает прямого влияния на активацию миофибробластов в отсутствие TGF-β, он формирует «благоприятную среду» для функционирования TGF-β и действует совместно с ним [7, 10, 11].

Существуют также медиаторы, обладающие антагонизмом к TGF-β, наиболее важным из которых можно считать фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor, FGF-2). Он усиливает пролиферацию фибробластов, предотвращая их трансформацию в миофибробласты, что способствует заживлению ран без образования рубца [12, 13].

Некоторыми исследователями предприняты попытки выявления факторов, предрасполагающих к избыточному рубцеванию после операций в полости носа. L. Heindl и соавторы обнаружили, что хроническое воспаление слизистой оболочки полости носа, способствующее развитию подслизистого фиброза, повышает вероятность неудачного результата ДЦР [14]. Эти данные подтверждены в ряде публикаций [15—17].

Исследования биохимических факторов, влияющих на различные процессы хронического воспаления и фиброза в ткани слизистой оболочки полости носа, немногочисленны. E. Penttilä и соавторы выявили повышение экспрессии воспалительных медиаторов, таких как интерлейкины IL-6, IL-1β, цитокин CCL2, фактор некроза опухоли TNF и др., в образцах ткани слизистой оболочки полости носа у пациентов, которым проведена ДЦР. Однако корреляции между экспрессией данных факторов и результатом ДЦР не установлено [18]. Экспрессию медиаторов фиброза авторы не изучали. J. Lee и T. Kim исследовали цитокиновый состав слезной жидкости пациентов с хроническим дакриоциститом и выявили повышение уровня воспалительных цитокинов у всех пациентов до и после оперативного лечения, а также значительно повышенную концентрацию TGF-β2 и FGF-2 у пациентов с неблагоприятным результатом хирургического вмешательства [19]. Однако малый размер выборки не позволил авторам сделать выводы о взаимосвязи концентрации этих цитокинов и успешности оперативного лечения.

Цель исследования — изучить корреляцию результата эндоназальной эндоскопической ДЦР (ЭЭДЦР) c концентрацией некоторых медиаторов фиброза.

Проанализированы результаты 45 случаев ЭЭДЦР у 45 пациентов (4 мужчины и 41 женщина) с хроническим дакриоциститом. Средний возраст пациентов составил 56,71±13,77 года. Все операции выполнены одним хирургом. Критериями исключения из исследования были заболевания полости носа и околоносовых пазух, при которых требовалось лечение, а также новообразования слезоотводящих путей. Кроме того, в исследование не вошли пациенты, которым на завершающем этапе операции выполнена интубация дакриостомы лакримальным имплантатом. Все пациенты предоставили информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Получено разрешение на исследование от локального комитета по биомедицинской этике ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней» (протокол № 6−10 от 03.03.17).

До оперативного вмешательства пациентам выполняли стандартное офтальмологическое обследование, а также «цветные пробы» (канальцевую и носовую), промывание слезоотводящих путей, мультиспиральную компьютерную томографию с контрастированием слезоотводящих путей, эндоскопическое обследование полости носа. Критериями неудачного результата оперативного вмешательства считали повторное возникновение слезотечения, непроходимость слезоотводящих путей при промывании и заращение дакриостомы, констатированное при эндоскопическом исследовании полости носа. Послеоперационное наблюдение длилось 6 мес. Контрольные осмотры осуществляли в сроки 7, 14, 28 дней, 3 и 6 мес после оперативного вмешательства.

Через 6 мес по итогам динамического наблюдения пациенты разделены на две группы:

— 1-я группа (n=10) — пациенты с неблагоприятным результатом ЭЭДЦР;

— 2-я группа (n=34) — пациенты с благоприятным результатом ЭЭДЦР.

Из исследования исключен 1 пациент по причине неявки на послеоперационные осмотры в сроки 3 и 6 мес.

Полнослойные тканевые биоптаты слизистой оболочки полости носа у всех пациентов получены до операции из области предполагаемой дакриостомы в среднем носовом ходе. Забор материала осуществляли до начала оперативного вмешательства после проведения местной анестезии. Оперативное вмешательство выполняли по модифицированной методике P. Wormald [20].

После получения материал взвешивали на торсионных весах ВТ-500 и помещали в пробирки типа Эппендорф емкостью 2 мл со стерильным фосфатным буферным раствором из расчета 1 мл на 0,1 г тканевого биоптата. Содержимое пробирки гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. Полученную суспензию центрифугировали на скорости 5000 об/мин в течение 10 мин (центрифуга Еlmi СМ-50М; «ELMI Ltd.», Республика Латвия). Надосадочную часть отбирали, ее объем доводили до 2 мл добавлением стерильного фосфатного буферного раствора. До исследования образцы хранили при температуре (–)20 °С.

Перед исследованием образцы размораживали при комнатной температуре. Содержание цитокинов TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, CTGF, FGF-2 в образцах определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием готовых наборов («Cusabio Biotech Co LTD», Китай).

Исследование проводили в соответствии с протоколом и рекомендациями, предоставленными компанией-производителем. Результаты регистрировали на планшетном спектрофотометре Яхонт 01 (Российская Федерация). Калибровочную кривую строили по алгоритму нелинейной аппроксимации с использованием программного пакета GraphPad Prism («GraphPad Software», США). Каждый образец исследовали в дуплетах, в качестве итогового показателя результата концентрации исследуемого вещества использовали среднее арифметическое рассчитанной концентрации в 2 лунках. Для нормировки показателей к содержанию общего белка определяли его количество в образцах реакцией с пирогаллоловым красным.

