Трансформирующий β-фактор роста (англ. - transforming growth factor beta, TGF-β) - плеотропный многофункциональный цитокин, контролирующий пролиферацию и дифференцировку клеток, а также ряд других функций в большинстве из них. Известны по меньшей мере 3 изоформы данного белка, но преобладающим является TGF-β1 [1].

TGF-β придается одна из ключевых ролей в регуляции иммунного гомеостаза. Основные влияния его на иммунную систему связаны с ингибированием, в том числе пролиферации Т- и В-лимфоцитов, а также подавлением функций иммунокомпетентных клеток (цитотоксической активности T-лимфоцитов, естественных и активированных лимфокином киллеров, функциональной активации макрофагов и секреции иммуноглобулинов активированными В-лимфоцитами и цитокинов Т-лимфоцитами, экспрессии в лимфоцитах рецепторов к интерлейкинам 2 и 12, молекул MHC I и II и других костимулирующих молекул) [1, 2]. Эти эффекты могут реализоваться в снижении специфической для антигена активации и пролиферации Т-клеток. Кроме того, TGF-β инициирует апоптоз в клетках большинства типов [1].

В печени TGF-β играет важную роль в росте и дифференцировке, поддержании гомеостаза печени, терминальной дифференцировке гепатоцитов и других эпителиальных клеток и опосредованной цитокинами митогенной сигнализации [1, 3]. В физиологических условиях TGF-β регулирует реконструкцию тканей и процессы апоптоза для поддержания клеточного гомеостаза [4]. При патологических состояниях TGF-β является основным индуктором процессов фиброза, наряду с другими цитокинами определяет дифференцировку звездчатых (стеллатных) клеток в миофибробласты (Мфб), непосредственно влияет на синтез коллагенов и тканевых ингибиторов протеиназ 1-го типа [3, 5]. TGF-β1 принадлежит основная роль в организации перекрестных взаимодействий между паренхиматозными, воспалительными клетками и Мфб в условиях повреждения [3].

Основными продуцентами в печени TGF-β1 являются рекрутированные макрофаги и клетки Купфера [3]. Активирующие макрофаги стимулы, в первую очередь воспалительные, повышают высвобождение активного TGF-β1 [6].

Высокие уровни TGF-β1 описаны при различных острых и хронических заболеваниях печени. Однако его роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний печени (АИЗП) и вирусного гепатита С остается неясной.

Целью исследования явилось изучение экспрессии TGF-β1 в ткани печени у больных аутоиммунным гепатитом (АИГ), первичным билиарным циррозом (ПБЦ) и хроническим гепатитом С (ХГС).

Проведена гистологическая оценка биоптатов печени 37 пациентов с верифицированными заболеваниями печени: 12 - с АИГ, 15 - с ПБЦ и 10 - с ХГС. Диагноз АИЗП устанавливали на основании комплексного обследования согласно рекомендациям ведущих гепатологических ассоциаций. Так, диагноз АИГ подтверждали с помощью упрощенной системы, рекомендуемой Международной рабочей группой по АИГ (IAIHG), диагноз ПБЦ - на основании рекомендаций Европейской ассоциации по изучению печени (EASL) [7, 8].

