Чеснокова Н.Б.

ФГБУ Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ, Москва

Нероев В.В.

ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва

Безнос О.В.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва, Россия

Бейшенова Г.А.

ФГБУ "МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца" Минздрава России

Никольская И.И.

Кафедра химической энзимологии химического факультета ФГБОУ ВПО "МГУ им. М.В. Ломоносова"

Кост О.А.

Кафедра химической энзимологии химического факультета ФГБОУ ВПО "МГУ им. М.В. Ломоносова"

Биневский П.В.

Кафедра химической энзимологии химического факультета ФГБОУ ВПО "МГУ им. М.В. Ломоносова"

Шехтер А.Б.

Первый МГМУ им. И.М.Сеченова

Окислительный стресс при увеите и его коррекция антиоксидантным ферментом супероксиддисмутазой (экспериментальное исследование)

Журнал: Вестник офтальмологии. 2014;130(5): 30-35

Просмотров : 11

Загрузок :

Как цитировать

Чеснокова Н. Б., Нероев В. В., Безнос О. В., Бейшенова Г. А., Никольская И. И., Кост О. А., Биневский П. В., Шехтер А. Б. Окислительный стресс при увеите и его коррекция антиоксидантным ферментом супероксиддисмутазой (экспериментальное исследование). Вестник офтальмологии. 2014;130(5):30-35.

Авторы:

Чеснокова Н.Б.

ФГБУ Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ, Москва

Все авторы (8)

При увеитах различной этиологии происходит увеличение содержания в тканях цито- и хемокинов, которые способствуют образованию свободных радикалов [1]. Увеличение количества свободных радикалов приводит к активации факторов транскрипции, в том числе NF-κВ, в результате чего увеличивается синтез медиаторов воспаления [2]. Факторы воспаления провоцируют дальнейшее увеличение количества свободных радикалов, что приводит к образованию порочного круга, развитию окислительного стресса и неконтролируемому усилению воспаления. Выявлена корреляция между тяжестью течения увеита и истощением антиоксидантных резервов глаза [3].

Контроль уровня супероксид-аниона - основного фактора, запускающего окислительный стресс, осуществляют изоферменты супероксиддисмутазы (СОД), которые присутствуют в местах образования этого радикала: в митохондриях, микросомах, цитозоле, а также в межклеточном матриксе. СОД дисмутирует супероксид-анион до перекиси водорода, которая далее инактивируется каталазой.

В ответ на развитие окислительного стресса повышается активность СОД, но уровня эндогенного фермента может быть недостаточно, тем более что СОД может инактивироваться в результате нитрования ее образующимся при окислительном стрессе пероксинитритом [4, 5].

Цель исследования - при экспериментальном увеите изучить изменение биохимических показателей во влаге передней камеры, отражающих интенсивность окислительного стресса и воспаления; оценить действие антиоксидантного фермента СОД при местном применении в виде глазных капель на характер клинического течения и локальные метаболические процессы при экспериментальном увеите у кроликов.

Материал и методы

Работа выполнена на 25 кроликах (50 глаз) породы шиншилла массой 2,0-2,5 кг. У 22 животных воспроизводили увеит путем двукратного введения нормальной лошадиной сыворотки: 1-ю дозу (5 мл) вводили подкожно, 2-ю (0,07 мл) - интравитреально на 10-е сутки после 1-й [6]. Три здоровых кролика (6 глаз) были взяты для контроля биохимических показателей.

Для лечения использовали препарат Рексод (ООО «НПП Ферментные технологии», Россия), представляющий собой рекомбинантную СОД человека.

Кролики с увеитом были разделены на две группы по 11 животных. Кроликам 1-й группы ежедневно в течение 7 дней, начиная со дня введения разрешающей дозы, проводили инстилляции раствора СОД 3 раза в день по 0,03 мл в оба глаза, 2-й группы - инстилляции плацебо (буферный раствор pH 7,4).

