Кератоконус (КК) — невоспалительное эктатическое заболевание роговицы, проявляющееся деструктивными изменениями, прогрессирующим истончением и выпячиванием ее центральной части с изменением формы до конусовидной. До сих пор достоверно неизвестны ни этиология, ни патогенез данного заболевания. Несмотря на огромное число исследований, теорий и гипотез в отношении природы КК, ультраструктурные механизмы и нарушения, лежащие в его основе, не установлены.

При обследовании пациентов с КК выявляют ряд характерных морфологических изменений, одним из которых является пигментное кольцо Флейшера в основании конуса [1], т. е. в парацентральной зоне роговицы [2]. Согласно данным литературы, пигментное кольцо присутствует в 57% случаев КК и является, таким образом, его наиболее распространенным биомикроскопическим симптомом [1, 3]. А учитывая, что особенно часто кольцо Флейшера обнаруживают у пациентов с КК средней и развитой стадии [4], его появление также ассоциируют с прогрессированием заболевания. Считается, что данное кольцо представляет собой эпителиальные отложения гемосидерина, появившиеся в результате неправильного распределения слезной пленки из-за нарушения сферичности роговицы [1].

Присутствие гемосидерина было в свое время доказано методом качественной химической реакции на железо [5]. Применение более современных методов аналитической химии позволило определить наличие других химических элементов в составе пигментного кольца [6]. Однако данные о пространственном распределении этих элементов отсутствуют.

Из всех методов элементного анализа, подходящих для изучения состава биологических объектов, наиболее часто применяют рентгеноспектральный анализ (рентгеноспектральный микроанализ), заключающийся в расшифровке рентгеновского спектра, который излучает исследуемый образец в результате внешнего воздействия. Источником возбуждения может быть также рентгеновское излучение, в этом случае метод называется рентгенофлюоресцентный (X-ray fluorescence, XRF) анализ, или электронный пучок, и тогда мы имеем дело с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией на базе сканирующей электронной микроскопии (scanning electron microscopy with energy dispersive spectrometry, SEM-EDS).

В нашем случае применение современных методов аналитической химии позволило качественно и полуколичественно оценить распределение химических элементов в роговице в норме и при КК.

Целью настоящего исследования стало изучение пространственного распределения химических элементов роговицы в норме и при КК в соответствии с зонами роговицы (центральная и парацентральная) и ее послойной структурой.

XRF и SEM-EDS являются высокоточными методами элементного анализа с высокой разрешающей способностью, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Например, XRF обладает более высокой чувствительностью и более низким порогом обнаружения, в то время как SEM-EDS — большим пространственным разрешением и более высокой локальностью.

Для определения нормального элементного состава роговицы были отобраны 7 кадаверных роговичных дисков без признаков патологических изменений. Все доноры — мужчины в возрасте 25—35 лет. Для исследования аномального распределения элементов было получено 5 роговичных дисков, удаленных при сквозной кератопластике (СКП) по поводу КК III стадии [7] у 3 мужчин и 2 женщин в возрасте 27—31 года.

Химический состав роговичных дисков определяли полуколичественно методом рентгенофлюоресцентного анализа при помощи энергодисперсионного рентгенофлюоресцентного спектрометра РеСПЕКТ (Предприятие «ТОЛОКОННИКОВ», Россия). Ускоряющее напряжение на трубке с медным катодом составляло 30 кВ, экспозиция при измерении — 300 с.

Роговичные диски выкраивали при помощи корнеального трепана диаметром 7—8 мм.

Для изолированного анализа центральной и парацентральной зон роговицы (зоны эктазии и зоны пигментного кольца Флейшера соответственно) из роговичного диска при помощи корнеального трепана диаметром 2 мм выкраивали два сегмента (центральный и периферический) (рис. 1). Образцы далее подвергали эвапорации в беспылевой камере при стандартных условиях: относительная влажность 65%, температура +20 °C, при атмосферном давлении.

Для определения нормального элементного состава роговицы были отобраны 6 кадаверных роговичных дисков без признаков патологии роговицы. Все доноры — мужчины в возрасте 25—35 лет. Для исследования аномального распределения элементов было получено 5 роговичных дисков, удаленных при СКП по поводу КК III стадии у 4 мужчин и 1 женщины в возрасте 28—34 лет.

Химический состав роговичных дисков определяли полуколичественно при помощи сканирующего (растрового) электронного микроскопа EVO LS 10 («Carl Zeiss Group», Германия), оснащенного энергодисперсионным рентгеновским спектрометром (кремний-дрейфовый детектор рентгеновского излучения) X-Max 50 («Oxford Instruments», Соединенное Королевство). Изображения получали в режиме отраженных электронов (back-scattered electrons, BSE) с последующим элементным микрокартированием.

