Проблема определения давности наступления смерти (ДНС) занимает одно из ведущих мест в судебной медицине. В настоящее время установление ДНС осуществляется преимущественно по морфологическому критерию, наиболее изученному в ранние сроки посмертного периода [1—7 и др.]. Вариабельность изменений трупа в поздние сроки после смерти, сложившаяся практика ограниченного использования нетрадиционных методов побуждают к расширению методической базы путем включения энтомологических, микробиологических и биофизических методов.

Цель работы — на основе сведений из специальной литературы и собственных данных обосновать возможность диагностики ДНС в позднем посмертном периоде на основе комплекса энтомологических, микробиологических и биофизических исследований.

Изучили и обобщили результаты энтомологических, микробиологических и биофизических методов решения прикладных вопросов определения продолжительности посмертного интервала при наличии поздних трупных изменений.

Материал и методы

Собственные исследования проводили на территории северо-запада России. Изучение энтомологических и микробиологических особенностей разложения трупов выполняли на трупах человека, свиней, кур, мышей и некоторых других представителей класса млекопитающих [8]. Оценивали возможности использования импедансометрии для диагностики ДНС. Выполнили пробные серии опытов и отработали оригинальные методические приемы исследования импеданса тканей на целостных трупах лиц обоего пола в возрасте 30—50 лет, умерших от различных причин с известной датой смерти.

Для эффективной экспертной реконструкции постмортального интервала, особенно в позднем посмертном периоде, проанализировали данные протоколов осмотра места происшествия, заключения судебно-медицинских экспертов, сведения о температуре воздуха и количестве атмосферных осадков в районе обнаружения трупа за длительный промежуток времени, соответствующий годовому циклу сезонов; изучили энтомологические образцы, собранные на месте происшествия, микробиологические образцы трупа и его ложа [6]; интерпретировали результаты биофизических параметров электрического сопротивления биологических тканей.

Результаты и обсуждение

Энтомологический метод — один из дополнительных способов уточнения ДНС, однако, по мнению В.Л. Попова [9], за последние годы исследования в этом направлении практически не ведутся.

Установили, что определение ДНС на основе энтомологических данных производится двумя основными способами. Первый способ — определение по размерам тела и массе личинок возраста самых зрелых индивидуумов некрофильных насекомых, обнаруженных на трупе. Развитие личинок двукрылых легко визуализируется построением кривых роста при различных константных температурах. Если температура относительно постоянная (в случае нахождения трупа в закрытом помещении), то возраст личинок можно определить по их длине. Если температура изменяется (в случаях обнаружения трупа в естественном биоценозе), то возраст личинки можно вычислить по диаграмме как интервал между точками, в которых ее длина пересекается с минимальной и максимальной зафиксированными температурами.

Второй способ основан на анализе последовательной смены видов членистоногих на трупе (сукцессия). Этот способ позволяет экспертам соотносить каждый отдельный вид или группу некробионтов с определенным сроком разложения. На рис. 1 представлены 1—3 волны заселения трупа насекомыми при разложении на воздухе для срока ДНС до 3 мес. Всего можно выделить до 8 волн для срока ДНС до 3 лет.

Рис. 1. Сукцессия основных видов некрофильных насекомых на трупах свиней и человека при разложении на воздухе.

Таракановые: 1 — E. lapponicus. Жесткокрылые: 2 — N. violacea; 3 — S. alpestris; 4 — N. littoralis; 5 — Nicrophorus spp.; 6 — O. thoracica; 7 — Thanatophilus spp.; 8 — A. curtula; 9 — Atheta spp.; 10 — C. maxillosus; 11 — Tachinus spp.; 12 — Philonthus spp.. Двукрылые: 13 — C. mortuorum; 14 — C. vicina; 15 — C. vomitoria; 16 — P. terraenovae; 17 — L. caesar; 18 — F. canicularis; 19 — H. dentipes; 20 — Megaselia spp.; 21 — P. vulgaris; 22 — S. nigriceps; 23 — S. caerulescens; 24 — S. argyrostoma. Муравьи: 25 — род Formica; 26 — род Lasius; а — в большом количестве, б — присутствие вероятно.

Fig. 1. Succession of the main species of necrophilous insects on the corpses of pigs and humans during decomposition in the air.

