Введение

В настоящее время методология установления органно-тканевой и видовой принадлежности клеток и микрочастиц, обнаруженных на вещественных доказательствах, в том числе на орудиях травмы, продолжает совершенствоваться, создаются новые алгоритмы экспертных исследований, включающие в себя комплексное применение как традиционных, так и высокотехнологичных количественных методов [1].

Потребность в определении тканевой и видовой принадлежности микрочастиц гиалинового хряща, к которому относятся хрящи трахеи, гортани, воздухоносных путей, ребер, суставных поверхностей костей, как правило, возникает в процессе производства судебно-цитологических экспертиз, когда на исследование представлены острые предметы (ножи, пилы, топоры), которыми могли быть причинены посмертные повреждения при расчленении трупов.

Гиалиновый хрящ состоит из хрящевых клеток (хондроцитов) и межклеточного вещества. Располагаются хрящевые клетки в особых полостях в межклеточном веществе в одиночку или группами про две клетки и более. Иногда группы клеток лежат в общей полости. Эти клеточные группы получили название изогенных. Клетки целиком выполняют хрящевые полости и вплотную прилегают своей поверхностью к межклеточному веществу. Клетки имеют разнообразную форму: в глубине хряща они округлые или овальные, а ближе к поверхности имеют веретеновидную форму или даже сплющены параллельно поверхности хряща. Форма хрящевых клеток зависит от состояния межклеточного вещества. В каждой клетке имеется сравнительно большое округлое ядро. С поверхности хрящ покрыт надхрящницей, состоящей из плотной волокнистой соединительной ткани, в которой обнаруживаются коллагеновые и эластические волокна, а также веретеновидные клетки, морфологически сходные с фибробластами.

Установление тканевой принадлежности поступивших для исследования в судебно-биологическое подразделение частиц биологического происхождения, например на орудиях травмы (преимущественно рубящих и пилящих), следует начинать с их тщательного осмотра при естественном и смешанном освещении. При этом могут быть обнаружены микрочастицы беловатого или желтоватого цветов. Приготовление препаратов и исследование проводят по стандартной методике, принятой в судебной цитологии.

Количественный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) для установления видовой принадлежности биологических объектов по общему иммуноглобулину G (IgG_общ) начали использовать в судебно-медицинских целях в ряде лабораторий западных стран с конца XX века [2, 3]. В Российской Федерации для определения видовой принадлежности биологических объектов также были разработаны усовершенствованные варианты ИФА с использованием отечественных тест-наборов для иммуноферментного определения IgG_общ человека: «IgG-общий-ИФА-БЕСТ» и «IgG общий-ИФА-ХЕМА» (регистрационное удостоверение на медицинское изделие от 05.09.2016 №ФСЗ 2007/00335) [4—7].

Постоянное совершенствование и широкое внедрение в повседневную практику работы судебно-биологических подразделений государственных судебно-экспертных учреждений РФ современных методов исследования биологических объектов, в том числе количественного ИФА и колориметрии, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью, в настоящее время является актуальной задачей судебно-медицинской экспертизы [8—18].

Цель исследования — выявление и демонстрация полиморфизма клеточных элементов в образцах (микрочастицах) гиалинового хряща методами, применяемыми в судебно-медицинской цитологии, и установление видовой принадлежности микрочастиц гиалиновой хрящевой ткани по IgG_общ методом количественного твердофазного ИФА с помощью набора «IgG-общий-ИФА-ХЕМА».

Материал и методы

Материалом исследования являлись микрочастицы (размеры от 0,2×0,1 до 0,2×0,3 см) гиалиновой хрящевой ткани человека (давность взятия образцов от 2 нед до 2 мес). Исследование образцов производили судебно-цитологическим методом и методом количественного ИФА с помощью тест-набора «IgG-общий-ИФА-ХЕМА». Для материально-технического обеспечения цитологического исследования использовали стереомикроскоп, световой микроскоп, люминесцентный микроскоп, центрифугу, растворы флюорохромов: акридинпропилиприт (акрихин) и акридиновый оранжевый, 25% раствор уксусной кислоты, предметные стекла, пробирки, препаровальные иглы. Для материально-технического обеспечения метода ИФА применяли: 96-луночный полистирольный планшет с иммобилизованными антителами анти-IgG человека, вошер медицинский микропланшетный, шейкер термостатируемый, ридер — аппарат для фотометрического учета результатов реакции с программным обеспечением.

Ход исследования. Исследуемые биологические объекты — микрочастицы гиалинового хряща — помещали по отдельности в пробирки, заливали 25% раствором уксусной кислоты и выдерживали при комнатной температуре в течение 48 ч. По истечении указанного времени после центрифугирования и удаления надосадочной жидкости осадки отмывали 10% раствором уксусной кислоты 4 раза. Ресуспензированные осадки переносили на обезжиренные предметные стекла, высушивали при комнатной температуре и в течение 10 мин фиксировали этиловым спиртом. Затем микрочастицы из пробирок переносили на обезжиренные предметные стекла в капле уксусной кислоты и под контролем стереомикроскопа разделяли препаровальной иглой на мелкие фрагменты, которые раздавливали между двумя предметными стеклами и, не разъединяя стекла, оставляли их на 24 ч до полного высыхания. Далее стекла разъединяли с помощью скальпеля, препараты в течение 10 мин фиксировали этиловым спиртом.