Статистическую обработку полученных данных проводили в программе IBM SPSS Statistics v23 («IBM Corporation», США). Распределение параметров отличалось от нормального, в связи с этим применяли непараметрические критерии. Для определения корреляционной зависимости между показателями концентрации факторов роста и результатом операции рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Корреляционные зависимости признавали статистически значимыми при р<0,05.

Неблагоприятный результат оперативного вмешательства наблюдали в 10 (22,72%) из 44 случаев. Во всех случаях причиной неблагоприятного исхода явилось рубцовое заращение дакриостомы, наступившее в течение 6 мес послеоперационного наблюдения.

Все данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения M±SD. Результаты исследования уровня цитокинов в полученных образцах приведены в таблице

Концентрация цитокина FGF-2 достигла порога чувствительности тест-системы в 18 (40,9%) образцах. Статистически значимая корреляционная зависимость между концентрацией FGF-2 и возникновением рецидива заболевания не определена (p>0,05). Среднее значение FGF-2 во всех образцах составило 1,68±2,96 пг/мл.

Концентрация цитокина CTGF достигла порога чувствительности в 40 (90,9%) образцах. У 9 из 10 пациентов 1-й группы концентрация CTGF в образцах слизистой оболочки полости носа превышала этот показатель у пациентов 2-й группы. Корреляция между уровнем CTGF и рубцовым заращением соустья после ЭЭДЦР признана статистически значимой (p<0,05).

Концентрация цитокинов TGF-β1, TGF-β2 определена во всех образцах, TGF-β3 — в 43 (97,73%) образцах. Статистически значимая корреляционная зависимость между концентрацией данных цитокинов и возникновением рецидива отсутствовала (p>0,05). Средняя концентрация цитокинов TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3 составила 4,36±2,12, 44,08±28,67 и 138,45±142,26 пг/мл соответственно.

В настоящем исследовании нами изучена взаимосвязь между содержанием цитокинов FGF-2, CTGF, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 в слизистой оболочке полости носа пациентов с дакриоциститом и результатом ЭЭДЦР. Полученные данные свидетельствуют о влиянии повышенной концентрации цитокина CTGF в ткани слизистой оболочки полости носа на последующее избыточное рубцевание созданной дакриостомы и как следствие, рецидивирование дакриоцистита.

Полученные в нашем исследовании данные показали, что у пациентов, более склонных к избыточному рубцеванию дакриостомы, наблюдается изначально повышенная концентрация CTGF в слизистой оболочке полости носа. Анализируя механизмы, лежащие в основе этой взаимосвязи, можно предположить, что повышенная «фоновая» концентрация CTGF потенцирует действие остальных медиаторов фиброза, появляющихся в раневом ложе на последующих этапах ремоделирования ткани. Такая избыточная стимуляция приводит к более продолжительной активности миофибробластов и закрытию просвета дакриостомы рубцовой тканью.

Полученные результаты поддерживают гипотезу о связи длительно существующего хронического воспаления в полости носа с заращением дакриостомы в послеоперационном периоде, выдвинутую рядом авторов [14—17].

Необходимо отметить, что, по данным J. Dammeier и соавторов, причиной увеличения концентрации CTGF может являться внешний фактор, такой как применение лекарственного препарата. В частности, лечение глюкокортикостероидами может провоцировать повышение продукции CTGF и снижать продукцию TGF-β [21]. Однако пациенты, применяющие глюкокортикостероиды местно, исключены из настоящего исследования.

Отсутствие корреляции между концентрацией FGF-2, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 и возникновением рецидива дакриоцистита в настоящем исследовании не является доказательством того, что перечисленные факторы не вовлечены в процесс рубцевания, приводящий к закрытию просвета дакриостомы. По данным E. Moussad и D. Brigstock, пик продукции этих цитокинов, вероятно, находится дальше по временно́й шкале от начала оперативного вмешательства [22].

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о наличии корреляционной зависимости между содержанием цитокина CTGF в слизистой оболочке полости носа до операции и отрицательным результатом оперативного вмешательства при дакриоцистите. Однако тот факт, что не определена подобная зависимость с другими исследованными в данной работе медиаторами фиброза, не говорит о том, что их влияние на процесс заживления дакриостомы после эндоназальной эндоскопической дакриоцисториностомии отсутствует. CTGF может быть фактором, потенцирующим активность других медиаторов фиброза, концентрация которых в ткани увеличивается в процессе заживления.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.А., В.Я.

Сбор и обработка материала: Н.К., А.С.

Статистическая обработка: А.С., Д.Р.

Написание текста: Е.А., Д.Р.

Редактирование: Н.К., В.Я.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Атькова Е.Л. — к.м.н., заведующая отделением патологии слезного аппарата; https://orcid.org/0000-0001-9875-6217; e-mail: evg.atkova@mail.ru

Суббот А.М. — к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии; https://orcid.org/0000-0002-8258-6011; e-mail: kletkagb@gmail.com

Краховецкий Н.Н. — к.м.н., старший научный сотрудник отделения патологии слезного аппарата; https://orcid.org/0000-0002-3247-8418; e-mail: krahovetskiynn@mail.ru

Ярцев В.Д. — к.м.н., научный сотрудник отделения патологии слезного аппарата; https://orcid.org/0000-0003-2990-8111; e-mail: yartsew@ya.ru

Рейн Д.А. — аспирант отделения патологии слезного аппарата; https://orcid.org/0000-0001-9875-6217; е-mail: illefarn@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Рейн Денис Алексеевич — аспирант отделения патологии слезного аппарата; https://orcid.org/0000-0001-9875-6217; е-mail: illefarn@mail.ru