Blattodea: 1 — E. lapponicus; Caleoptera: 2 — N. violacea, 3 — S. alpestris, 4 — N. littoralis, 5 — Nicrophorus spp., 6 — O. thoracica, 7 — Thanatophilus spp., 8 — A. curtula, 9 — Atheta spp., 10 — C. maxillosus, 11 — Tachinus spp. 12 — Philonthusspp.; Diptera: 13 — C. mortuorum, 14 — C. vicina, 15 — C. vomitoria, 16 — P. terraenovae,17 — L. caesar, 18 — F. canicularis, 19 — H.dentipes, 20 — Megaselia sp., 21 — P. vulgaris, 22 — S. nigriceps, 23 — S. caerulescens, 24 — S. argyrostoma. Ants: 25 — Formica, 26 — Lasius; a — necrobionts in large numbers, b — probably presence.

Кроме того, возможно использовать метод ретроспективного определения ДНС по дате заселения трупа некробионтами. Для расчета используют формулу вычисления суммы эффективных температур [10]. Данная формула универсальная и применяется в других отраслях, например в сельском хозяйстве:

C=(t–t₁)·n,

где C — сумма эффективных температур (°C), t — наблюдаемая температура (°C); t₁ — температура, ниже которой не происходит развития вида (нижний порог развития вида, °C); n — дни наблюдения.

Для сбора некрофильных насекомых при осмотре трупа на месте его обнаружения необходимо пользоваться специализированной укладкой [11]. Собранные с трупа яйца, личинки и пупарии содержат в термостате при постоянной температуре до выплода взрослых насекомых. Расчет осуществляется по имаго, вылетевшим первыми. Сначала вычисляют C_лаб — количество затраченного на развитие в лаборатории тепла. Далее определяют C_внеш — потребление тепла на развитие во внешних условиях: разность между тепловой постоянной вида и C_лаб. По данной формуле можно определить и количество дней наблюдения, т.е. срок развития мухи на объекте с момента колонизации до забора материала [12]. Практической апробацией удалось подтвердить объективность энтомологических критериев определения продолжительности и условий постмортального интервала [13].

Микроорганизмы, учитывая их субстратную специализацию относительно мертвых биотканей, давно рассматриваются как дополнительный инструмент диагностики ДНС. Имеются экспериментальные доказательства возможного применения в качестве критериев установления ДНС таких биохимических характеристик некробиома, как активность каталазы [14, 15] или казеинолитическая активность [16].

Возрастающая проблема разработки новых методов определения ДНС, особенно в позднем посмертном периоде, заставляет задумываться об использовании в практике судебно-медицинской экспертизы биоиндикаторных тест-систем, ранее помогавших, например, в мониторинге качества окружающей среды [17]. В качестве биоиндикаторов могут быть использованы представители всех царств живой природы. Для некробиома в качестве такой системы могут выступить микроорганизмы, выражающие специфику данного сообщества [15], с учетом последовательной смены видов на трупе и основных абиотических факторов, оказывающих на нее непосредственное воздействие (рис. 2).

Рис. 2. Сукцессия эколого-физиологических групп микробных сообществ некробиома.

1 — прототрофы; 2 — протеолитики; 3 — целлюлозолитики; 4 — сульфатредукторы; 5 — азотфиксаторы; 6 — олигонитрофилы; 7 — олигокарбофилы, * — с учетом абиотических факторов; а — в большом количестве; б — присутствие вероятно.

Fig. 2. Succession of ecological and physiological groups of microbial communities of the necrobiome.

1 — prototrophs, 2 — proteolytics, 3 — cellulolytics, 4 — sulfate reducers, 5 — nitrogen fixers, 6, 7 — oligonitrophils and oligocarbophils, * — taking into account abiotic factors; a — in large quantities, b — presence is likely.

Судебно-медицинское значение данных микробиологического анализа заключается в том, что ферментативная активность эколого-физиологических групп микроорганизмов является гораздо более прогностически значимым критерием определения ДНС, в том числе по сравнению с результатами энтомологического анализа. Выявление (индикация) ферментов осуществляется посредством реакции фермента и субстрата, для протекания которой требуются специализированные факторы роста культуры. В процессе реакции образуются продукты, изменяющие цвет индикатора. Ферментами начальных стадий разложения трупа являются протеазы, фосфатазы и гликолитические ферменты, поздних — нитрогеназа, декарбоксилаза, нитратредуктаза и сульфатредуктаза (см. таблицу).

