АГ — артериальная гипертония

АТ-II — ангиотензин II

БМК — базальная мембрана клубочка

ГС — гломерулосклероз

ДН — диабетическая нефропатия

МАУ — микроальбуминурия

НАУ — нормоальбуминурия

НУ — нефринурия

ПДУ — подоцинурия

ПУ — протеинурия

РААС — ренин-ангиотензин-альдостерновая система

СД — сахарный диабет

СД-1 — СД 1-го типа

СД-2 — СД 2-го типа

СКФ — скорость клубочковой фильтрации

ХБП — хроническая болезнь почек

HbA1c — гликированный гемоглобин

Во всем мире наблюдается стремительный рост заболеваемости сахарным диабетом (СД), принимающий характер пандемии. Согласно прогнозам Международной диабетической федерации к 2035 г. СД будут страдать 592 млн человек [1]. Россия входит в десятку стран, лидирующих по заболеваемости С.Д. Выявленная при активном скрининге истинная распространенность СД в России приблизительно в 3—4 раза больше официально зарегистрированной; СД страдают 9—10 млн человек (около 7% населения страны) [2, 3].

Самыми опасными последствиями глобальной эпидемии СД являются его системные сосудистые осложнения, в частности диабетическая нефропатия (ДН), приводящая к развитию хронической почечной недостаточности и являющаяся одной основных причин инвалидности и смертности больных СД [4, 5]. В этой связи раннее выявление нефропатии на этапе потенциально обратимых изменений в почках приобретает особую актуальность. Единственным используемым в настоящее время методом ранней диагностики ДН является определение микроальбуминурии (МАУ). Однако, как показали морфологические исследования, характерные для СД изменения в ткани почек уже выявляются у пациентов с нормальной экскрецией альбумина с мочой [6], появление МАУ свидетельствует о наличии склероза не менее чем в 20—25% нефронов, а прогрессирование до стадии протеинурии (ПУ) — о потере 50—70% клубочков [5]. Это диктует необходимость поиска более информативных неинвазивных методов ранней диагностики, мониторирования течения и оценки прогноза ДН.

В определении молекулярных механизмов и ультраструктурных изменений, ведущих к развитию МАУ/ПУ, в последние годы достигнуты заметные успехи. Подтверждена ключевая роль в этих процессах подоцитов — основных компонентов щелевой диафрагмы клубочков [7, 8]. Уточнение механизмов повреждения подоцитов при СД, их связи с метаболическими и гемодинамическими нарушениями, поиск биомаркеров, отражающих выраженность дисфункции подоцитов, являются предметом пристального внимания диабетологов и нефрологов.

Цель исследования — у больных СД с разной степенью выраженности альбуминурии/ПУ определить величину экскреции с мочой структурно-функциональных белков подоцитов (нефрина и подоцина) и уточнить значение данных мочевых показателей как ранних маркеров поражения почек и для оценки риска прогрессирования ДН.

В исследование включили 74 пациента с диагнозом СД, в том числе 30 с СД 1-го типа и 44 с СД 2-го типа, из них 37 (50%) мужчин, 37 (50%) женщин в возрасте от 18 до 80 лет. Средний возраст пациентов с СД 1-го типа составил 36,9±17,0 года, длительность основного заболевания 18,4±13,0 года. Средний возраст пациентов с СД 2-го типа составил 60,5±10,0 года, длительность заболевания — 11,5±7,5 года. Пациенты находились на обследовании и лечении в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» (ЭНЦ) МЗ РФ, в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева УКБ № 3 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. В группу контроля вошли 10 здоровых добровольцев (4 мужчин, 6 женщин в возрасте от 19 до 77 лет).

Из исследования исключали пациентов с декомпенсированным СД (уровень гликированного гемоглобина — HbA1c >10%); с ПУ более 2 г/сут; с выраженной дисфункцией почек (скорость клубочковой фильтрации — СКФ <15 мл/мин/1,73 м²); с острым воспалительным заболеванием любой этиологии на момент исследования; с острым или хроническим гломерулонефритом; с ишемической болезнью почек; с онкологической патологией, системными васкулитами, амилоидозом, сердечной недостаточностью III—IV степени (по классификации NYHA), острым нарушением мозгового кровообращения, злокачественной артериальной гипертонией (АГ) 3-й степени, беременные.