Роговичные диски выкраивали при помощи корнеального трепана диаметром 7—8 мм.

Удаленные роговичные диски подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте (во избежание миграции минеральных элементов в тканях роговицы) при температуре –195,75 °C с последующей лиофилизацией при давлении 50 Па и температуре –5 °C. В центральной зоне каждого роговичного диска был произведен кососагиттальный разрез на всю толщину роговицы и выкроен сегмент в виде бруска длиной 4 мм и шириной 0,6 мм с сечением в форме прямоугольной трапеции (рис. 2). На каждом таком сегменте было задано 6 линий сканирования так, чтобы получить достаточно информации о распределении минеральных элементов в тканях роговицы на различной глубине и расстоянии от центра. Одна линия (1000 точек) проходила по передней грани сегмента параллельно ее длинной стороне. Еще 5 линий (по 850 точек каждая) было проведено по скошенной грани субпараллельно ее короткой стороне. Рентгеновское излучение регистрировали в диапазоне энергий, достаточно широком, чтобы обеспечить выполнение поставленных задач (4,445—9,982 кэВ). Запись спектра в каждой точке проводили в режиме низкого вакуума (EP 70 Па) при ускоряющем напряжении 20 кВ, токе на образце 520 пА и экспозиции 18 с.

Для снижения эффекта выгорания образца в каждой точке обеспечивался дрейф пучка микроскопа на площади 4 мкм². Прохождение каждой линии занимало от 7,5 до 19 ч, включая «мертвое время» детектора.

Неотъемлемым этапом рентгеноспектрального анализа является определение базовой линии спектра под каждым характеристическим пиком, что, однако, связано с существенной погрешностью в результатах из-за относительно низких концентраций минеральных элементов в биологических средах (в частности, в роговице).

Для решения этой проблемы мы разработали оригинальную методику коррекции базовой линии спектра, которая подразумевает использование Kα-линий титана (Ti), ванадия (V), кобальта (Co), галлия (Ga) и германия (Ge) в качестве опорных точек для интерполяции данных по принципу, близкому к кривым Безье. Перечисленные элементы мало распространены в природе либо не участвуют в метаболизме человека, либо вовсе инертны, в связи с чем можно считать, что они не вносят вклад в рентгеновскую флюоресценцию, а значит, интенсивность спектра в точках, соответствующих их энергетическим окнам, можно принять за базовую. После чего можно рассчитать истинную интенсивность эмиссии для остальных элементов от V до Co и от Co до Ga посредством вычитания интерполированных значений из зарегистрированного детектором количества импульсов (рис. 3).

Определение абсолютного содержания элементов в данном случае затруднительно, но для решения задач нашего исследования это не имеет значения. Существенным является то, что разработанная нами методика позволяет качественно определять в легких матрицах биологических объектов изменения концентраций хрома (Cr), марганца (Mn), железа (Fe), никеля (Ni), меди (Cu) и цинка (Zn).

Все линейные профили были проанализированы нами вышеуказанным способом.

Чтобы уменьшить влияние случайных погрешностей, связанных с неоднородностью тканевых структур, был произведен биннинг данных с шагом 40 точек измерения.

Для визуализации полученной информации было использовано картографическое программное обеспечение Surfer 8.0 («Golden Software, Inc.», США), которое осуществляет интерполяцию неравномерно распределенных данных в регулярную координатную сетку и позволяет построить различные виды карт.

Обнаружено, что при кератоконусе происходит аномальное накопление железа, меди и цинка в парацентральной зоне роговицы (зоне видимого кольца Флейшера) и тотальное обеднение этими химическими элементами ее центра — зоны эктазии.

В центральном и периферическом сегментах, полученных из кадаверных роговичных дисков, содержание Fe, Cu и Zn оказалось примерно одинаковым. При К.К. выявлено очевидное накопление этих минеральных элементов на периферии роговичных дисков и полное отсутствие в зоне эктазии (табл. 1). В частности, содержание Cu на периферии роговичных дисков при КК превышало норму в 20,6 раза, Zn — в 7,8 раза, Fe — в 3,7 раза. Кроме того, на периферии роговичных дисков были обнаружены следовые количества Ni и свинца (Pb). Что касается кальция (Ca), то в норме он отсутствовал, а при КК обнаруживался в равных концентрациях как в центре, так и на периферии дисков.