После фиксации препараты окрашивали раствором акридинпропилиприта (разведение 1:2), с последующим перекрашиванием 0,01% раствором акридинового оранжевого, приготовленным на фосфатном буфере pH 6,0. Микроскопическое исследование проводили при увеличении ×400 с использованием водной иммерсии в люминесцентном режиме.

Количественный твердофазный ИФА с целью установления видовой принадлежности микрочастиц гиалиновой хрящевой ткани по IgG_общ проводили по стандартному алгоритму (рис. 1, на цв. вклейке).

Рис. 1. Схема проведения количественного твердофазного иммуноферментного анализа по установлению видовой принадлежности микрочастиц гиалинового хряща.

Предварительно исследуемые микрочастицы гиалинового хряща измельчали, после чего экстрагировали дистиллированной водой pH 7,4 в течение 18 ч в условиях бытового холодильника (при температуре +4—5 ˚C). В лунки 96-луночного полистирольного планшета с иммобилизованными антителами анти-IgG человека добавляли по 90 мкл рабочего раствора для разведения сывороток (вытяжек). После чего в лунки добавляли по 10,0 мкл отрицательного контроля (раствор, используемый для экстрагирования вытяжек, и стандартная калибровочная проба 0 мг/мл IgG_общ), по 10,0 мкл стандартных калибровочных проб для расчета концентрации (от 1,00 до 25,00 мг/мл IgG_общ), по 10,0 мкл контрольной сыворотки, содержащей IgG_общ. Время инкубации составляло 30 мин при температуре 37 ˚C на шейкере ST-3. После 5-кратного отмывания на вошере hydro FLEX в лунки добавляли по 100 мкл конъюгата (антитела анти-IgG_общ меченные пероксидазой хрена) и вновь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 ˚C на шейкере ST-3 и 5-кратно отмывали с помощью вошера hydro FLEX. Образовавшийся комплекс выявляли ферментативной реакцией с использованием раствора ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидина гидрохлорид). Оптическую плотность продуктов реакции, а также концентрацию IgG_общ измеряли фотометрически на ридере infinite F50.

Результаты и обсуждение

При проведении микроскопического исследования в изготовленных препаратах выявлены: фрагменты надхрящницы, состоящей из плотной оформленной волокнистой соединительной ткани, в которой волокна собраны в параллельные пучки с узкими прослойками основного вещества и хондроцитами, изогенные группы хондроцитов (по 2 и более) и отдельные хондроциты (рис. 2—4, на цв. вклейке).

Рис. 2. Фрагмент надхрящницы.

а — акрихин, ув. ×400; б — акридиновый оранжевый, ув. ×400.

Рис. 3. Хондроцит.

а — акрихин, ув. ×400; б — акридиновый оранжевый, ув. ×400.

Рис. 4. Изогенные группы хондроцитов.

а — акрихин, ув. ×400; б — акридиновый оранжевый, ув. ×400.

В калибровочных пробах, прилагаемых к набору (в образцах с заведомо известной концентрацией IgG_общ), определяли оптическую плотность, после чего по 6 точкам с помощью программного обеспечения строили калибровочную кривую. Данная кривая являлась основой для последующего определения концентрации IgG_общ в исследуемых пробах. Проведенное исследование позволило установить, что концентрация IgG_общ в экстрактах из микрочастиц гиалиновой хрящевой ткани человека составила 18,906±1,930 мг/мл, оптическая плотность — 0,615±0,102 условных единиц (у.е.) (табл.). Оптическая плотность минимального значения калибровочной пробы составила 0,023±0,011 у.е., максимальная калибровочная проба — 0,981±0,084 у.е. Установленные оптимальные значения калибровочных проб позволяют учитывать их в практической экспертной работе при использовании количественного ИФА для установления видовой принадлежности гиалинового хряща.

Оптическая плотность и концентрация IgG_общ в цельных экстрактах из фрагмента гиалинового хряща человека (M±m)

Заключение

В результате проведенного судебно-цитологического исследования продемонстрирован полиморфизм клеточных элементов гиалинового хряща. Разработан способ применения количественного ИФА для установления видовой принадлежности микрочастиц гиалиновой хрящевой ткани по IgG_общ, определены показатели оптической плотности и концентрации, подобраны оптимальные значения минимальных и максимальных калибровочных проб, необходимых в практической работе. Применение количественного ИФА при установлении видовой принадлежности микрочастиц гиалиновой хрящевой ткани при проведении судебно-биологических экспертиз определяется его высокой чувствительностью, специфичностью и производительностью.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.