Непрямые молекулярно-генетические факторы предрасположенности к повышенному тромбообразованию у потерпевших с механической травмой нижних конечностей

Судебно-медицинская экспертиза механической травмы (МТ) — наиболее распространенный вид судебных экспертиз. Вопросам определения механизма травмы, давности ее причинения посвящены многочисленные исследования [1—3]. Исход МТ обусловлен многими факторами как внешнего, так и внутреннего происхождения. Одним из факторов риска при МТ является развитие венозных тромбоэмболических осложнений (ВТЭО).

ВТЭО представляют собой глобальную медико-социальную проблему. Эпидемиология тромбозов венозной системы достигает 180 случаев на 100 тыс. населения в год и увеличивается у возрастных пациентов до 200 случаев на 100 тыс. населения [4]. Причем опасность для жизни и здоровья потерпевшего несет не столько возникший венозный тромбоз, сколько его осложнение в виде тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА).

В основе ВТЭО лежит многофакторный патологический процесс — повышенное тромбообразование (ТО) в венах мягких тканей из области механического воздействия. Тромбофилия обусловлена как наследственными, так и приобретенными факторами. К приобретенным факторам относят саму МТ, длительное вынужденное положение пострадавшего, оперативные вмешательства и многие иные факторы [5, 6].

К наследственным факторам относят мутации и полиморфизмы в генах, ответственных за регуляцию системы гемостаза, тонуса стенки сосуда [7].

Интервенционные методы лечения потерпевших с травмой опорно-двигательного аппарата сами являются модифицируемыми факторами риска развития тромбоза глубоких вен нижних конечностей и ТЭЛА. Возникший при лечении больного неблагоприятный исход является поводом для судебных разбирательств в рамках уголовного или гражданского судопроизводства. При этом следует отметить, что в настоящее время во взаимоотношениях между врачом и пациентом наблюдается высокий уровень конфликтов [8]. Получить ответы на появившиеся в рамках судебного разбирательства вопросы без проведения судебно-медицинской экспертизы невозможно. В случаях экспертной оценки ВТЭО и наличия (или отсутствия) причинной связи с МТ, а также выполненным оперативным вмешательством требуется определить ведущую роль в патогенезе приобретенных и наследственных факторов предрасположенности к повышенному ТО. На практике же оценка роли наследственных факторов предрасположенности к повышенному ТО вызывает существенные трудности, связанные с отсутствием сведений о частоте встречаемости и значимости конкретных полиморфизмов в генах-кандидатах наследственной предрасположенности. Отсутствие единых методологических подходов при возникновении ВТЭО таит в себе опасность допущения экспертных ошибок, что не позволяет обеспечить всесторонность, полноту и объективность экспертных выводов [9].

Цель работы — селективное определение частоты встречаемости полиморфных аллелей в генах-кандидатах наследственной предрасположенности к повышенному ТО у лиц с МТ опорно-двигательного аппарата, умерших от ТЭЛА.

По архивным данным судебно-медицинских экспертиз (актов судебно-медицинского исследования трупа и заключений эксперта) было отобрано для первичного исследования 9447 документов с описанием случаев насильственной смерти, среди которых МТ и последовавшая ТЭЛА как причины смерти составили 48 случаев. Критериями для группового отбора случаев смерти от ТЭЛА являлись: наличие МТ нижней конечности (переломы длинных трубчатых костей) и выполненное оперативное вмешательство в связи с имевшейся МТ.

При анализе заключений эксперта (актов судебно-медицинского исследования трупа) учитывали половозрастные характеристики, изучали локализацию источника ТЭЛА.

Проводили молекулярно-генетическое исследование на предмет носительства мутантных аллелей в генах-кандидатах наследственной предрасположенности к повышенному ТО (генах, ответственных за синтез плазменных белков системы гемостаза, тромбоцитарных факторов, влияющих на тонус сосудистой стенки и фолатного цикла). Всего было определено 13 однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Характеристика исследуемых генов и их аллельных вариантов представлена в табл. 1.

Таблица1. Характеристика исследованных генов и их аллельных вариантов потерпевших с травмой опорно-двигательного аппарата, умерших от ТЭЛА

Идентификацию ОНП генов проводили с помощью энзиматической амплификации ДНК методом ПЦР с использованием термоциклера GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Генотипирование объектов по аутосомным локусам ДНК выполняли с применением тест-систем COrDIS Plus (ООО «Гордиз», Россия) и AmpFISTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). ПЦР осуществляли в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам реагентов.

Результаты обрабатывали с помощью описательной статистики: вычисления средних значений и дисперсии; 25, 50, 75-го процентилей, с указанием минимальных и максимальных значений. Определение статистически значимых различий в анализе встречаемости полиморфизмов проводили с помощью критерия Фишера для множественных сравнений (p<0,05). Статистическую обработку данных выполняли с помощью программы Microsoft Excel 2016.