После получения BSE-изображений и данных по скорректированным линейным профилям (рис. 4) мы производили их интерполяцию и с помощью картографического программного обеспечения Surfer 8.0 строили карты распределения Fe, Cu и Zn в толще роговицы (рис. 5).

В норме данные элементы распределены достаточно равномерно, хотя Fe несколько тяготеет к парацентральной зоне роговицы и ее задним слоям (см. рис. 5, а).

При КК наблюдалось аномальное накопление Fe в передних слоях и на периферии роговичных дисков, т. е. в зоне кольца Флейшера (см. рис. 5, б). Аналогичное перераспределение было зафиксировано для Cu и Zn (см. рис. 5, в, г).

Кальций при КК присутствовал в почти равных концентрациях как в центре, так и на периферии роговичных дисков.

SEM-EDS также позволила обнаружить микроконцентрации магния (Mg) в центре и на периферии роговичных дисков, полученных у пациентов с КК.

Многие авторы считают, что в основе развития КК лежат патологические изменения межклеточного вещества стромы роговицы. В роговичных дисках пациентов с КК снижена объемная доля коллагеновых волокон и нарушено расположение пластин [8—10].

Отдельные минеральные элементы определяют качественные характеристики соединительнотканных структур и принимают непосредственное участие в модуляции активности ферментов, определяющих скорость и качество синтеза и распада коллагеновых и эластиновых волокон [11—15].

Анаболизм коллагена ферментируется такими энзимами, как гидроксилазы, лизилоксидаза и гликозилтрансферазы. Гидроксилазы пролина и лизина, участвующие в посттрансляционных модификациях коллагена, содержат в активном центре атом Fe. Cu-содержащая лизилоксидаза формирует поперечные связи коллагеновых фибрилл. Гликозилтрансферазы участвуют в гликозилировании гидроксилизина молекул коллагена и нуждаются в Mn в качестве кофактора (табл. 2) [12—15].

В реакциях катаболизма коллагена участвуют некоторые металлозависимые энзимы — коллагеназы и металлопротеиназы. Тканевая коллагеназа представляет собой металлозависимый фермент, который в активном центре содержит Zn, а матриксные металлопротеиназы — семейство внеклеточных Zn-зависимых эндопептидаз, способных разрушать все типы белков внеклеточного матрикса, в том числе коллаген (см. табл. 2) [12—15].

Модулирование биомеханики и транспорта в межклеточном веществе соединительной ткани осуществляется посредством не только коллагеновых волокон, но и основного аморфного вещества — главным образом за счет изменения физико-химических свойств мукополисахаридов: их вязкость снижается или повышается в зависимости от активности гиалуронидаз, которые могут быть ингибированы Cu и Fe (см. табл. 2) [12—15].

Известно, что роговица обладает высокой проницаемостью для кислорода и насыщается им непосредственно из воздуха окружающей среды [16—20]. Вследствие этого клетки, волокна и основное вещество роговицы подвержены действию свободного кислорода как ни одна другая структура в организме человека, а значит, нуждаются в мощной антиоксидантной защите. Супероксиддисмутазы (СОД) — группа антиоксидантных ферментов, которые защищают ткани от оксидативного стресса. В организме человека кофакторами СОД выступают или Cu в паре с Zn, или Mn. СОД1 содержится в цитоплазме, СОД2 — в митохондриях и СОД3 — в межклеточном веществе (см. табл. 2) [21].

При некоторых заболеваниях глаз выявляют нарушение минерального обмена в тканях, отводя особую роль Fe [22, 23]. Отложение пигмента нередко происходит именно в роговице. Линии Хадсона—Стэли часто обнаруживают у пожилых лиц [24, 25]. Характерным проявлением птеригиума является линия Стокера [26]. Имеются сообщения о формировании пигментированной дуги роговицы в результате оптической коррекции гиперметропии жесткими контактными линзами (ортокератология) [27, 28]. Образование пигментированных отложений в эпителии также возможно в результате хирургических вмешательств на роговице: имплантации интрастромальных роговичных колец [29], радиальной кератотомии [30], фоторефракционной кератэктомии (photorefractive keratectomy, PRK) [31] и лазерного кератомилеза (laser-assisted in situ keratomileusis, LASIK) [32]. Эпителиальное отложение Fe в зоне роговицы, смежной с фильтрационной подушкой, именуют линией Ферри [33]. При миопии выявлены нарушения минерального обмена в тканях склеры [34].