Всем больным выполняли клиническое обследование, включавшее сбор анамнеза, физическое обследование (осмотр, пальпация) с определением индекса массы тела, общеклинические анализы крови и мочи, в утренней порции мочи определяли концентрацию альбумина иммунотурбидиметрическим методом (за норму принят уровень альбумина менее 20 мг/л, МАУ — 20—200 мг/л, ПУ — более 200 мг/л) [9], в сыворотке крови оценены концентрация глюкозы, уровень HbA1c, креатинина, рассчитывали СКФ по формуле CKD-EPI, выполняли ультразвуковое исследование почек для оценки их размеров и исключения аномалии развития, нефролитиаза.

Специальным методом исследования явилось определение в утренней порции мочи уровня структурно-функциональных белков подоцитов (нефрина и подоцина) с помощью наборов для иммуноферментного анализа (ELISA Kit) производства «CUSABIO» (Китай). Утреннюю порцию мочи центрифугировали, надосадочную ее часть замораживали в аликвотах в рефрижераторе при температуре –40 °С; после завершения сбора материала пробы мочи размораживали и подвергали иммуноферментному анализу.

Результаты исследования маркеров повреждения подоцитов сравнивали в группах больных СД, различающихся по выраженности альбуминурии/ПУ: 1-я группа — 41 пациент с СД 1-го (СД-1) и СД 2-го (СД-2) типов с нормоальбуминурией (НАУ), 2-я группа — 13 больных СД-1 и СД-2 с МАУ; 3-я группа — 20 пациентов с СД-1 и СД-2 с ПУ.

АГ наблюдалась у 52 (70%) из 74 обследованных, преимущественно у больных СД-2. Коррекция А.Г. проводилась с помощью ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, блокаторов кальциевых каналов. Хроническая болезнь почек (ХБП) I стадии выявлена у 41 пациента, ХБП II стадии — у 25, ХБП III стадии — у 8.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием компьютерной программы Statistica 10,0. При анализе уровней медиаторов в моче, имеющих отличное от нормального распределение, оценивали медиану, разброс величин по отношению к медиане характеризовали показателем интерквартильного размаха (25-й процентиль; 75-й процентиль). При сравнении 2 групп использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями применяли непараметрический корреляционный анализ Спирмена. Достоверность различий частот в 2 группах оценивали с помощью критерия χ² с поправкой Йетса.

Показатели нефринурии (НУ) и подоцинурии (ПДУ), превышающие 75-й процентиль в контрольной группе (т.е. практически не встречающиеся у здоровых лиц), мы принимали за «положительные» значения (НУ+ — более 5,84 нг/мл; ПДУ+ — более 1,73 нг/мл).

НУ+ выявлялась в среднем у 69% больных СД: у 63% пациентов с НАУ, у 77% — с МАУ и у 80% — с ПУ (табл. 1). ПДУ+ выявлялась у 74% общей группы больных СД, в том числе у 78% пациентов с НАУ, у 54% с МАУ и у 83% с ПУ (см. табл. 1).

Больные СД-1 и СД-2 с НУ+ и ПДУ+ в каждой подгруппе распределились практически равномерно.

Средний уровень НУ в подгруппах больных с НАУ и МАУ не различался между СД-1 и СД-2, что, по-видимому, отражает общность механизмов повреждения подоцитов при СД: 7,06 (5,98; 7,22) и 7,03 (6,07; 7,82) нг/мл у больных СД-1 и СД-2 с НАУ соответственно (р>0,05); 9,56 (7,66; 9,56) и 6,91 (6,73; 7,06) нг/мл у пациентов с СД-1 и СД-2 с МАУ соответственно (р>0,05). При клинически явной ДН, протекающей с ПУ, экскреция нефрина с мочой была достоверно выше, чем в подгруппе с НАУ (табл.  2). НУ у пациентов с СД-1 с ПУ достоверно превышала таковую у больных СД-2 — 8,67 (8,04; 9,93) и 7,46 (7,38;7,68) нг/мл соответственно (р<0,05).

