Аветисов С.Э.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт глазных болезней" РАМН, Москва

Мамиконян В.Р.

Учреждение Российской академии медицинских наук "НИИ глазных болезней РАМН", Москва

Новиков И.А.

Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России, Москва, Россия

Патеюк Л.С.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Осипян Г.А.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Кирющенкова Н.П.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Перераспределение минеральных элементов в роговице при кератоконусе

Журнал: Вестник офтальмологии. 2015;131(6): 34-42

Просмотров : 59

Загрузок :

Как цитировать

Аветисов С. Э., Мамиконян В. Р., Новиков И. А., Патеюк Л. С., Осипян Г. А., Кирющенкова Н. П. Перераспределение минеральных элементов в роговице при кератоконусе. Вестник офтальмологии. 2015;131(6):34-42. https://doi.org/10.17116/oftalma2015131634-42

Авторы:

Аветисов С.Э.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт глазных болезней" РАМН, Москва

Все авторы (6)

Кератоконус (КК) — невоспалительное эктатическое заболевание роговицы, проявляющееся деструктивными изменениями, прогрессирующим истончением и выпячиванием ее центральной части с изменением формы до конусовидной. До сих пор достоверно неизвестны ни этиология, ни патогенез данного заболевания. Несмотря на огромное число исследований, теорий и гипотез в отношении природы КК, ультраструктурные механизмы и нарушения, лежащие в его основе, не установлены.

При обследовании пациентов с КК выявляют ряд характерных морфологических изменений, одним из которых является пигментное кольцо Флейшера в основании конуса [1], т. е. в парацентральной зоне роговицы [2]. Согласно данным литературы, пигментное кольцо присутствует в 57% случаев КК и является, таким образом, его наиболее распространенным биомикроскопическим симптомом [1, 3]. А учитывая, что особенно часто кольцо Флейшера обнаруживают у пациентов с КК средней и развитой стадии [4], его появление также ассоциируют с прогрессированием заболевания. Считается, что данное кольцо представляет собой эпителиальные отложения гемосидерина, появившиеся в результате неправильного распределения слезной пленки из-за нарушения сферичности роговицы [1].

Присутствие гемосидерина было в свое время доказано методом качественной химической реакции на железо [5]. Применение более современных методов аналитической химии позволило определить наличие других химических элементов в составе пигментного кольца [6]. Однако данные о пространственном распределении этих элементов отсутствуют.

Из всех методов элементного анализа, подходящих для изучения состава биологических объектов, наиболее часто применяют рентгеноспектральный анализ (рентгеноспектральный микроанализ), заключающийся в расшифровке рентгеновского спектра, который излучает исследуемый образец в результате внешнего воздействия. Источником возбуждения может быть также рентгеновское излучение, в этом случае метод называется рентгенофлюоресцентный (X-ray fluorescence, XRF) анализ, или электронный пучок, и тогда мы имеем дело с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией на базе сканирующей электронной микроскопии (scanning electron microscopy with energy dispersive spectrometry, SEM-EDS).

В нашем случае применение современных методов аналитической химии позволило качественно и полуколичественно оценить распределение химических элементов в роговице в норме и при КК.

Целью настоящего исследования стало изучение пространственного распределения химических элементов роговицы в норме и при КК в соответствии с зонами роговицы (центральная и парацентральная) и ее послойной структурой.

Материал и методы

XRF и SEM-EDS являются высокоточными методами элементного анализа с высокой разрешающей способностью, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Например, XRF обладает более высокой чувствительностью и более низким порогом обнаружения, в то время как SEM-EDS — большим пространственным разрешением и более высокой локальностью.

Для определения нормального элементного состава роговицы были отобраны 7 кадаверных роговичных дисков без признаков патологических изменений. Все доноры — мужчины в возрасте 25—35 лет. Для исследования аномального распределения элементов было получено 5 роговичных дисков, удаленных при сквозной кератопластике (СКП) по поводу КК III стадии [7] у 3 мужчин и 2 женщин в возрасте 27—31 года.

Химический состав роговичных дисков определяли полуколичественно методом рентгенофлюоресцентного анализа при помощи энергодисперсионного рентгенофлюоресцентного спектрометра РеСПЕКТ (Предприятие «ТОЛОКОННИКОВ», Россия). Ускоряющее напряжение на трубке с медным катодом составляло 30 кВ, экспозиция при измерении — 300 с.

Роговичные диски выкраивали при помощи корнеального трепана диаметром 7—8 мм.