Пункционную биопсию печени выполняли чрескожно иглой Менгини диаметром 1,4 мм на этапе постановки диагноза до начала назначения лечения. Все полученные образцы ткани имели длину не менее 15 мм и содержали не менее 6 портальных трактов. Для гистологического исследования полученный материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, подвергали спиртовой проводке и заливке в парафин по общепринятым методикам. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гистологическими красителями (гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону или трихромом по Массону). Иммуногистоморфометрические исследования применяли для количественной оценки экспрессии CD68 и TGF-β1 в непаренхиматозных клетках печени. Иммуногистохимические исследования выполняли с использованием моноклональных мышиных антител (TGF-β1 и CD68, «Novocastra Lab», Великобритания) и системы EnVision («DAKO», Германия). Измерения осуществляли в 15 полях зрения при увеличении 400 по каждому исследованному маркеру. Оценивали по 5 разных полей из центролобулярных отделов печеночных долек, парабазальных отделов печеночных долек и портальных трактов. Экспрессия CD68 в ткани печени наблюдалась в цитоплазме тканевых макрофагов. Уровень экспрессии CD68 определяли посредством вычисления среднего показателя абсолютного содержания CD68-позитивных клеток (CD68⁺) в изучаемых полях паренхимы печени и стромы портальных трактов. Экспрессию TGF-β1 оценивали в процентах TGF-β1-позитивных клеток от всех непаренхиматозных клеток, экспрессирующих CD68, и в абсолютном содержании в изучаемых полях. Гистологические и иммуногистохимические препараты исследовали с использованием светооптического микроскопа Zeiss AxioScope A1.

С целью унификации результатов гистологическую активность и степень выраженности фиброза, независимо от нозологии, оценивали по шкале METAVIR, исходно разработанной для гепатита С [9]. Пациенты с компенсированным циррозом печени - ЦП (6 с АИГ и 5 с ПБЦ) также были включены в исследование.

Традиционные клинические исследования, проводившиеся перед выполнением биопсии и до назначения базисной терапии, включали физическое обследование, оценку гемограммы и основных сывороточных биохимических показателей состояния печени: активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), γ-глу­тамилтранспептидазы, уровень билирубина и его фракции, общего белка и белковых фракций, а также международное нормализованное отношение (МНО).

При статистическом анализе использовали лицензионный пакет стандартных программ Statistica 6.0. Описание распределений признаков в выборках представлено в виде медиан и квартильного размаха. Для анализа качественных переменных использовали критерий &khgr;² Пирсона. Для выявления линейной зависимости между двумя величинами оценивали коэффициент корреляции Пирсона (r). Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

Анализ результатов исследования сыворотки крови показал изменения, соответствующие классической клинической картине заболеваний. При всех заболеваниях наблюдался цитолитический синдром разной степени выраженности. Кроме того, при АИГ во всех случаях наблюдалась гипергаммаглобулинемия, а у 7 (53,8%) больных - повышение активности ферментов холестаза. У всех больных ПБЦ имелись лабораторные признаки холестаза, при этом лабораторные признаки снижение белково-синтетической функции печени (повышение МНО, снижение уровня альбумина) не наблюдалось.

Некровоспалительная активность (НВА) сопоставима во всех группах: активность, соответствующая А2 по шкале METAVIR, наблюдалась в биоптатах у 5 (71,4%) больных с АИГ, у 9 (60%) - с ПБЦ, у 8 (80%) - с ХГС, у остальных выявлена активность А3 по шкале METAVIR. Стадии фиброза указаны в табл. 1.

Наиболее выраженная СD68⁺-клеточная инфильтрация во всех группах наблюдалась в строме портальных трактов. При ХГС выявлено статистически значимо более высокое абсолютное содержание в печени непаренхиматозных клеток CD68⁺ по сравнению с таковым как при АИЗП (р<0,005), так и при АИГ (р=0,013) и ПБЦ (р=0,004), а также при сравнении каждой из изучаемых зон печеночной дольки (р<0,0001) (табл. 2, см. рис. 1 на цв. вклейке).

Экспрессия TGF-β1 макрофагами CD68⁺ у пациентов с АИГ была статистически значимо выше, чем при ПБЦ (р<0,05), а также у пациентов с ХГС, чем при ПБЦ (р=0,03) (табл. 3).

Следует отметить, что при АИГ наибольшее количество макрофагов, экспрессирующих TGF-β1, было представлено в строме портальных трактов, тогда как при ХГС - в паренхиме печени, во всех изучаемых отделах печеночных долек. В то же время анализ среднего содержания TGF-β1-позитивных макрофагов в строме портальных трактов и в разных отделах печеночных долек не выявил статистически значимых различий при АИГ по сравнению с ХГС (р=0,55). При этом интенсивность экспрессии TGF-β1 CD68⁺-макрофагами стромы и паренхимы печени статистически значимо различалась в отдельных зонах ткани печени, т. е. была выражена неравномерно при различных нозологических формах. При этом отсутствовала зависимость распределения внутри дольки от стадии фиброза.