Средний уровень ПДУ в подгруппах больных с НАУ, МАУ, ПУ был одинаково высоким (см. табл. 2) и не различался между СД-1 и СД-2 — 2,5 (2,1; 2,86) и 2,7 (2,4; 3,01) нг/мл у больных СД-1 и СД-2 с НАУ соответственно (р>0,05); 2,05 (2,03; 2,45) и 2,6 (2,0; 3,27) нг/мл у пациентов с СД-1 и СД-2 с МАУ соответственно (р>0,05); 2,6 (2,12; 3,09) и 2,8 (2,2; 4,24) нг/мл при СД-1 и СД-2 с ПУ соответственно (р>0,05).

У пациентов с СД-1 выявлена прямая корреляция НУ с альбуминурией (r=0,47; р=0,03), эта связь имела бо́льшую силу и достоверность в подгруппе больных с МАУ (r=0,947; р=0,01).

Показатели НУ и ПДУ у больных СД-1 с разной выраженностью альбуминурии/ПУ прямо коррелировали с уровнем креатинина в сыворотке крови (r=0,489; р=0,009 и r=0,468; р=0,02 соответственно) и обратно — с СКФ (r=–0,461; р=0,02 для нефрина), что отражает роль повреждения подоцитов не только в нарушении проницаемости гломерулярного фильтра, но и в развитии гломерулосклероза (ГС).

У пациентов с СКФ менее 60 мл/мин (ХБП III стадии) независимо от типа СД установлена прямая взаимосвязь уровня НУ и длительности СД (r=0,73; р=0,037).

У пациентов с длительностью СД-1 и СД-2 менее 5 лет НУ коррелировала с уровнем НbА1с (r=0,84; р=0,00196), отражая важность гликемического контроля с самого начала заболевания.

На величину НУ при разной длительности СД влияла А.Г. Это более четко прослеживалось у больных СД-2, у которых АГ выявлялась не только в процессе развития ДН, но часто предшествовала развитию патологии почек. У больных данной категории нами выявлена прямая достоверная связь систолического АД с выраженностью экскреции нефрина с мочой (r=0,33; р=0,029).

В последние годы появились экспериментальные и клинические работы при СД, продемонстрировавшие тесную связь повышенной альбуминурии с ультраструктурными и функциональными нарушениями в подоцитах [8, 10, 11]. Показано, что эти изменения предшествуют выявлению МАУ и могут обнаруживаться даже при непродолжительном течении СД [7, 12, 13]. Полученные данные обусловили интерес исследователей к изучению маркеров повреждения данных клеток с целью разработки информативных методов ранней диагностики ДН и новых направлений воздействия для предупреждения прогрессирования поражения почек.

Сложное структурное устройство подоцита обеспечивает широкий набор его функций и приспособительных реакций в физиологических условиях, но в то же время делает эту клетку очень чувствительной к повреждению. В экспериментальных моделях ДН показано, что воздействие на подоциты различных факторов (гипергликемия, конечные продукты гликозилирования, компоненты активированной ренин-ангиотензин-альдостерновой системы — РААС, внутриклубочковая гипертония, окислительный стресс и др.) приводит к повреждению комплекса адгезивных белков, закрепляющих подоциты на базальной мембране клубочка (БМК), перестройке актинового цитоскелета, усиленному апоптозу подоцитов с последующим их отслоением от БМК и экскрецией с мочой как целых клеток (ПДУ), так и отдельных подоцитарных белков [7, 14—16].

По нашим данным, высокая экскреция маркеров повреждения подоцитов выявлялась рано, при еще нормальной экскреции альбумина с мочой, а при развитии МАУ и особенно ПУ частота обнаружения высокой НУ и ПДУ нарастала. Наиболее высокая НУ отмечалась при клинически явной ДН, характеризующейся развитием ПУ.

Полученные нами результаты согласуются с данными других исследований, свидетельствующими о раннем вовлечении подоцитов в процессы инициации повреждения почек при СД. В частности, A. Pätäri и соавт. [13] провели одномоментное обследование больных СД-1 и выявили методом иммуноблоттинга НУ у 30% больных СД с НАУ, у 17% — с МАУ, у 28% — с ПУ, тогда как в моче здоровых лиц нефрин не определялся. В работе B. Jim [17] НУ выявлялась у 54% больных с НАУ и у всех больных СД-2 с ПУ и МАУ. Средний уровень экскреции нефрина с мочой у пациентов с МАУ и особенно ПУ достоверно превышал таковой у пациентов с нормальной альбуминурией.