Клиническую оценку течения увеита проводили ежедневно путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы. В условных баллах по принятой в лаборатории шкале оценивали выраженность следующих признаков: отек и гиперемия век, бульбарной конъюнктивы и радужки, отек роговицы, вид экссудата и количество фибрина в передней камере глаза, наличие задних синехий, помутнение хрусталика.

На 4-е и 8-е сутки увеита у 4 кроликов (8 глаз) из каждой группы отбирали из каждого глаза около 0,15 мл влаги передней камеры и выводили животных из эксперимента. Водянистую влагу центрифугировали и супернатант использовали для исследований.

Определяли следующие показатели: концентрацию общего белка по Лоури [7]; антиокислительную активность в отношении гидроксильных радикалов (АОА-ОН) и супероксид-анион-радикала (АОА-О2•–) по параметрам кинетики хемилюминесценции в модельной системе Hb-H2O2-люминол [8]; активность СОД по торможению автоокисления кверцетина [9]; уровень α2-макроглобулина (α2-МГ) ферментативным методом по ингибированию активности трипсина [10]; суммарное содержание продуктов обмена монооксида азота (NO) - нитратов и нитритов с использованием реагента Грисса [11]. Проводили подсчет лейкоцитов в водянистой влаге.

Величину оптической плотности образцов измеряли на микропланшетном фотометре Synergy MX («Bio-Tek», США). Кинетику хемилюминесценции регистрировали на хемилюминометре Биотокс-7 (НПО «Энергия»). Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов программ Excel и Statistica.

На 4-е сутки у трех кроликов (6 глаз) из каждой группы энуклеировали оба глаза и провели их гистологическое исследование. Микротомные срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ препаратов проводили с использованием светового микроскопа Olympus BX51 с цифровой видеокамерой SDU («Спецтелетехника», Россия).

Результаты и обсуждение

У кроликов с увеитом без лечения на 4-е сутки течения увеита содержание белка в водянистой влаге возрастало в 40 раз по сравнению с нормой (см. таблицу)

, что является следствием увеличения проницаемости сосудов радужки и цилиарного тела.

Во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживались лейкоциты. Развивающееся воспаление и активная миграция лейкоцитов приводят к массивному выбросу активных форм кислорода [1], поэтому закономерно, что антиокислительная активность водянистой влаги по отношению к гидроксильному радикалу в острую фазу увеита значительно снижалась (до 20% от нормы) вследствие расходования эндогенных антиоксидантов на нейтрализацию высокотоксичных гидроксильных радикалов.

В то же время антиокислительная активность водянистой влаги по отношению к супероксид-анион-радикалу возрастала, по-видимому, за счет выявленного нами повышения активности СОД на 164%. Увеличение активности СОД является компенсаторной реакцией на усиление свободнорадикальных процессов и характерно для развития окислительного стресса [5]. Возрастало и содержание продуктов метаболизма NO, что связано с усилением его продукции при воспалении. Одновременное наличие в тканях большого количества супероксид-анион-радикала и радикала NO создает условия для образования высокотоксичного радикала пероксинитрита, который способен нитровать различные функциональные и структурные белки, в том числе СОД, с потерей их свойств [4, 5]. Показана и способность пероксинитрита вызывать структурные изменения в эндотелиальном слое роговицы [12, 13].

В острый период увеита в водянистой влаге значительно увеличивалась активность ингибитора протеаз α2-МГ, что можно объяснить усилением его местного синтеза клетками воспалительного инфильтрата, в частности макрофагами. Повышение активности α2-МГ характерно для процессов, затрагивающих иммунную систему, поскольку помимо ингибирования протеаз этот белок выполняет роль переносчика ряда цитокинов и антител, а также супрессивного медиатора иммунной системы [14].