Количество анализируемых случаев в зависимости от пола потерпевшего оказалось практически одинаковым: мужчин — 23 (47,92%), женщин — 25 (52,08%).

Средний возраст умерших мужчин составил 53,85±2,31 года (мин. 26 лет, медиана 54,5 года, макс. 81 год, Q1 — 25-й процентиль 40,5 года, Q3 — 75-й процентиль 68,25 года); женщин — 64,75±1,41 года (мин. 48 лет, медиана 64 года, макс. 84 года, Q1 — 25-й процентиль 56,5 года, Q3 — 75-й процентиль 71,5 года).

Тромб как источник ТЭЛА локализовался в глубоких венах голени в 6 (12,5%) случаях, в глубоких венах бедра в 3 (6,25%), в венах малого таза в 22 (45,83%), в венах нижней конечности с неуточненной локализацией и непосредственно в полости нижней полой вены по 1 (2,08%) случаю, в полости правого предсердия, в том числе в полости ушка правого предсердия, в 10 (20,83%), в подключичной вене в 4 (8,33%); источник ТЭЛА не был установлен в 1 (2,08%) случае. Долевое распределение числа носителей ОНП с травмой опорно-двигательного аппарата в зависимости от аллельного варианта, которые умерли в лечебном учреждении от ТЭЛА, представлено в табл. 2.

Таблица 2. Долевое распределение носителей с травмой опорно-двигательного аппарата, которые умерли в лечебном учреждении от ТЭЛА, в зависимости от аллельного варианта (M±m)

ВТЭО считается следствием взаимодействия предрасполагающих факторов: как внешних, обычно преходящих, так и связанных с пациентом (потерпевшим) и, как правило, трудноустранимых [10].

В клинике разделение факторов ВТЭО в зависимости от возможности их устранения важно для оценки риска возникновения угрожающего для жизни состояния и принятия решения о длительности антикоагулянтной терапии. В экспертной практике такое разделение продиктовано необходимостью выявления ведущего патогенетического звена в развитии осложнения и определения наличия или отсутствия причинной связи между нанесенной МТ и наступившей смертью от ТЭЛА либо между выполненным оперативным вмешательством и также наступившей смертью от ТЭЛА. Наследственные факторы предрасположенности к повышенному ТО по определению являются немодифицируемыми. Экспертная оценка влияния наследственных факторов риска возможна при знании частоты их встречаемости в экспертной практике. По результатам настоящего исследования, из 13 селективно отобранных ОНП генов, участвующих в регуляции системы гемостаза, наиболее часто «мутантные» аллели встречались в PAI-1 -675 5G/4G, MTHFR 677 CT и MTRR 66AG. Суммарно количество носителей в гетеро- и гомозиготном состоянии по «мутантному» аллелю в этих генах составило 87,8, 53,85 и 75,0% соответственно.

Ген PAI-1 (SERPINE1) кодирует белок — ингибитор активации плазминогена, является ключевым ферментом фибринолитической системы [11]. Публикаций, свидетельствующих о связи генотипа PAI-1 -675 4G/5G с венозным тромбозом, немного [12], но имеются свидетельства о его связи с венозным тромбозом глубоких вен нижних конечностей в сочетании с дефицитом протеина S [13, 14].

Ген MTHFR кодирует ключевой фермент фолатного цикла метилентетрагидрофолатредуктазу, участвующий в метаболизме незаменимой серосодержащей аминокислоты гомоцистеина. Точечная мутация в позиции 677 C→T является основной причиной повышенного уровня гомоцистеина в плазме крови, т.е. приводит к гипергомоцистеинемии, считающейся независимым фактором повышенного ТО и маркером эндотелиальной дисфункции [15].

Ген MTRR кодирует цитоплазматический фермент метионин-синтазу-редуктазу, способствующий превращению гомоцистеина в метионин. Генотип MTRR 66GG связан с четырехкратным снижением активности фермента [16, 17].

Таким образом, в анализируемых случаях имелись наследственные нарушения в регуляции фибринолитической системы и функции эндотелия сосудов, что необходимо учитывать при экспертной оценке причинной связи развития ВТЭО.

В настоящем исследовании дана оценка мутациям и полиморфизмам генов как одному из судебно-медицинских критериев установления причины ТО. Генетическое исследование на предмет наличия ОНП следует считать лишь одним из дополнительных методов исследования при проведении судебно-медицинской экспертизы в случаях ВТЭО ввиду необходимости учета как модифицируемых, так и немодифицируемых факторов риска развития этого осложнения. С учетом повышенной встречаемости ОНП в генах PAI-1 -675 5G/4G, MTHFR 677 CT и MTRR 66AG генетическое типирование при проведении судебно-медицинской экспертизы необходимо начинать именно с этих генов. Для полноты экспертных суждений о причинной связи между МТ и ТЭЛА требуется учет особенностей носительства ОНП в генах предрасположенности к повышенному ТО.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.