По нашим данным, у пациентов с СД-1 и СД-2 с длительностью заболевания менее 5 лет выявлялась сильная высокодостоверная связь НУ с уровнем HbA1c, что указывает на ключевую роль гипергликемии в формировании дисфункции подоцитов даже при непродолжительном течении СД, а также подчеркивает необходимость достижения оптимального контроля уровня глюкозы крови для профилактики развития и нарастания тяжести ДН.

Экспериментальные исследования убедительно показали, что повреждение подоцитов имеет первостепенное значение не только в нарушении проницаемости фильтрационного барьера, но и в формировании ГС [14]. При интенсивном или продолжительном воздействии повреждающих факторов происходит значительное слущивание подоцитов в мочевое пространство, что при ограниченной пролиферативной способности этих клеток приводит к подоцитопении. На месте потери подоцита БМК оголяется, сращивается с капсулой Шумлянского—Боумена, формируя очаги Г.С. Потеря более 40% подоцитов в клубочке приводит к развитию глобального Г.С. Кроме того, в процессе повреждения подоциты утрачивают способность экспрессировать специфические подоцитарные белки, меняют эпителиальный фенотип и начинают экспрессировать маркеры мезенхимальных клеток. Подобно фибробластам трансдифференцированные подоциты приобретают способность продуцировать матриксные белки (фибронектин, коллаген и др.), ускоряя таким образом формирование ГС и нарушение функции почек [14, 18].

На важную роль дисфункции подоцитов в механизмах прогрессирования ДН указывают и результаты нашего исследования. Так, у пациентов с СД независимо от выраженности альбуминурии/ПУ показатель экскреции с мочой нефрина прямо коррелировал с уровнем креатинина в сыворотке крови и обратно с СКФ, а у пациентов с СКФ менее 60 мл/мин выявлялась сильная прямая взаимосвязь уровня НУ с длительностью СД.

По современным представлениям, повреждающее воздействие на подоциты оказывает системная, а также внутриклубочковая гипертония, что продемонстрировано при ДН и гипертоническом нефроангиосклерозе [19—22]. Установлено, что длительное воздействие мощного гидравлического пресса приводит к механическому растяжению подоцитов, нарушению синтеза адгезивных белков, снижению экспрессии ряда структурных подоцитарных белков [23]. Кроме того, показано, что подоциты являются одним из источников синтеза компонентов РААС в почке. Под воздействием повреждающих факторов они экспрессируют рецепторы ангиотензина II (АТ-II) 1-го и 2-го типов, приобретая, таким образом, способность отвечать на действие циркулирующего АТ-II. Высокие концентрации глюкозы индуцируют синтез АТ-II самими подоцитами. Введение А.Т. в эксперименте у крыс помимо развития АГ сопровождалось апоптозом подоцитов и уменьшением экспрессии нефрина [24].

В нашем исследовании достоверная взаимосвязь АГ и выраженностью экскреции нефрина с мочой выявлялась у больных СД-2, при СД-1 она не достигала уровня статистической значимости, что, как мы полагаем, связано с большей частотой обнаружения АГ именно в группе больных СД-2. Больные СД-2 были старше, и многие из них уже имели АГ к моменту развития у них ДН.

Таким образом, у большинства (от 63 до 74%) больных СД выявляется высокая экскреция с мочой маркеров повреждения подоцитов (нефрина, подоцина), предшествующая развитию клинически значимой альбуминурии, что позволяет использовать данные мочевые тесты для ранней доклинической диагностики повреждения гломерулярного аппарата при СД.

Тесные корреляции уровня в моче биомаркеров дисфункции подоцитов (в большей степени НУ) с клиническими проявлениями поражения почек (выраженностью альбуминурии/ПУ, АГ, дисфункции почек), а также уровнем HbA1c крови раскрывают перспективы применения изученных мочевых тестов для неинвазивного мониторирования развивающихся при СД изменений клубочков почки и оценки риска их прогрессирования.