У кроликов, получавших инстилляции СОД, во влаге передней камеры было значительно меньше лейкоцитов (рис. 1)

Рисунок 1. Рис. 1. Биохимические показатели во влаге передней камеры кроликов на 4-е и 7-е сутки увеита (в % от таковых у животных, получавших плацебо).
, ниже уровень α2-МГ (особенно на 7-е сутки), ниже содержание белка, что свидетельствует о менее выраженном воспалении. Антиокислительная активность по отношению к гидроксильному радикалу, напротив, оказалась на 40% выше, чем у животных, получавших плацебо, т.е. СОД способствовала увеличению антиокислительного потенциала и подавлению окислительного стресса.

На 7-е сутки течения увеита отмечалось повышение антиокислительной активности и снижение всех остальных показателей, что характерно для уменьшения интенсивности воспалительного процесса.

У нелеченных животных в течение всего периода наблюдения признаки увеита были ярко выражены: конъюнктива отечна и гиперемирована, развивался прогрессирующий отек роговицы, отек и гиперемия радужки, во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживался фибрин, формировались задние синехии, в большинстве случаев круговые, хрусталик становился диффузно мутным, стекловидное тело сквозь него не визуализировалось, позже во всех глазах развилась катаракта. На 6-7-е сутки пальпаторно определялось повышение внутриглазного давления, что свидетельствует о развитии вторичной гипертензии.

У животных, получавших инстилляции раствора СОД, клиническая картина заметно отличалась. Признаки конъюнктивита были выражены незначительно (р<0,05 по сравнению с нелеченными животными), перикорнеальная инъекция конъюнктивы - умеренно. Отек роговицы был локальным, нерезко выраженным и со временем уменьшался, как и отек радужки. Количество фибрина в передней камере было достоверно меньше (р<0,05). Во время лечения отмечались регресс задних синехий и частичное восстановление реакции зрачка на свет. Помутнение хрусталика было незначительным.

Гистологическое исследование показало, что у животных, не подвергавшихся лечению, развился выраженный панувеит. У всех животных отмечались резкое утолщение, отек и плотная нейтрофильная инфильтрация сосудистой оболочки во всех отделах глаза и отложение на ней фибринозно-гнойного экссудата. Отек и инфильтрация распространялись на ткань цилиарного тела, склеру и сетчатку. Имелась частичная деструкция пигментного эпителия сосудистой оболочки и эпителия цилиарных отростков. В роговице отмечались разрыхление коллагенового каркаса, очаговая деструкция десцеметовой мембраны и десквамация эндотелия (рис. 2)

Рисунок 2. Рис. 2. Гистологический срез роговицы кроликов на 4-е сутки экспериментального увеита. а - инстилляции плацебо; отек и разволокнение коллагеновых волокон роговицы, десквамация эндотелия, частичная деструкция десцеметовой мембраны; б - инстилляции СОД; умеренное разрыхление коллагеновых волокон роговицы, частичная десквамация эндотелия, клеточная инфильтрация отсутствует, изменения десцеметовой мембраны минимальны. Окраска гематоксилином и эозином. ×100.
, характерные для увеита [15]. В группе, получавшей инстилляции СОД, выраженность увеита была существенно меньше. Отсутствовал фибринозно-гнойный экссудат в полости глаза, сосудистая оболочка оставалась тонкой, и лишь в отдельных участках радужки и цилиарного тела отмечались отек и воспалительная инфильтрация. Эпителий роговицы не изменен, эндотелий десквамирован местами, изменения десцеметовой мембраны и стромы минимальны.

Заключение

Развитие увеита сопровождается значительными изменениями активности локальных антиокислительной, антипротеолитической систем и продукции NO. Применение антиоксидантного фермента СОД способствует нормализации биохимических показателей во влаге передней камеры и существенно улучшает клиническое течение экспериментального увеита.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Н., Н.Ч., О.К.

Сбор и обработка материала: О.Б., Г.Б., А.Ш., П.Б.

Статистическая обработка данных: О.Б.

Написание текста: О.Б.

Редактирование: Н.Ч., И.Н., О.К.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail