Определение органной и видовой принадлежности микрочастиц печени методами судебно-медицинской цитологии и количественного твердофазного иммуноферментного анализа

Определение органной и видовой принадлежности клеток и микрочастиц, обнаруженных на орудиях травмы, является важным компонентом исследования при проведении судебно-медицинских цитологических экспертиз. Вероятность выявления клеток и микрочастиц печени на орудиях механической травмы (колющих и колюще-режущих) при повреждении указанного органа, по данным А.Л. Федоровцева и соавт., составляет около 10,8% [1].

План проведения полного судебно-цитологического исследования включает в себя поиск и обнаружение клеток и микрочастиц ткани с сохраненной тканевой структурой (после флюорохромирования красителями акрихинового ряда), определение их половой принадлежности по X- и Y-хроматину, установление принадлежности человеку и выявление антигенов системы АВО с помощью реакции смешанной агглютинации [2].

Необходимо отметить, что актуальными задачами судебно-медицинской экспертизы в настоящее время являются широкое внедрение в повседневную практику работы судебно-экспертных организаций высокочувствительных количественных методов исследования биологических объектов и разработка методов внутрилабораторного контроля качества [3—12].

В нашей стране для определения видовой принадлежности биологических объектов, в том числе микрочастиц тканей животного происхождения, были разработаны усовершенствованные варианты количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием отечественных тест-наборов для иммуноферментного определения иммуноглобулина общего (IgG_общ) «IgG-общий-ИФА-БЕСТ» и «IgG-общий-ИФА-ХЕМА» [13—18].

Цель исследования заключалась в установлении органной принадлежности микрочастиц ткани печени судебно-цитологическим методом по морфологическим характеристикам гепатоцитов и определении их видовой принадлежности по IgG_общ человека методом количественного твердофазного ИФА.

Материалом исследования являлись микрочастицы (размерами от 0,2×0,1 до 0,2×0,3 см) печеночной ткани, взятых от трупов 8 человек (объекты №№ 1—8), скончавшихся скоропостижно без признаков заболеваний печени. Исследование образцов производили судебно-цитологическим методом и методом количественного ИФА с помощью тест-набора «IgG-общий-ИФА-ХЕМА». Для материально-технического обеспечения цитологического исследования использовали стереомикроскоп, световой микроскоп, люминесцентный микроскоп, центрифугу, растворы флуорохромов (акрихин и акридиновый оранжевый), раствор азура и эозина, 25% раствор уксусной кислоты, предметные стекла, пробирки, препаровальные иглы. Для материально-технического обеспечения метода ИФА использовали: 96-луночный полистирольный планшет с иммобилизованными антителами анти-IgG человека, вошер медицинский микропланшетный, шейкер термостатируемый, ридер — аппарат для фотометрического учета результатов реакции с программным обеспечением.

Исследуемые биологические объекты — предварительно высушенные микрочастицы печеночной ткани — помещали по отдельности в пробирки, заливали 25% раствором уксусной кислоты и выдерживали при комнатной температуре в течение 48 ч. По истечении указанного времени после центрифугирования и удаления надосадочной жидкости осадки отмывали 10% раствором уксусной кислоты 4 раза. Ресуспензированные осадки переносили на обезжиренные предметные стекла, высушивали при комнатной температуре и в течение 10 мин фиксировали этиловым спиртом. Затем микрочастицы из пробирок переносили на обезжиренные предметные стекла в капле уксусной кислоты и под контролем стереомикроскопа разделяли препаровальной иглой на мелкие фрагменты, которые раздавливали между двумя предметными стеклами и, не разъединяя стекла, оставляли на 24 ч до полного высыхания. Далее стекла разъединяли с помощью скальпеля, препараты в течение 10 мин фиксировали этиловым спиртом.

После фиксации препараты окрашивали раствором акрихина (разведение 1:2), с последующим перекрашиванием 0,01% раствором акридинового оранжевого, приготовленным на фосфатном буфере pH 6,0. Микроскопическое исследование препаратов, окрашенных флуорохромами, проводили при увеличении ×400 с использованием водной иммерсии в люминесцентном режиме. Препараты окрашивали также азур-эозиновой смесью, а затем исследовали с помощью светового микроскопа с увеличением ×400.

Количественный твердофазный ИФА с целью установления видовой принадлежности исследуемых микрочастиц ткани печени по IgG_общ проводился по стандартному алгоритму [19].

