Изучение динамики посмертных изменений является актуальной проблемой, имеющей важное значение для теории и практики судебно-медицинской экспертизы. Сложность определения происходящих в посмертном периоде процессов напрямую зависит от его длительности, а значит, и давности наступления смерти (ДНС). Дополнительные трудности возникают, если труп находится в состоянии постаутолиза или скелетирования [1—3]. В этом случае единственным источником информации для идентификации и суждениях о сроках ДНС становятся кости или костные фрагменты — сложная композиция из коллагена и гидроксиапатита, подлежащая диагенезу за счет целого комплекса химических и биологических изменений. В судебной медицине классически посмертные процессы подразделяют на собственно трупные явления и последствия воздействия факторов окружающей среды. Выделение критериев ДНС производится по морфологическому и биофизическому признакам [4—7], которые в позднем посмертном периоде теряют свою чувствительность и перестают быть специфичными. С учетом значимости использования объективных методов оценки ДНС в судебной медицине остается актуальной разработка альтернативных подходов к определению длительности посмертного периода, в том числе по костным останкам. С этой целью разработан метод флюоресценции костей в ультрафиолетовых лучах. При регистрации флюоресценции применяют индофинол и нильский синий, в присутствии которых кости, пролежавшие в земле не более 5 лет, не окрашиваются. Восприимчивость костных останков к красителю увеличивается со сроком захоронения более 10 лет. Описано использование окраски реактивом сулема-бромфеноловый синий для определения органического (белкового) состава костей; метода декальцинации при помощи ультразвука для установления скорости времени, в течение которого костная ткань освобождается от солей кальция. Экспериментально доказано, что с помощью эмиссионного спектрального анализа костных останков возможно установление давности захоронения трупа в пределах ±2 года [8].

В качестве одного из перспективных инструментов определения ДНС привлекают данные о микробном разнообразии костных фрагментов [9, 10]. Микроорганизмы первыми колонизируют труп [11—13], активно участвуют в процессах гидролиза белков [14, 15] и контролируют дальнейшее разложение с закономерной сменой качественного и количественного состава [11, 13]. Как правило, на смену аэробным микроорганизмам приходят анаэробы, количество которых по мере высыхания тела уменьшается, далее остаются почвенные бактерии, биохимически активные в отношении синтеза коллагеназ и кератиназ. Благодаря исследованиям [13] установлено, что в погребенных останках микробное сообщество постоянно меняется, постаутолиз сопровождается последовательным увеличением относительной численности аэробных бактерий типов Proteobacteria и Firmicutes и снижением количества Acidobacteria. После активного распада тканей в микробном сообществе преобладают только анаэробные таксоны. На поверхности фрагментов костей человека доминируют микроорганизмы, отнесенные к типам Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Acidobacteria [16]. Известно, что с увеличением срока скелетирования в составе микрофлоры костей уменьшается разнообразие Firmicutes и Bacteroidetes и начинают преобладать α-, γ-Proteobacteria и Actinobacteria. В образцах костей с периодом разложения более 2 лет преобладают Acidobacteria, принадлежавшие к семейству Solibacteraceae, а также Koribacteraceae, Pseudomonadaceae, Clostridiaceae и Tissierellaceae. В исследовании T. Crippen и соавт. [12] сделан акцент на химизме микробного разложения, связанного с выделением метана, кадаверина, путресцина, сероводорода, аммиака, которые непосредственно влияют на pH тела и создают экологический фон для разных видов позвоночных-падальщиков, насекомых и растений. Имеются данные о способности бактерий манипулировать поведением насекомых: привлекать виды, которые приносят пользу выживанию, и отталкивать те, которые наносят вред. Летучие органические соединения, образующиеся при разложении трупа бактериями, привлекают мясных мух и способствуют их активному размножению [17, 18].