Субстраты для ферментов отобранных видов микроорганизмов

Substrates for enzymes of selected species of microorganisms

Таким образом, перспективна разработка тест-системы для экспресс-диагностики ДНС на основе фермент-субстратной специфичности микроорганизмов к трупному материалу. Она включает семь питательных субстратов, полностью соответствующих качественному анализу биохимического профиля микроорганизмов, являющихся доминантными на различных стадиях разложения трупа.

Для более точного установления ДНС уже в лабораторных условиях необходимо провести количественный анализ ферментативной активности (изменение субстрата под действием фермента в единицу времени). Единица измерения — ME, это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата или получение 1 мкмоля продукта в минуту в стандартных условиях.

Импедансометрический подход представляется перспективным в судебно-медицинской диагностике ДНС. Его достоинства: высокая чувствительность, возможность строго объективной регистрации полученных результатов, доступность исследования и простота методики. Они позволяют применять метод в качестве средства экспресс-диагностики.

Метод измерения импеданса нашел широкое применение при изучении процессов, протекающих в биологических тканях при изменении их физиологического состояния. Анализ дисперсии импеданса биологической ткани позволяет оценить ее физиологическое состояние [7, 18].

Импедансная плетизмография используется для установления продолжительности постмортального интервала в раннем посмертном периоде. Метод помогает определить состояние клеточного, межклеточного компонентов и мембран и судить о глубине аутолитических процессов, так как процессам деструкции первоначально подвергаются клеточные мембраны. Ю.И. Пиголкин и соавт. [19] обосновали измерение сопротивлений при накожном расположении электродов в трех позициях на трех частотах: 1 кГц (R1), 10 кГц (R2) и 200 кГц (R3). Авторы оценивали динамику относительных коэффициентов: R1/R3, (R1—R2)/R3 и (R1—R2)/(R2—R3).

Разница (R1—R2) соответствует сопротивлению некробиотически измененных клеток, (R2—R3) — сопротивлению клеток с неизменной мембраной, R2 характеризует сопротивление всех клеточных форм и волокнистых структур, R3 определяет преимущественно состояние межтканевой жидкости.

При различном расположении накожного электрода наблюдали однотипную направленность показателей импеданса в определенные временные периоды после наступления смерти. Сделали вывод о волнообразном характере аутолиза: периоды стабильности сменялись выраженными некробиотическими изменениями. М.С. Ковалева и соавт. [20] не установили зависимости сопротивления неповрежденной кожи от ДНС в период до 48 ч с момента наступления смерти.

А.Я. Никифоров [21—23] отметил особенности динамики величины импеданса биохимически активного органа (почка) и условно пассивной ткани (сухожилие). Исследования выполняли на трупном материале (изъятые образцы фиксированных размеров, хранившиеся в определенных условиях). Импедансометрию проводили в сроки посмертного периода на 1—7-е, 10, 14, 18, 22, 26, 28, 35, 42, 49 и 56-е сутки для частот 10 Гц, 100 Гц, 1 кГц, 10 кГц и 100 кГц. Для анализа результатов использовали средние абсолютные значения величины импеданса образцов для каждой частоты тока. Установили наличие закономерных изменений импеданса сухожилия в позднем посмертном периоде (до 8 нед) с учетом температуры окружающей среды как фактора, определяющего динамику развития признака. Зафиксировали повторяемость величин импеданса (периоды нарастания и спада импеданса) для различных температурных режимов хранения материала. Предположили, что динамика импеданса исследуемой ткани обусловлена темпом и характером развивающихся в тканях аутолитических процессов и гниения.

Результат изучения особенностей электропроводящих свойств стекловидного тела в динамике посмертного периода представлен в работе И.А. Ледянкиной и соавт. [24]. Стекловидное тело исследовали экстракорпорально. Его получали путем пункции глазного яблока. Измерения проводили в лабораторных условиях с помощью игольчатого датчика погружного типа на частотах 100 Гц и 100 кГц. Величину поляризации оценивали по коэффициенту дисперсии, определяемому как безразмерная величина, равная отношению низкочастотного полного сопротивления к высокочастотному. По мнению авторов, исследование коэффициента дисперсии электропроводности позволяет более четко представить, что происходит с изучаемым объектом, каким образом количественно изменяется соотношение жидкость — белковые структуры с течением времени либо при иных воздействиях. Установили, что в постмортальном периоде коэффициент дисперсии электропроводности стекловидного тела увеличивается.