Предварительно исследуемые микрочастицы печеночной ткани измельчали, после чего экстрагировали дистиллированной водой в pH 7,4 в течение 18 ч в условиях бытового холодильника (при температуре 4—5 °C). В лунки 96-луночного полистирольного планшета с иммобилизованными антителами анти-IgG человека добавляли по 90 мкл рабочего раствора для разведения сывороток (вытяжек). После чего в лунки добавляли по 10,0 мкл вытяжек из исследуемого материала, по 10,0 мкл отрицательного контроля (раствор, используемый для экстрагирования вытяжек, и стандартная калибровочная проба 0 мг/мл IgG_общ), по 10,0 мкл стандартных калибровочных проб для расчета концентрации (от 1,00 до 25,00 мг/мл IgG_общ), по 10,0 мкл контрольной сыворотки, содержащей IgG_общ. Время инкубации — 30 мин при температуре 37 °C на шейкере ST-3. После 5-кратного отмывания на вошере hydro FLEX в лунки добавляли по 100 мкл конъюгата (антитела анти-IgG_общ, меченые пероксидазой хрена) и вновь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °C на шейкере ST-3. Затем 5-кратно отмывали с помощью вошера hydro FLEX. Образовавшийся комплекс выявляли ферментативной реакцией с использованием раствора тетраметилбензидина. Оптическую плотность продуктов реакции, а также концентрацию IgG_общ измеряли фотометрически на ридере infinite F50.

При проведении микроскопического исследования в изготовленных препаратах обнаружены гепатоциты, располагающиеся как изолировано, так и в комплексах. Длина клеток составляла от 18 до 40 мкм. Изолированные гепатоциты в исследованных препаратах — неправильной округлой, продолговатой или неправильной многоугольной формы. Такой полиморфизм характерен и для клеточных комплексов. Цитоплазма многих клеток — с базофильным оттенком грубозернистого вида и единичными вакуолями. Ядра округлые или овальные размерами 7—10 мкм, расположены центрально или эксцентрично. Встречались гепатоциты с двумя ядрами. При флюорохромировании препаратов раствором акрихина цитоплазма люминесцирует зеленым светом, ядра гепатоцитов приобретают ярко-зеленое свечение. При окраске раствором АО цитоплазма клеток грубозернистая, красновато-оранжевая, ядра люминесцируют желто-зеленым светом.

Окрашенные флуорохромами (акрихин, акридиновый оранжевый) и азур-эозиновой смесью цитологические препараты фотографировали с помощью цифровой фотокамеры, сопряженной с микроскопом (рис. 1—4 на цв. вклейке).

Рис. 1. Комплексы гепатоцитов.

а — окраска акрихином, ув. ×400; б — окраска акридиновым оранжевым, ув. ×400.

Рис. 2. Гепатоциты. Окраска азуром и эозином, ув. ×400 (а—г).

Рис. 3. Гепатоциты. Окраска акрихином, ув. ×400 (а—г).

Рис. 4. Гепатоциты. Окраска акридиновым оранжевым, ув. ×400 (а—г).

В калибровочных пробах, прилагаемых к набору (в образцах с заведомо известной концентрацией IgG_общ), определяли оптическую плотность, после чего по 6 точкам с помощью программного обеспечения строили калибровочную кривую. Данная кривая являлась основой для последующего определения концентрации IgG_общ в исследуемых пробах. Проведенное исследование позволило установить, что концентрация IgG_общ в экстрактах из микрочастиц печеночной ткани от 8 трупов составила от 32,608±0,171 мг/мл (объект №4) до 34,436±0,343 мг/мл (объект №1), оптическая плотность имела значение от 2,962±0,015 усл. ед. (объект №7) до 3,206±0,018 усл. ед. (объект №1), оптическая плотность минимального значения калибровочной пробы составила 0,078±0,010 усл. ед., максимальная калибровочная проба — 2,372±0,019 усл. ед. (см. таблицу).

Значения оптической плотности и концентрации IgG_общ в цельных экстрактах из микрочастиц печени (M±m)

Таким образом, установленные оптимальные значения калибровочных проб позволяют учитывать их в практической экспертной работе при использовании количественного ИФА для установления видовой принадлежности микрочастиц печеночной ткани.

В результате проведенного судебно-цитологического исследования продемонстрирована возможность установления органной принадлежности микрочастиц печени по морфологическим характеристикам гепатоцитов, окрашенных флуорохромами и азур-эозиновой смесью. Предложен вариант применения количественного ИФА для установления видовой принадлежности микрочастиц печени по IgG_общ человека, определены показатели оптической плотности и концентрации, подобраны оптимальные значения минимальных и максимальных калибровочных проб, необходимые в практической работе.

Установленные величины оптической плотности, концентрации IgG_общ, оптимальные значения калибровочных проб, а также иллюстративный ряд, демонстрирующий полиморфизм гепатоцитов, могут быть использованы экспертами судебно-биологических подразделений для установления органной и видовой принадлежности микрочастиц печени, обнаруженных на орудиях травмы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.