При раздельном анализе экспрессии TGF-β1 в зависимости от стадии заболевания выявлено, что частота экспрессии цитокина непаренхиматозными клетками у пациентов с АИГ (21,42±10,41%) и ПБЦ (20,7±11,07%) с ЦП статистически значимо выше, чем у пациентов c АИГ (5,96±4,46%) и ПБЦ (5,83±4,81%) без ЦП (р=0,01 и р=0,04 соответственно) (см. рис. 2 на цв. вклейке).

Взаимосвязей экспрессии TGF-β1 с биохимическими показателями сыворотки крови (АлАТ и АсАТ, ЩФ, γ-глобулины, билирубин, МНО), а также НВА в биоптате при отдельных нозологических формах и в общей группе не выявлено. При анализе в общей группе обнаружена положительная взаимосвязь стадии фиброза и абсолютного содержания TGF-β1⁺CD68⁺-клеток в портальных трактах (r=0,51).

TGF-β - важнейший цитокин, участвующий в патогенезе ряда хронических заболеваний печени на всех этапах прогрессирования заболевания от первоначального поражения печени, включая воспаление и фиброз, вплоть до ЦП и гепатоцеллюлярной карциномы [10]. Общепринято мнение, которое основано на большом количестве данных, полученных на культурах клеток и животных моделях повреждения печени, что TGF-β1 играет ведущую роль в процессе формирования фиброза в печени, а ослабление связанных с TGF-β сигнальных путей уменьшает процесс фиброгенеза [10]. При патологических состояниях TGF-β1 во взаимодействии с другими цитокинами определяет активацию фиброгенных Мфб, в ответ на повреждение вызывает активацию гладкомышечного α-ак­тина и секрецию белков внеклеточного матрикса [3].

В нашем исследовании экспрессия TGF-β1 в непаренхиматозных клетках у пациентов с ЦП, развившемся вследствие аутоиммунного заболевания, статистически значимо выше, чем у пациентов, выраженность фиброза печени у которых не достигала стадии цирроза. Эти результаты подтверждают связь TGF-β1 с прогрессированием фиброза печени.

В то же время TGF-β1 - ключевой регулятор иммунного гомеостаза [11]. Считается, что недостаток TGF-β1 или резистентность к нему могут вызывать аутоиммунное заболевание путем влияния на многие иммунологические процессы, включая активацию и дифференцировку лимфоцитов, экспрессию молекул клеточной адгезии, функционирование Т-супрессоров, экспрессию молекул МНС и цитокинов, а также апоптоза клеток [12].

В нашем исследовании экспрессия TGF-β1 печеночными макрофагами статистически значимо выше у пациентов с ХГС, чем с ПБЦ, но не отличалась от экспрессии при АИГ. В некоторых работах обсуждается роль секреции TGF-β1 в репликации вируса гепатита С, а также в фиброгенезе при ХГС. Предполагается, что некоторые белки вируса гепатита С, такие как капсидный белок и NS5A, изменяют передачу сигнала от инфицированных гепатоцитов, а это приводит к выработке профиброгенных медиаторов, в частности TGF-β1 [13]. Наблюдаемое нами увеличение содержания в паренхиме печени клеток, несущих CD68 (универсальный маркер макрофагов), при ХГС описано и ранее. Считается, что активная макрофагальная реакция, проявляющаяся в экспрессии CD68, коррелирует с активностью повреждения печени при ХГС [14, 15]. При ХГС мы наблюдали наиболее высокое абсолютное содержание макрофагов CD68⁺, экспрессирующих TGF-β1. В то же время при АИГ отмечена наиболее высокая частота экспрессии TGF-β1 клетками CD68⁺.