Анализ специальной литературы показал, что изучение временной динамики импеданса в большинстве случаев проводили на фрагментах различных тканей и органов, поэтому полученные исследователями данные несколько противоречат друг другу. Считаем целесообразнее фиксировать изменения импеданса различных тканей целостного трупа на протяжении длительного срока (несколько месяцев) с момента наступления смерти, так как продолжительность, сущность процесса разложения целостного мертвого тела или изъятых от него частей существенно отличаются. Наши исследования направлены на определение ДНС умершего человека, а не отдельных биологических тканей. Это, на наш взгляд, является обоснованием целесообразности изучения импеданса в целостном биологическом объекте.

Следует также отметить, что большое значение для использования импедансометрии в целях судебно-медицинской экспертизы, особенно в позднем посмертном периоде, имеет выбор диагностической зоны. К диагностической зоне прежде всего предъявляется требование стабильности, наименьшей подверженности влиянию факторов внешней и внутренней среды [22, 24, 25]. К числу подобных объектов можно отнести соединительную ткань, представленную крупными сухожилиями, для которой, помимо крайне низкой метаболической активности и как следствие высокой биохимической инертности и незначительных индивидуальных отличий, характерна относительная биохимическая и биофизическая изолированность. Следует аргументированно подходить и к выбору периодичности снятия показаний, частот переменного тока для измерения импеданса, конструкции электродов и способа их крепления, количественного показателя, используемого для характеристики степени происходящих аутолитических процессов (абсолютное значение импеданса или коэффициент, характеризующий степень дисперсии импеданса).

Мы провели серию пробных экспериментов. По результатам этих опытов обоснована необходимость использования «стандартного модельного объекта» для изучения динамики импеданса в посмертном периоде. Рассмотрена динамика импеданса тканей трупов свиней на протяжении длительного срока с момента наступления смерти в стандартизованных условиях как обоснование моделирования процесса разложения трупа человека. Провели разведочный анализ, который позволяет выдвинуть гипотезу о существовании зависимости величин импеданса и коэффициентов дисперсии от ДНС, а также предположить, что по комбинации значений импеданса и соответствующих коэффициентов можно судить о сроке ДНС.

Для разработки на основе импедансометрии конкретного способа диагностики ДНС требуется проведение более тщательной экспериментальной работы с находившимися в различных условиях целостными трупами людей и модельными объектами (например, трупы свиней). Это необходимо для определения наиболее перспективных для снятия показаний диагностических зон, отработки методических приемов исследования импеданса тканей и получения большего массива достоверных числовых значений, достаточных для статистического анализа.

Заключение

1. Перспективной для медицинской диагностики ДНС в позднем постмортальном периоде представляется оценка сочетания микробиологических, энтомологических и биофизических данных. Результаты, полученные лабораторными методами, можно сопоставлять с данными традиционного морфологического исследования трупа.

2. В прикладном отношении важна «стандартизация» условий исследования: для энтомологических исследований — это сбор, транспортировка, доращивание до имаго и дальнейшее изучение образцов насекомых; для микробиологических исследований — сбор и последующий алгоритм исследования микрофлоры трупа; для исследования электрического сопротивления биологических тканей — выбор диагностической зоны, периодичность снятия показаний импеданса, частот переменного тока для его измерения, электродов и способа их крепления, количественного показателя, используемого для характеристики степени выраженности процессов разложения.

3. Для углубленного исследования характера причинно-следственных связей явлений, происходящих в биологических тканях в позднем посмертном периоде, интересно выполнение перечисленных ранее исследований по единой программе, на единой методической базе, при разных условиях окружающей среды, что выходит за рамки организации исследований в каком-то отдельном регионе и может привести к успеху лишь при сопоставлении результатов, полученных в различных климатогеографических зонах нашей страны.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Выполнено в рамках реализации Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017—2021 гг.

Коллектив авторов приносит благодарность доцентам кафедры зоологии и экологии Института биологии, экологии и агротехнологий ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» Сидоровой Н.А. и Лябзиной С.Н., доценту кафедры общей физики Физико-технического института ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» Казаковой Е.Л. за участие в реализации идей и проектов.