Учитывая непосредственное участие ионов металлов в физиологии межклеточного матрикса и доказанные нарушения их метаболизма в роговице при КК, можно предполагать определенную роль изменений минерального обмена в патогенезе этого заболевания. Нарушение организации основного вещества стромы роговицы в основании эктазии может приводить к нарушению транспорта ионов металлов и, как следствие, — осаждению минеральных элементов. Отсутствие минеральных элементов в зоне эктазии в свою очередь может стать причиной аномальной активности металлозависимых ферментов, что сопровождается уменьшением синтеза коллагена и нарушением организации основного вещества роговицы. Таким образом, образование кольца Флейшера в основании эктазии при КК может быть как следствием, так и причиной эктазии в границах кольца.

Согласно геохимической классификации элементов Гольдшмидта, Cu, Zn, Fe, Pb и Ni являются переходными металлами четвертого периода и принадлежат к группе халькофильных элементов. Они объединены сходными химическими свойствами, что находит отражение на диаграммах Пурбе (Eh—pH или pE/pH диаграммы). На них нанесены поля термодинамической устойчивости различных соединений (форм существования) элементов в растворах с известной молярностью, при заданной температуре и парциальном давлении газов, но при различных значениях водородного показателя (pH) по оси абсцисс и окислительно-восстановительного потенциала (Eh) по оси ординат (рис. 6).

Например, при Eh около 0 мВ, характерном для роговицы [35], и нейтральном pH, характерном для биологических сред, Fe находится в биодоступной водорастворимой форме. Увеличение pH или Eh приводит к образованию и осаждению водонерастворимых соединений Fe. Аналогичным образом ведут себя Zn, Cu, Pb и Ni.

Таким образом, осаждение элементов халькофильной группы с образованием пигментного кольца Флейшера происходит в результате изменения pH или Eh в тканях роговицы, т. е. в результате формирования физико-химического барьера в основании эктазии. Характеристические паттерны линейных профилей роговицы также свидетельствуют в пользу этого предположения. Причем такой барьер может быть как причиной, так и следствием дегенеративных и/или дистрофических процессов в тканях роговицы при КК, что наводит на мысль о сразу нескольких возможных «порочных кругах» патогенеза (рис. 7, а).

Окислительно-восстановительный потенциал отражает способность вещества присоединять электроны и увеличивается в присутствии высоких концентраций кислорода, поэтому чрезмерная проницаемость роговицы для кислорода может приводить к увеличению Eh. Учитывая тот факт, что проницаемость роговицы для кислорода регулируется преимущественно эпителием, дисфункция последнего является весьма вероятной причиной формирования физико-химического барьера в парацентральной зоне роговицы, проявляющегося в виде кольца Флейшера и ведущего к обеднению центра металлами и развитию эктазии. В то же время дисфункция эпителия и физико-химический барьер могут быть вызваны/усилены деструктивными изменениями в тканях роговицы при КК (см. рис. 7, б).

Еще одной возможной причиной повышения Eh является нарушение антиоксидантной защиты (т.е. дисфункция системы СОД на фоне недостаточности минеральных элементов), приводящее к оксидативному стрессу в тканях роговицы (см. рис. 7, в).

Что касается изменений pH в роговице, они вполне могут быть вызваны внешними факторами, такими как кислотность слезы. Повышение pH может нарушать водно-электролитный баланс и запускать процесс образования пигментного кольца c сопутствующими деструктивными изменениями [6]. В то же время pH может повышаться как раз в результате деструктивных процессов, происходящих в роговице при КК и сопровождающихся разрушением протеинов с образованием щелочных производных аммония (см. рис. 7, г).

Характер осаждения минеральных элементов в роговице при КК свидетельствует в пользу наличия некоего физико-химического барьера в ее парацентральной зоне, т. е. в зоне появления кольца Флейшера.

С одной стороны, вышеуказанный барьер в основании эктазии может формироваться в результате идиопатических дегенеративных и/или дистрофических изменений, сопровождающихся алкализацией среды и/или оксидативным стрессом. С другой стороны, такой барьер, вне зависимости от причин образования, вызывает обеднение минеральными элементами центральной зоны роговицы, нарушение метаболизма коллагена, дезорганизацию межклеточного матрикса и кератэктазию. Все вышеперечисленное поддерживает состояние, благоприятное для химического разграничения зон роговицы, порождая «порочный круг».

Таким образом, можно сделать выводы: 1) кольцо Флейшера является не только биомикроскопическим признаком КК, но и патогенетическим и/или этиологическим фактором этого заболевания, 2) однажды начавшись, патологический процесс при КК становится самоподдерживающимся.

Несмотря на трудности в изучении роговицы человека in vivo, необходимо проведение дальнейших исследований для уточнения характера и роли причинно-следственных связей в патогенезе КК.