Введение
Производные имидазола, такие как клонидин, моксонидин, тизанидин (международные непатентованные наименования), широко применяются в качестве лекарственных средств и обладают высокой фармакологической активностью. При этом с терапевтическими целями они используются в низких дозировках и, соответственно, в биологических средах находятся в незначительных концентрациях, что представляет определенные трудности для обнаружения фактов употребления этих веществ при химико-токсикологическом определении.
По данным литературы, отравления клонидином, моксонидином и тизанидином встречаются относительно часто, причем не редко в сочетании с прочими фармакологически активными веществами [1—11]. При этом крайне редко исследователи проводили количественную оценку содержания моксонидина и тизанидина в крови, ограничиваясь качественной идентификацией веществ, чаще всего в моче, и описанием клинической картины отравлений.
В доступной литературе был проведен поиск данных о терапевтических, токсических и летальных концентрациях рассматриваемых лекарственных веществ в крови (табл. 1).
Таблица 1. Терапевтические, токсические и летальные концентрации клонидина, моксонидина, тизанидина в крови (сыворотке, плазме)
| Соединение | Концентрация в крови, нг/мл | |||
| терапевтическая | токсическая | летальная | исследование | |
| Клонидин | 0,22—6,3 | 6,4—27,0 | >27,0 | [12] |
| Моксонидин | 1—2 (4) | Н.д. | Н.д. | [12] |
| Тизанидин | 3,2—25,8 | Н.д. | 2340,0 | [3, 12, 13] |
Примечание. Н.д. — нет данных.
Из табл. 1 видно, что для моксонидина данных о его токсических и летальных концентрациях не найдено, также отсутствуют данные по токсическим концентрациям в крови для тизанидина.
С учетом этого факта, важным является наличие в арсенале лабораторных методов, позволяющих надежно идентифицировать и количественно оценивать содержание фармакологически высокоактивных производных имидазола в биологических средах организма человека.
В периодической литературе описаны методы количественного определения клонидина с использованием газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата [14—16] и масс-спектрометрического детектирования [17—19]. Газохроматографическое определение с масс-спектрометрией приведено для моксонидина [20] и тизанидина [3].
Цель работы — разработка унифицированного метода газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) определения производных имидазола в крови для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.
Материал и методы
Материалы
Использовали газовый хроматограф Agilent 7820 с масс-спектрометрическим детектором Agilent 5975, автосамплером Agilent 7683, капиллярной колонкой НР-5MS диаметром 0,25 мм и длиной 30 м (Agilent, США); термоблок ПЭ-4030, одноканальный испаритель ПЭ-2300, встряхиватель медицинский вибрационный типа «Вортекс» V-3 (СИА «ЭЛМИ», Латвия); вакуумный коллектор VisiprepT SPE (Supelco, США) с насосом низкого вакуума (AIR CADET, США); СВЧ-печь бытовую Supra MWS1824SW (Россия); набор механических дозаторов разного объема. Картриджи SampliQ EVIDEX (200 мг/3 мл) (Agilent, США). Все используемые растворители и реактивы имели градацию «х.ч.». Также использовали калия карбонат, высушенный при 180 °C в течение 2 ч, хранится в эксикаторе; субстанцию клонидина гидрохлорида (стандартный образец ГСО 12002-2022, ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия), субстанцию моксонидина (Macklin, Китай), субстанцию тизанидина гидрохлорида (Macklin, Китай).
Пробоподготовка
Изолирование клонидина, моксонидина, тизанидина из крови. К 0,5 мл интактной крови во флаконе вносили спиртовые растворы клонидина гидрохлорида в пересчете на основание из расчета 1, 5, 10, 20 нг/мл; моксонидина и тизанидина по 1, 5, 10, 25 нг/мл и 20 мкл раствора внутреннего стандарта (раствор пара-йодоклонидина гидрохлорида в спирте с концентрацией 1 мкг/мл), добавляли 2 мл 0,067 М буфера фосфатного (pH 6,0). Флакон укупоривали, помещали в ультразвуковую баню на 5 мин. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин, центрифугат отделяли от осадка.