Для изолированного анализа центральной и парацентральной зон роговицы (зоны эктазии и зоны пигментного кольца Флейшера соответственно) из роговичного диска при помощи корнеального трепана диаметром 2 мм выкраивали два сегмента (центральный и периферический) (рис. 1). Образцы далее подвергали эвапорации в беспылевой камере при стандартных условиях: относительная влажность 65%, температура +20 °C, при атмосферном давлении.

Рис. 1. Препарирование роговицы для проведения XRF. Зоны роговицы [2] обозначены следующим образом: центральная (оптическая) — круг диаметром 4 мм; парацентральная (параоптическая) — кольцо с внешним диаметром 8 мм, толщиной 2 мм; периферическая — кольцо с внешним диаметром 11 мм, толщиной 1,5 мм; лимбальная — кольцо с внешним диаметром 12 мм, толщиной 0,5 мм. Красной пунктирной линией обозначены: роговичный диск диаметром 7 мм, а также его центральный и периферический сегменты диаметром 2 мм. Коричневая дугообразная линия указывает локализацию кольца Флейшера.

SEM-EDS

Для определения нормального элементного состава роговицы были отобраны 6 кадаверных роговичных дисков без признаков патологии роговицы. Все доноры — мужчины в возрасте 25—35 лет. Для исследования аномального распределения элементов было получено 5 роговичных дисков, удаленных при СКП по поводу КК III стадии у 4 мужчин и 1 женщины в возрасте 28—34 лет.

Химический состав роговичных дисков определяли полуколичественно при помощи сканирующего (растрового) электронного микроскопа EVO LS 10 («Carl Zeiss Group», Германия), оснащенного энергодисперсионным рентгеновским спектрометром (кремний-дрейфовый детектор рентгеновского излучения) X-Max 50 («Oxford Instruments», Соединенное Королевство). Изображения получали в режиме отраженных электронов (back-scattered electrons, BSE) с последующим элементным микрокартированием.

Роговичные диски выкраивали при помощи корнеального трепана диаметром 7—8 мм.

Удаленные роговичные диски подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте (во избежание миграции минеральных элементов в тканях роговицы) при температуре –195,75 °C с последующей лиофилизацией при давлении 50 Па и температуре –5 °C. В центральной зоне каждого роговичного диска был произведен кососагиттальный разрез на всю толщину роговицы и выкроен сегмент в виде бруска длиной 4 мм и шириной 0,6 мм с сечением в форме прямоугольной трапеции (рис. 2). На каждом таком сегменте было задано 6 линий сканирования так, чтобы получить достаточно информации о распределении минеральных элементов в тканях роговицы на различной глубине и расстоянии от центра. Одна линия (1000 точек) проходила по передней грани сегмента параллельно ее длинной стороне. Еще 5 линий (по 850 точек каждая) было проведено по скошенной грани субпараллельно ее короткой стороне. Рентгеновское излучение регистрировали в диапазоне энергий, достаточно широком, чтобы обеспечить выполнение поставленных задач (4,445—9,982 кэВ). Запись спектра в каждой точке проводили в режиме низкого вакуума (EP 70 Па) при ускоряющем напряжении 20 кВ, токе на образце 520 пА и экспозиции 18 с.

Рис. 2. Препарирование роговицы для проведения SEM-EDS. Непрерывные красные линии обозначают границы роговичного диска диаметром 7 мм и кососагиттальный разрез, проходящий через его центр. Локализация и ориентация выкраиваемого сегмента указана на рис. В (вид спереди) и Г (вид сбоку). Поперечное сечение препарата в виде прямоугольной трапеции изображено на рис. Д. Отмечены шесть заданных линий сканирования: одна — на передней грани выкроенного сегмента параллельно его длинному краю и пять — на скошенной грани субпараллельно ее короткой стороне (Е). Коричневые стрелки указывают на локализацию кольца Флейшера (рис. Е).

Для снижения эффекта выгорания образца в каждой точке обеспечивался дрейф пучка микроскопа на площади 4 мкм2. Прохождение каждой линии занимало от 7,5 до 19 ч, включая «мертвое время» детектора.

Неотъемлемым этапом рентгеноспектрального анализа является определение базовой линии спектра под каждым характеристическим пиком, что, однако, связано с существенной погрешностью в результатах из-за относительно низких концентраций минеральных элементов в биологических средах (в частности, в роговице).