В настоящее время благодаря развитию новых технологий при изучении биоразнообразия микрофлоры трупа, помимо классической микробиологии, применяют методы молекулярной биологии, включая Real-Time PCR (англ. real-time polymerase chain reaction), цитогенетический метод FISH — флюоресцентная гибридизация in situ (англ. fluorescence in situ hybridization ), высокопроизводительное секвенирование (англ. high throughput sequencing — HTS). Так, HTS-технология позволяет изучить геном конкретного штамма или вида микроорганизма и исследовать целые сообщества микробов с возможностью быстрой и эффективной идентификации всех таксонов и штаммов. По результатам высокопроизводительного секвенирования некробиома получено объективное представление о резидентной микрофлоре трупа [19, 20] и описана совокупность явлений, сопровождающих сложный процесс разложения [21]. Успехи в междисциплинарных исследованиях, накопление информации о биологии и экологии микрофлоры трупа привели к созданию прочной научной базы для обоснования использования микробиологических подходов при анализе посмертных явлений. Возникла и получила дальнейшее развитие микробная криминалистика, которая в настоящее время определяется как «раздел судебной криминалистики, применяющей микробиологические доказательства для выработки следственных версий по уголовным и гражданским делам» [22, 23]. Методы микробной криминалистики используют и в практике судебно-археологических расследований, когда на месте захоронения непосредственно в локальной среде нахождения останков формируется специфический микробный биоценоз, свидетельствующий об интенсивности процесса постаутолиза или скелетирования.

Цель работы — исследование фенотипических признаков доминантов, выделенных с поверхности костных останков из исторического захоронения, для расширения данных по биоразнообразию микроорганизмов в составе микрофлоры костных останков и оценки возможности использования данных микробиологического анализа в доказательной базе судебно-медицинской экспертизы и судебной археологии.

Материал и методы

Изучение качественного и количественного состава микрофлоры костных останков выполнено как часть научно-исследовательской работы по применимости данных микробиологического анализа для установления давности наступления смерти. Микроорганизмы выделяли с поверхности костных останков, обнаруженных на участке исторического захоронения. Согласно имеющимся данным, останки принадлежали лицам, чьи тела после убийства были сброшены в затопленную шахту. Через 1 сут убитые были извлечены из шахты, 2 тела сожжены, остальные — захоронены под полотном грунтовой дороги в суглинистой почве, где находились около 70 лет. Затем останки в течение 4 лет пролежали на воздухе и 20 лет — в захоронении в склепе.

Для микробиологического анализа использовали материал, взятый с 9 костных фрагментов: диафиз правой бедренной кости (7 фрагментов), костно-мышечный конгломерат в проекции передней поверхности крестца (1), фрагмент левой подвздошной кости (1). Пробы микрофлоры отбирали с поверхности костей методом смывов [24].

Для фиксации количества и качества отобранного материала каждой проекции присваивали соответствующие обозначения: «1», «2а», «3», «4», «5», «6», «7», «8а», «9» — с передней поверхности os femoris dextra; «2б» — с поверхности костно-мышечного конгломерата в проекции передней поверхности os sacrum; «8б» — с внутренней поверхности os ilium sinistra. Согласно количеству выбранных проекций, для микробиологического анализа было сделано 11 смывов (см. таблицу).

Общее описание проб для микробиологического анализа

В лабораторных условиях с соблюдением асептики пробы суспензировали в физиологическом растворе и в объеме 0,1 мл инокулировали в элективные питательные среды. Накопительные культуры получали при температуре 22±3 °C. Выбор температуры культивирования был обусловлен наличием в исследуемом сообществе микроорганизмов, относящихся к мезофилам.

У выделенных с поверхности костных фрагментов эубактерий (Eubacteria) оценивали разнообразие культуральных, морфологических и биохимических признаков, регламентированных в определителе бактерий Берджи [25]. Чистые культуры микромицетов (Fungi) идентифицировали по культуральным и морфологическим признакам в соответствии с определителями мукоральных грибов [26, 27]. К культуральным признакам относили характер роста на плотных питательных средах, к морфологическим — принадлежность к определенному морфотипу, строение клеточной стенки, наличие капсул, спор и жгутиков, к биохимическим — способность к росту на дифференциально-диагностических средах с добавлением глюкозы, сахарозы, мальтозы, лактозы и маннита (ЗАО «НИЦФ», Россия), наличие протеолитической активности — на мясопептонном желатине (МПЖ) и мясопептонном бульоне (МПБ), а также гемолитической активности — на кровяном агаре (КА) [28]. Протеолитическую активность считали положительной при разжижении желатина и образовании продуктов аммонификации пептона — H₂S и C₈H₇N. Результат гемолитической активности оценивали по наличию зон гемолиза вокруг колоний. Выделение плесневых и дрожжеподобных грибов выполняли на агаре Сабуро с декстрозой («BioMedia», Россия). Дифференциальное окрашивание гиф микроскопических грибов проводили суданом III («ИНТЕРХИМ», Россия). Ультраструктуру клеток изучали с помощью прижизненных и фиксированных окрашенных препаратов [29], которые просматривали в трех полях зрения на микроскопе Motic DM-BA-30, оснащенном цифровой камерой Moticam T (Китай) при увеличении ×1000 с применением иммерсии.

Для анализа и обобщения эмпирических результатов использовали аппроксимацию как способ приближенного описания тенденции полученной зависимости распределения выявленных фенотипов. Аппроксимацию выполняли средствами Exel на основе полученных данных, представленных в виде таблиц [30].

Результаты и обсуждение

В составе микрофлоры поверхности костных фрагментов были обнаружены изоляты, дающие культуральный рост на МПБ, МПЖ, КА и среде Сабуро; на средах с углеводами культуральный рост отсутствовал.

По культуральным признакам изоляты были распределены на 6 фенотипов: 1-й — колонии плотные, возвышающиеся над средой, кожистые, серовато-белого цвета; 2-й — колонии кожистые, складчатые, с серовато-белым мицелием; 3-й — колонии плоские, бледно-розовые, сметанообразной консистенции, с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями; 4-й — колонии плоские, кремовые, сметанообразной консистенции, с гладкой блестящей поверхностью; 5-й — колонии плоские, белые, сметанообразной консистенции, с гладкой блестящей поверхностью; 6-й — колонии бледно-серые, в центре светло-коричневые с бежевым краем, порошистые (рис. 1, на цв. вклейке).

Рис. 1. Разнообразие культурального роста выделенных микроорганизмов.

Данные по разнообразию выделенных фенотипов были подтверждены результатами анализа зависимости распределения выявленных фенотипов от места забора образцов и отображены в виде диаграммы (рис. 2). Интерполирующая функция представлена в виде полинома, критерий аппроксимации был равен 0,86. Выбор полиномиальной регрессии для анализа полученных данных был обоснован тем, что среди выделенных фенотипов обнаружили варианты с выраженными экстремальными значениями (максимальными и минимальными). Максимальные значения по численности и таксономическому разнообразию выделенных микроорганизмов соответствовали образцам «2а» и «2б», минимальные — образцам «3», «5» и «7».

Рис. 2. Разнообразие выделенных фенотипов в зависимости от места забора образцов.

Основная часть микроорганизмов, выделенных с поверхности костных фрагментов, по интегральным показателям численности оказалась представлена микромицетами царства Fungi, подцарств Dikarya и Eubacteria (рис. 3).

Рис. 3. Разнообразие выделенных групп микроорганизмов в зависимости от места забора образцов.

Благодаря оценке распределения выделенных микроорганизмов между исследуемыми образцами костных фрагментов установлено, что только Deuteromycota и Eubacteria колонизируют все типы поверхностей. Ascomycota встречается в 6 случаях из 11, Basidiomycota — в 2, а Zygomycota — в 4. Доля Deuteromycota от общего количества выделенных культур микроскопических грибов изменялась в диапазоне от 22,9 до 50,7%.

Характерно, что при обилии микромицетов количество эубактерий существенно уменьшалось, а при низкой встречаемости, наоборот, увеличивалось. Так, на поверхности проекции костного фрагмента «2а» общая доля микромицетов составила 86,3%, а эубактерий — 13,7%. На поверхности костного фрагмента «9» доля микромицетов уменьшилась до 28,9%, а эубактерий увеличилась до 71,7%. Eubacteria также присутствовали на всех фрагментах, и их процентное соотношение изменялось от 13,7 до 71,7%. Необходимо отметить, что общая численность выделенных эубактерий оказалась очень низкой и сильно варьировала. Максимальное количество клеток было обнаружено в образце «2б» (костно-мышечный конгломерат в проекции передней поверхности крестца) — 174 КОЕ/мл, а минимальное — в образце «6» (18 КОЕ/мл).

Таксономическое разнообразие эубактерий, контаминирующих костные фрагменты, представлено на рис. 4. Идентифицированы представители 8 порядков, 4 из которых — Pseudomonadales, Actinomycetales, Acidobacteriales и Clostridiales — встречались во всех образцах выполненных смывов.

Рис. 4. Разнообразие выделенных групп Eubacteria.

Pseudomonadales — чрезвычайно распространенная группа грамотрицательных монобактерий с широким спектром адаптационного потенциала к пищевым субстратам и факторам окружающей среды.

К порядку Actinomycetales относятся типичные представители почвенных бактерий, которые благодаря своему метаболизму вызывают деструкцию поликомпонентных субстратов и участвуют в биосинтезе гуминовых соединений.

Acidobacteriales также входят в состав почвенной микрофлоры, имеют разнообразный метаболизм, из-за особенности которого трудно поддаются культивированию.

Представители порядка Clostridiales относятся к облигатным анаэробам, это спорогенные бактерии с большим набором протеолитических и липолитических ферментов.

Порядок бактерий Bacillales также был довольно распространен среди выделенной микрофлоры. Эти бактерии образуют эндоспоры, среди них встречаются как аэробные, так и факультативно анаэробные виды.

Редко встречающимися при анализе таксонами являлись порядки Hyphomicrobiales, Rhizobiales и Bacteroidales. Hyphomicrobiales — это гетеротрофные грамотрицательные неспорообразующие бактерии, способные образовывать гифы в виде выростов, образованных клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной. Rhizobiales включают грамотрицательные неспорообразующие бактерии, способные к симбиозу с растениями, в основном с бобовыми культурами. Bacteroidales также относятся к гетеротрофным грамотрицательным неспорообразующим бактериям, встречаются повсеместно в окружающей среде, включая почву, желудочно-кишечный тракт и кожу позвоночных.

Таким образом, анализ данных о составе микрофлоры костных фрагментов исторического захоронения дал возможность понять некоторые механизмы компенсации снижения биоразнообразия при формировании специфических микробных сообществ в процессе разложения костных останков с большим сроком захоронения. Среди микромицетов преобладали Deuteromycota (50,7%). Basidiomycota и Zygomycota встречались крайне редко, их численность находилась на границе чувствительности используемых методов. Среди эубактерий доминировали Pseudomonadales (39,2%) и Acidobacteriales (42,9%), в единичных случаях были выделены Hyphomicrobiales, Rhizobiales и Bacteroidales. Большинство выделенных культур проявило низкую ферментативную активность в отношении как углеводов, так и белков. При культивировании фиксировали отсутствие конечных продуктов брожения и аммонификации. Характеристики микробных сообществ, выделенных с останков «2а» и «2б», имели четко выраженные отличия относительно разнообразия микроорганизмов, выделенных с остальных фрагментов. Вероятно, это связано с тем, что на проекции костного фрагмента «2б» сохранился конгломерат мягких тканей, который стал легкодоступной органикой для собственной микрофлоры и микрофлоры соседнего участка, попавшей на ткани в результате реколонизации. Полученные данные свидетельствуют о широте экологической пластичности доминирующих групп микроорганизмов, что является результатом их быстрой адаптации к труднодоступному питательному субстрату с последующим вытеснением менее адаптированных видов микроорганизмов.

Выводы

1. При изучении образцов костных фрагментов исторического захоронения, возраст которых находился в пределах 90—95 лет, обнаружено, что только Deuteromycota и Eubacteria колонизируют все типы поверхностей; в случае обилия микромицетов доля эубактерий закономерно снижается, при увеличении численности бактериального фона уменьшается частота встречаемости микромицетов.

2. Незначительное количество питательных веществ в костных останках приводит к уменьшению количества и биологического разнообразия контаминирующих их микроорганизмов; доминируют виды, адаптированные к труднодоступному органическому субстрату.

3. В течение процесса разложения костных останков при изменении условий их нахождения происходят межвидовая конкуренция и специфическая реколонизация видами микроорганизмов, наиболее адаптированными к труднодоступному органическому субстрату при заданных абиотических и биотических условиях существования.

4. Полученные результаты имеют большое значение для описательной экологии и биологии специфических групп микроорганизмов в составе посмертного микробиома и могут служить обоснованием для проведения более тщательного исследования сложных коммуникаций между видами микроорганизмов в составе некробиома костных останков, которое позволит в перспективе выдвинуть оригинальные гипотезы о вовлечении микробов в круговорот вещества и энергии и применить полученные сведения в судебно-медицинской экспертизе и судебной археологии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.