Процедура твердофазной экстракции (ТФЭ). Кондиционирование сорбента картриджа — 2 мл 95% этанола, 2 мл 0,067 М буфера фосфатного (pH 6,0). Загрузку образца производили со скоростью не более 1 мл/мин. Промывку сорбента картриджа — со скоростью потока 2—3 мл/мин (последовательно): 1 мл 0,067 М буфера фосфатного (pH 6,0), 1 мл 0,1 М кислоты уксусной, 1 мл 10% этанола. Сушку картриджа осуществляли под вакуумом 10 мин. Промывку картриджа проводили 2 мл смеси «н-гексан — этилацетат» (3:1) двукратно. Элюирование 2 мл смеси «дихлорметан — изо-пропанол — 25% аммиак» (4:1:0,1) выполняли двукратно, элюат испаряли в токе азота при 60 °C.
Дериватизация. К сухому остатку во флаконе прибавляли 0,5 мл ацетона, перемешивали на встряхивателе в течение 30 с и переносили в реакционную виалу на 2 мл, в которую предварительно помещали 20—30 мг калия карбоната. Далее в виалу вносили 10 мкл пентафторбензилбромида и перемешивали. Виалу плотно закрывали. Затем дериватизационную смесь подвергали СВЧ-излучению мощностью 560 Вт в течение 4 мин. После охлаждения виалу вскрывали, ацетоновые растворы переносили в стеклянный флакон объемом 10 мл, испаряли в токе теплого воздуха.
Исследование ГХ-МС
Сухие остатки растворяли в 100 мкл этилацетата, перемешивали на микровстряхивателе в течение 30 с, и 2 мкл вводили в испаритель хромато-масс-спектрометра. Ввод пробы осуществляли с использованием устройства автоматического ввода проб.
Ввод пробы проводили в режиме split/splitless (задержка включения деления потока газа-носителя после ввода пробы 0,8 мин). Скорость потока газа носителя (гелий) через колонку составляла 1,5 мл/мин. Температура испарителя и интерфейса детектора — 240 и 280 °C соответственно, температура колонки — градиент 120 °C (1 мин) — 225 °C (скорость программирования 35° в минуту, прогрев до 240 °C, скорость программирования 3° в минуту, выдержка 2 мин, затем прогрев до 300 °C, скорость программирования 15° в минуту, выдержка 1 мин).
Применяли следующий режим работы детектора: селективный ионный мониторинг (SIM) или регистрацию полного ионного тока m/z от 42 до 600 Да (TIC).
Градуировочный график строили методом внутреннего стандарта в режиме селективного ионного мониторинга. Для каждой концентрации градуировочного графика проводили исследование двух параллельных проб крови. Данные отношения масса-заряд, временное окно ионного профиля, время и индекс удерживания приведены в табл. 2.
Таблица 2. Идентификационные характеристики производных лекарственных веществ и внутреннего стандарта
| Производное соединения | m/z и интенсивности основных ионов (%) | Интервал регистрации ионов, мин | Время удерживания, мин | RI | ||
| Клонидин | 354 | 356 (33) | 389 (9) | 10,00—10,80 | 10,51 | 2525 |
| Моксонидин | 366 | 244 (24) | 401 (15) | 10,80—12,50 | 11,10 | 2560 |
| Тизанидин | 378 | 244 (26) | 350 (20) | 12,50—14,55 | 14,34 | 2905 |
| Пара-йодоклонидин | 480 | 482 (32) | 515 (8) | 14,55—15,50 | 14,71 | 2940 |
Коэффициенты корреляции (r2) градуировочного графика составили: для клонидина — r2=0,9921, для моксонидина — r2=0,9882, для тизанидина — r2=0,9958.
Программное обеспечение исследований
В исследовании использовали: программы ChemStation G1701DA и AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST) для обработки хроматограмм с целью идентификации компонентов проб; с помощью MS Excel проводили статистическую обработку полученных результатов; пакет программ ACD/Labs v6.0 (Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada) — для расчетов физико-химических констант (LogP, KOC).
Результаты
Структуры анализируемых соединений и внутренний стандарт для их определения приведены на рис. 1.
Рис. 1. Структурные формулы клонидина (1), моксонидина (2), тизанидина (3), пара-йодклонидина (4).
Для прогнозирования поведения изучаемых производных имидазола в процессе ТФЭ проводили расчет их физико-химических констант: константы диссоциации (рКа) и липофильности (logP). Результаты проведенных расчетов, а также найденные в литературе величины рКа и липофильности, представлены в табл. 3.