Для решения этой проблемы мы разработали оригинальную методику коррекции базовой линии спектра, которая подразумевает использование Kα-линий титана (Ti), ванадия (V), кобальта (Co), галлия (Ga) и германия (Ge) в качестве опорных точек для интерполяции данных по принципу, близкому к кривым Безье. Перечисленные элементы мало распространены в природе либо не участвуют в метаболизме человека, либо вовсе инертны, в связи с чем можно считать, что они не вносят вклад в рентгеновскую флюоресценцию, а значит, интенсивность спектра в точках, соответствующих их энергетическим окнам, можно принять за базовую. После чего можно рассчитать истинную интенсивность эмиссии для остальных элементов от V до Co и от Co до Ga посредством вычитания интерполированных значений из зарегистрированного детектором количества импульсов (рис. 3).

Рис. 3. Коррекция базовой линии: формула и ее графическое объяснение.

Определение абсолютного содержания элементов в данном случае затруднительно, но для решения задач нашего исследования это не имеет значения. Существенным является то, что разработанная нами методика позволяет качественно определять в легких матрицах биологических объектов изменения концентраций хрома (Cr), марганца (Mn), железа (Fe), никеля (Ni), меди (Cu) и цинка (Zn).

Все линейные профили были проанализированы нами вышеуказанным способом.

Чтобы уменьшить влияние случайных погрешностей, связанных с неоднородностью тканевых структур, был произведен биннинг данных с шагом 40 точек измерения.

Для визуализации полученной информации было использовано картографическое программное обеспечение Surfer 8.0 («Golden Software, Inc.», США), которое осуществляет интерполяцию неравномерно распределенных данных в регулярную координатную сетку и позволяет построить различные виды карт.

Результаты и обсуждение

Обнаружено, что при кератоконусе происходит аномальное накопление железа, меди и цинка в парацентральной зоне роговицы (зоне видимого кольца Флейшера) и тотальное обеднение этими химическими элементами ее центра — зоны эктазии.

В центральном и периферическом сегментах, полученных из кадаверных роговичных дисков, содержание Fe, Cu и Zn оказалось примерно одинаковым. При К.К. выявлено очевидное накопление этих минеральных элементов на периферии роговичных дисков и полное отсутствие в зоне эктазии (табл. 1). В частности, содержание Cu на периферии роговичных дисков при КК превышало норму в 20,6 раза, Zn — в 7,8 раза, Fe — в 3,7 раза. Кроме того, на периферии роговичных дисков были обнаружены следовые количества Ni и свинца (Pb). Что касается кальция (Ca), то в норме он отсутствовал, а при КК обнаруживался в равных концентрациях как в центре, так и на периферии дисков.

Таблица 1. Соотношение металлов в роговице в норме и при КК по данным XRF

SEM-EDS

После получения BSE-изображений и данных по скорректированным линейным профилям (рис. 4) мы производили их интерполяцию и с помощью картографического программного обеспечения Surfer 8.0 строили карты распределения Fe, Cu и Zn в толще роговицы (рис. 5).

Рис. 4. BSE-изображение препарата роговицы и результаты химического анализа (SEM-EDS). BSE-изображение препарата роговицы, одна из граней которого представляет собой косо-сагиттальный срез через центр роговичного диска диаметром 7 мм. Линии сканирования указаны красным цветом. Представлены полученные профили для каждой линии. Проекция боуменовой мембраны на профилях указана вертикальными линиями лилового цвета. Зона кольца Флейшера обозначена коричневым оттенком.

Рис. 5. Карты распределения металлов полученные в результате интерполяции данных SEM-EDS. а — распределение Fe в роговичном диске в норме; б — распределение Fe в роговичном диске при КК; в — распределение Cu в роговичном диске при КК; г — распределение Zn в роговичном диске при К.К. Кольцо Флейшера указано красными стрелками.

В норме данные элементы распределены достаточно равномерно, хотя Fe несколько тяготеет к парацентральной зоне роговицы и ее задним слоям (см. рис. 5, а).

При КК наблюдалось аномальное накопление Fe в передних слоях и на периферии роговичных дисков, т. е. в зоне кольца Флейшера (см. рис. 5, б). Аналогичное перераспределение было зафиксировано для Cu и Zn (см. рис. 5, в, г).

Кальций при КК присутствовал в почти равных концентрациях как в центре, так и на периферии роговичных дисков.

SEM-EDS также позволила обнаружить микроконцентрации магния (Mg) в центре и на периферии роговичных дисков, полученных у пациентов с КК.

Многие авторы считают, что в основе развития КК лежат патологические изменения межклеточного вещества стромы роговицы. В роговичных дисках пациентов с КК снижена объемная доля коллагеновых волокон и нарушено расположение пластин [8—10].

Отдельные минеральные элементы определяют качественные характеристики соединительнотканных структур и принимают непосредственное участие в модуляции активности ферментов, определяющих скорость и качество синтеза и распада коллагеновых и эластиновых волокон [11—15].

Анаболизм коллагена ферментируется такими энзимами, как гидроксилазы, лизилоксидаза и гликозилтрансферазы. Гидроксилазы пролина и лизина, участвующие в посттрансляционных модификациях коллагена, содержат в активном центре атом Fe. Cu-содержащая лизилоксидаза формирует поперечные связи коллагеновых фибрилл. Гликозилтрансферазы участвуют в гликозилировании гидроксилизина молекул коллагена и нуждаются в Mn в качестве кофактора (табл. 2) [12—15].

Таблица 2. Роль металлозависимых ферментов в метаболизме соединительной ткани

В реакциях катаболизма коллагена участвуют некоторые металлозависимые энзимы — коллагеназы и металлопротеиназы. Тканевая коллагеназа представляет собой металлозависимый фермент, который в активном центре содержит Zn, а матриксные металлопротеиназы — семейство внеклеточных Zn-зависимых эндопептидаз, способных разрушать все типы белков внеклеточного матрикса, в том числе коллаген (см. табл. 2) [12—15].

Модулирование биомеханики и транспорта в межклеточном веществе соединительной ткани осуществляется посредством не только коллагеновых волокон, но и основного аморфного вещества — главным образом за счет изменения физико-химических свойств мукополисахаридов: их вязкость снижается или повышается в зависимости от активности гиалуронидаз, которые могут быть ингибированы Cu и Fe (см. табл. 2) [12—15].

Известно, что роговица обладает высокой проницаемостью для кислорода и насыщается им непосредственно из воздуха окружающей среды [16—20]. Вследствие этого клетки, волокна и основное вещество роговицы подвержены действию свободного кислорода как ни одна другая структура в организме человека, а значит, нуждаются в мощной антиоксидантной защите. Супероксиддисмутазы (СОД) — группа антиоксидантных ферментов, которые защищают ткани от оксидативного стресса. В организме человека кофакторами СОД выступают или Cu в паре с Zn, или Mn. СОД1 содержится в цитоплазме, СОД2 — в митохондриях и СОД3 — в межклеточном веществе (см. табл. 2) [21].

При некоторых заболеваниях глаз выявляют нарушение минерального обмена в тканях, отводя особую роль Fe [22, 23]. Отложение пигмента нередко происходит именно в роговице. Линии Хадсона—Стэли часто обнаруживают у пожилых лиц [24, 25]. Характерным проявлением птеригиума является линия Стокера [26]. Имеются сообщения о формировании пигментированной дуги роговицы в результате оптической коррекции гиперметропии жесткими контактными линзами (ортокератология) [27, 28]. Образование пигментированных отложений в эпителии также возможно в результате хирургических вмешательств на роговице: имплантации интрастромальных роговичных колец [29], радиальной кератотомии [30], фоторефракционной кератэктомии (photorefractive keratectomy, PRK) [31] и лазерного кератомилеза (laser-assisted in situ keratomileusis, LASIK) [32]. Эпителиальное отложение Fe в зоне роговицы, смежной с фильтрационной подушкой, именуют линией Ферри [33]. При миопии выявлены нарушения минерального обмена в тканях склеры [34].

Учитывая непосредственное участие ионов металлов в физиологии межклеточного матрикса и доказанные нарушения их метаболизма в роговице при КК, можно предполагать определенную роль изменений минерального обмена в патогенезе этого заболевания. Нарушение организации основного вещества стромы роговицы в основании эктазии может приводить к нарушению транспорта ионов металлов и, как следствие, — осаждению минеральных элементов. Отсутствие минеральных элементов в зоне эктазии в свою очередь может стать причиной аномальной активности металлозависимых ферментов, что сопровождается уменьшением синтеза коллагена и нарушением организации основного вещества роговицы. Таким образом, образование кольца Флейшера в основании эктазии при КК может быть как следствием, так и причиной эктазии в границах кольца.