Несмотря на активное изучение TGF-β1 при патологии печени, его тканевая экспрессия у пациентов с АИЗП определялась в единичных исследованиях [16, 17]. Нами впервые проведена сравнительная оценка экспрессии TGF-β1 в непаренхиматозных клетках печени у пациентов с АИГ и ПБЦ. Мы наблюдали, что экспрессия TGF-β1 макрофагами CD68⁺ статистически значимо выше при АИГ, чем при ПБЦ.

В исследовании E. Bayer и соавт. [16] выявлена выраженная экспрессия TGF-β1 в печени при АИГ, которая коррелировала с активностью заболевания. Известно, что TGF-β блокирует иммунный ответ по крайней мере двумя известными путями: подавлением функции воспалительных клеток и активацией функций регуляторных Т-лимфоцитов. Дефекты сигнальных путей TGF-β обусловливают усиление пролиферации и эффекторной функции иммунных клеток и могут привести к неуправляемому иммунному ответу [18]. По мнению A. Lohse [11], сочетание высокой активности воспаления и стремительного прогрессирования фиброза при гепатитах (особенно АИГ) может быть следствием избыточной (в том числе компенсаторной) выработки TGF-β в условиях повреждения дальнейшего сигнального пути. Эта точка зрения косвенно подтверждается тем, что на животных моделях восприимчивость к экспериментальному АИГ увеличивается у трансгенных мышей, негативных по рецептору TGF-β II [19]. Однако глюкокортикостероиды, используемые при лечении больных АИГ и обеспечивающие подавление не только НВА, но и регрессию фиброза при данном заболевании [20], в культуре клеток снижают экспрессию TGF-β звездчатыми клетками [21]. Мы полагаем, что компенсаторная экспрессия TGF-β1 может быть вызвана нарушением передачи дальнейшего сигнала от этого цитокина, приводящее к неконтролируемому иммунному ответу, и обеспечивает быстрое развитие фиброза при АИГ.

Интересной находкой явилось то, что при АИГ экспрессия TGF-β1 обеспечивалась преимущественно макрофагами, расположенными в портальных трактах, а при ХГС - внутри печеночных долек. Различия по распределению экспрессирующих клеток связаны, вероятно, с тем, что при аутоиммунных заболеваниях печени некровоспалительный процесс ограничивается преимущественно перипортальной зоной, происходит как преимущественно перипортальный, а при длительном течении ХГС поражение является более распространенным.

Данные, полученные на моделях животных, показали, что повреждение сигнальных путей TGF-β имеется в патогенезе ПБЦ [22]. А. Voumvouraki и соавт. [22] показали, что для ПБЦ характерно увеличение содержания TGF-β3 и не нашли различий по экспрессии TGF-β1 в ткани печени при ПБЦ и ХГС. В отличие от этих авторов, мы наблюдали, что экспрессия TGF-β1 в СD68⁺-макро­фагах ниже у пациентов с ПБЦ, чем при ХГС.

Можно предположить, что выявленные различия по экспрессии TGF-β1 могут отражать различия в патогенезе заболеваний с потенциально различными клетками-мишенями: гепатоциты (АИГ и ХГС) и холангиоциты (ПБЦ). Возможно, что при ПБЦ нарушения иммунного контроля данным цитокином не играют столь важной роли, как при гепатитах.

Увеличение экспрессии TGF-β1 в ткани печени у пациентов с АИГ и ПБЦ в стадии цирроза подтверждает роль данного цитокина в фиброгенезе при аутоиммунных заболеваниях печени.

Выявленные различия по интенсивности и локализации экспрессии TGF-β1 клетками СD68⁺ при гепатитах разной этиологии и ПБЦ отражают особенности механизмов повреждений. Мы предполагаем, что нарушения в TGF-β1-связанных сигнальных путях могут играть важную роль в патогенезе различных гепатитов. Сложный характер межклеточных взаимодействий в печени предполагает возможность развития и других, дополнительных цитокиновых сигналов индукции воспаления, апоптоза и фиброгенеза при данных заболеваниях.