Таблица 3. Константы диссоциации и липофильности клонидина, моксонидина, тизанидина
| Лекарственные препараты | Данные литературы | Расчетные данные | ||
| pKa | LogP | pKa | LogP | |
| Клонидин | 8,05 | 1,59 | 10,38 | 1,41 |
| Моксонидин | — | — | 9,94 | 0,91 |
| Тизанидин | — | — | 10,07 | 0,65 |
Из расчетных данных следует, что все соединения являются низколипофильными основаниями.
Изолирование из биологического материала проводили с использованием ТФЭ, применяя сорбент со смешанной фазой по разработанной авторами [21, 22] методике скрининга лекарственных веществ и наркотических средств в крови. Для более сильного удерживания ионообменным сорбентом целевых аналитов, процесс ТФЭ был дополнен промывкой патронов раствором уксусной кислоты.
После изолирования из крови для идентификации рассматриваемых лекарственных соединений получали производные по аналогии с методом, приведенным в работах P.O. Edlund и соавт. [14, 15], с использованием в качестве дериватизирующего агента пентафторбензилбромида, в качестве внутреннего стандарта применяли пара-йодклонидин [19].
Также, вместо термической дериватизации (конвенциального нагревания), предложенной P.O. Edlund, был выбран вариант обработки проб микроволновым излучением для получения дериватов по схеме рис. 2 (на примере клонидина):
Рис. 2. Схема дериватизации клонидина пентафторбензилбромидом.
Использование СВЧ-излучения позволяло значительно сократить затраты времени на проведение процедуры дериватизации с 30 до 4 мин, в сравнении с применением для этих целей термоблока.
На рис. 3 представлены масс-спектры полученных производных клонидина, моксонидина, тизанидина.
Рис. 3. Масс-спектры ПФБ-производных клонидина (а), моксонидина (б), тизанидина (в).
В процессе исследования было установлено, что вследствие газохроматографического анализа при высоких температурах производное моксонидина образует теплоизомер (артефакт): так, на лабильность аддукта моксонидина влияли температура испарителя и режим программирования печи колонки хроматографа. По этой причине было изучено влияние на образование артефакта аддукта моксонидина таких параметров, как температура испарителя и режима программирования печи колонки.
Влияние температуры испарителя, соотношение площадей пиков моксонидина и его артефакта представлены в табл. 4.
Таблица 4. Влияние температуры испарителя и режима программирования печи колонки (отношение площади пика артефакта и производного моксонидина, %)
| Режим программирования температуры печи колонки | Температура испарителя | ||
| 240 °C | 250 °C | 280 °C | |
| Метод 1 [19] | 0,5% | 1,3% | 10,7% |
| Метод 2 (разработанный) | 0,66% | Н.о. | 11,5% |
Примечание. Н.о. — не обнаружен.
Из данных табл. 4 видно, что при температуре инжектора выше 240 °C возрастает количество теплоизомера производного моксонидина.
Режим программирования печи колонки газового хроматографа подбирали таким образом, чтобы время выхода аддукта моксонидина соответствовало интервалу температур 240—245 °C, при которых наблюдается минимум образования артефакта.
Предел обнаружения разработанного метода при соотношении «сигнал—шум» как 3:1 в режиме селективного мониторинга для клонидина составил 0,31 нг/мл, для моксонидина и тизанидина — 0,31 и 0,23 нг/мл соответственно. Данные значения пределов обнаружения позволяют надежно выявлять приведенные соединения на уровне субтерапевтических концентраций. Соответственно, разработанный метод позволяет как проводить терапевтический мониторинг применения данных соединений, так и выявлять случаи передозировки и отравлений ими.
Выводы
1. Разработаны условия для химико-токсикологического определения клонидина, моксонидина, тизанидина в крови с использованием ТФЭ со смешанной фазой, усиленной дополнительной промывкой патронов уксусной кислотой, с использованием в качестве дериватизирующего агента пентафторбензилбромида, микроволновым излучением для получения дериватов и газовой хроматографии с масс-селективным детектированием.
2. Впервые приведены газохроматографические и масс-спектрометрические данные для производных моксонидина и тизанидина с пентафторбензилбромидом.
3. Установлено, что вследствие газохроматографического анализа при высоких температурах производное моксонидина образует теплоизомер (артефакт). Подобран интервал температур 240—245 °C для газохроматографического определения производного моксонидина с пентафторбензилбромидом.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.