Согласно геохимической классификации элементов Гольдшмидта, Cu, Zn, Fe, Pb и Ni являются переходными металлами четвертого периода и принадлежат к группе халькофильных элементов. Они объединены сходными химическими свойствами, что находит отражение на диаграммах Пурбе (Eh—pH или pE/pH диаграммы). На них нанесены поля термодинамической устойчивости различных соединений (форм существования) элементов в растворах с известной молярностью, при заданной температуре и парциальном давлении газов, но при различных значениях водородного показателя (pH) по оси абсцисс и окислительно-восстановительного потенциала (Eh) по оси ординат (рис. 6).

Рис. 6. Диаграмма Пурбе для Fe. Черными стрелками обозначена зона физико-химического баланса в здоровой роговице, при котором Fe находится в биодоступной водорастворимой форме. Красные стрелки указывают смещение Eh и pH, происходящее в роговице при КК, в результате которого происходит образование бионедоступных водонерастворимых форм Fe.

Например, при Eh около 0 мВ, характерном для роговицы [35], и нейтральном pH, характерном для биологических сред, Fe находится в биодоступной водорастворимой форме. Увеличение pH или Eh приводит к образованию и осаждению водонерастворимых соединений Fe. Аналогичным образом ведут себя Zn, Cu, Pb и Ni.

Таким образом, осаждение элементов халькофильной группы с образованием пигментного кольца Флейшера происходит в результате изменения pH или Eh в тканях роговицы, т. е. в результате формирования физико-химического барьера в основании эктазии. Характеристические паттерны линейных профилей роговицы также свидетельствуют в пользу этого предположения. Причем такой барьер может быть как причиной, так и следствием дегенеративных и/или дистрофических процессов в тканях роговицы при КК, что наводит на мысль о сразу нескольких возможных «порочных кругах» патогенеза (рис. 7, а).

Рис. 7. Причинно-следственные связи в патогенезе КК. а — принципиальная схема причинно-следственных связей при КК; б — причинно-следственная связь, образующаяся при увеличении кислородной проницаемости эпителия роговицы; в — причинно-следственная связь, образующаяся при дисфункции в системе СОД; г — причинно-следственная связь, образующаяся при смещении pH роговицы.

Окислительно-восстановительный потенциал отражает способность вещества присоединять электроны и увеличивается в присутствии высоких концентраций кислорода, поэтому чрезмерная проницаемость роговицы для кислорода может приводить к увеличению Eh. Учитывая тот факт, что проницаемость роговицы для кислорода регулируется преимущественно эпителием, дисфункция последнего является весьма вероятной причиной формирования физико-химического барьера в парацентральной зоне роговицы, проявляющегося в виде кольца Флейшера и ведущего к обеднению центра металлами и развитию эктазии. В то же время дисфункция эпителия и физико-химический барьер могут быть вызваны/усилены деструктивными изменениями в тканях роговицы при КК (см. рис. 7, б).

Еще одной возможной причиной повышения Eh является нарушение антиоксидантной защиты (т.е. дисфункция системы СОД на фоне недостаточности минеральных элементов), приводящее к оксидативному стрессу в тканях роговицы (см. рис. 7, в).

Что касается изменений pH в роговице, они вполне могут быть вызваны внешними факторами, такими как кислотность слезы. Повышение pH может нарушать водно-электролитный баланс и запускать процесс образования пигментного кольца c сопутствующими деструктивными изменениями [6]. В то же время pH может повышаться как раз в результате деструктивных процессов, происходящих в роговице при КК и сопровождающихся разрушением протеинов с образованием щелочных производных аммония (см. рис. 7, г).

Заключение

Характер осаждения минеральных элементов в роговице при КК свидетельствует в пользу наличия некоего физико-химического барьера в ее парацентральной зоне, т. е. в зоне появления кольца Флейшера.

С одной стороны, вышеуказанный барьер в основании эктазии может формироваться в результате идиопатических дегенеративных и/или дистрофических изменений, сопровождающихся алкализацией среды и/или оксидативным стрессом. С другой стороны, такой барьер, вне зависимости от причин образования, вызывает обеднение минеральными элементами центральной зоны роговицы, нарушение метаболизма коллагена, дезорганизацию межклеточного матрикса и кератэктазию. Все вышеперечисленное поддерживает состояние, благоприятное для химического разграничения зон роговицы, порождая «порочный круг».

Таким образом, можно сделать выводы: 1) кольцо Флейшера является не только биомикроскопическим признаком КК, но и патогенетическим и/или этиологическим фактором этого заболевания, 2) однажды начавшись, патологический процесс при КК становится самоподдерживающимся.

Несмотря на трудности в изучении роговицы человека in vivo, необходимо проведение дальнейших исследований для уточнения характера и роли причинно-следственных связей в патогенезе КК.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail