Морфологическая характеристика коры мозжечка в молодом возрасте и изменения ее цитоархитектоники при опиоидной зависимости

Наркотическая зависимость — одна из актуальных проблем, имеющая сегодня не только медицинское, но и социальное значение. Она «вшита» в жизнь современного общества настолько сильно, что корректировать ее губительное действие усилиями только медицины крайне сложно; необходимо участие специалистов из других сфер: психологии, социологии, педагогики [1, 2].

В течение последних 20 лет в мире быстро растет употребление новых психоактивных веществ (ПАВ). Среди потребителей наиболее популярными соединениями являются синтетические каннабиноиды и производные катинона, а на нелегальном рынке рекреационных наркотиков появились новые синтетические опиоиды [3].

В судебно-медицинской практике при определении возраста погибших для идентификации личности уделяют пристальное внимание изменениям в тканях [4]. Именно поэтому, на наш взгляд, наибольший интерес представляют исследования, посвященные изучению закономерностей трансформации структуры органа или ткани на клеточном уровне.

Применение морфологических методов исследования в судебно-медицинской идентификации личности существенно расширяет возможности установления общих и специфических признаков [4, 5]. Методики иммуногистохимии в странах с высокоразвитой морфологической диагностикой являются обязательной составляющей многих исследований. Например, их используют в онкоморфологии, так как только они обеспечивают специфическую визуализацию локализации в тканях различных клеток, их рецепторов, ферментов, иммуноглобулинов, компонентов клеточного цитоскелета и даже отдельных генов [6].

Основополагающую роль в реализации всех процессов жизнедеятельности организма играет состояние центральной нервной системы (ЦНС) [7]. Мозжечок — один из важнейших отделов большого мозга, участвующий в обеспечении множества функций — от координационно-локомоторных до регуляции циркадного ритма и поддержки когнитивного статуса [8, 9].

Исследования, использующие технику визуализации процессов мозговой деятельности и нейропсихологические тесты, показывают, что фактически все ПАВ, принимаемые зависимыми, нарушают работу нейрофизиологической сети, вызывая снижение активности зон, ответственных за кратковременную память и внимание. Систематическое употребление ПАВ угнетает функции системы коркового контроля личности высшей психической деятельности. Это проявляется снижением потенциала обучаемости и способности удерживать внимание, нарушением координационно-двигательной сферы, особенно в периоды наркотического опьянения, а также «разбалансировкой» эмоционального компонента личности [10—12]. По этим причинам нас заинтересовала проблема исследования цитоархитектоники коры мозжечка при наркотической зависимости от синтетических опиоидов.

Цель исследования — установить особенности морфологической характеристики коры мозжечка в молодом возрасте при опиоидной зависимости в сравнении с условно здоровым человеком для улучшения качества судебно-медицинской экспертизы.

Работа выполнена в танатологическом отделении государственного казенного учреждения здравоохранения особого типа Пермского края «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» в период 2019—2020 гг. Она основана на анализе результатов комплексного морфологического исследования коры мозжечка человека, включающего гистологический, иммуногистохимический, морфометрический и статистический методы. Исследовали 69 трупов мужчин в возрасте от 21 года до 29 лет включительно.

На проведение исследования получено разрешение этического комитета Пермского государственного медицинского университета им. акад. Е.А. Вагнера (№10 от 22.11.17).

Выделили две группы. Первую группу составили 42 погибших в возрасте 21—29 лет, не имевших в анамнезе наркотической зависимости, а также патологии центральной и периферической нервных систем (условно здоровье). Причина их смерти — травмы или ранения груди и/или живота (какие-либо механические повреждения головы отсутствовали). Во 2-ю группу вошли 27 мужчин в возрасте 24—28 лет, умерших от передозировки наркотического препарата группы синтетических опиоидов. У всех умерших 2-й группы в анамнезе отмечен систематический прием синтетических опиоидов продолжительностью от 16 мес до 3 лет.

Критерии включения: давность смерти, не превышающая 24—36 ч; хранение трупов до исследования в одинаковых условиях при температуре 2 °C; отсутствие макроскопических признаков патологии ткани большого мозга при заборе материала.

Для исследования взяли ткани центральной части нижней полулунной дольки мозжечка. Кусочки фиксировали в 10% растворе забуференного по Лилли формалина (pH 7,2) в течение 24 ч, промыли в проточной воде в течение 30 мин, а затем подвергли обезвоживанию и заливке в парафин по схеме: спирт 60% — 2 части (далее — ч), спирт 70% — 2 ч, спирт 96% — 2 ч, спирт + ксилол (1:1) — по 2 ч, ксилол + парафин (1:1) — по 2 ч, парафин I 56º — 2 ч, парафин II 56º — 1 ч. На ротационном микротоме из парафиновых блоков изготовили гистологические срезы толщиной 4—6 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ниссля (по Снесареву).

Количественный (морфометрический) анализ образцов проводили с использованием программного пакета BioVision, version 4,0 (Австрия). Захват изображений обеспечивали использованием цифровой камеры для микроскопа «CAM V200», («Vision», Австрия).

При иммуногистохимическом исследовании образцов использовали панель антител к белку Vimentin (виментин). Иммуногистохимические исследования выполняли по стандартным протоколам. Применяли концентрированные первичные моноклональные мышиные антитела к протеинам Vimentin, клон V9-DBS («Lab Vision», США), рабочее разведение 1:100, система визуализации KP50L («Diagnostic BioSystems», USA). Парафиновые срезы наклеивали на предметные стекла с адгезивным полилизиновым покрытием («Thermo Scientific», Menzel-Glaser Polysine® Slides 25×75×1,0 mm, Gerhard Menzel, GmbH).

Для восстановления антигенных детерминант после формалиновой фиксации депарафинизированные срезы подвергали нагреванию: срезы помещали в 0,01 М цитратный буфер (pH 6,0) и кипятили в течение 20—30 мин, затем на 5 мин переносили в трис-буфер (pH 7,5), обрабатывали 0,3% раствором пероксида водорода (пероксидазный блок), после чего проводили инкубацию с первичными антителами в течение 10—30 мин во влажной камере. Перед использованием концентрированные антитела разводили растворителем антител (Primary Antibody Diluent, «Diagnostic BioSystems», USA) в титре 1:100 согласно инструкции фирмы-производителя антител. В период иммуногистохимических исследований проводили позитивные контроли, рекомендованные фирмой-производителем. Затем срезы троекратно промывали в трис-буфере, после чего подвергали экспозиции со вторичными антителами (мышиные и кроличьи биотинилированные антитела, «Diagnostic BioSystems», USA) в течение 10 мин, промывали в трис-буфере, обрабатывали конъюгированным с пероксидазой стрептавидином в течение 10 мин и окрашивали DAB+ (3,3’-диаминобензидин, «DiagnosticBioSystems», USA) в течение 1—2 мин, не допуская появления фонового окрашивания. Промывали в 2—3 порциях дистиллированной воды в течение 10—15 мин и докрашивали гематоксилином Майера. Затем срезы заключали в канадский бальзам. При просмотре препаратов на светооптическом уровне антигенпозитивные клетки идентифицировали по появлению коричневого окрашивания цитоплазмы.

При использовании рутинных гистологических методик существенного различия ткани коры мозжечка в двух группах не выявили. В 1-й группе (условно здоровые) клетки Пуркинье, как правило, имели правильную грушевидную форму и длинные выраженные отростки. Во 2-й группе обнаружили примерно на 30% больше клеток Пуркинье с нечеткими стенками и гомогенной цитоплазмой. Ядра таких клеток находились в состоянии кариопикноза или кариорексиса (рис. 1 на цв. вклейке).

Рис. 1. Фрагменты мозжечка трупов условно здорового мужчины 22 лет (а) и мужчины 26 лет с опиоидной зависимостью (б).

Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 300.

Расстояние между телами клеток Пуркинье в сравниваемых группах не имело статистически достоверного различия: в правом полушарии мозжечка t(p)=0,26, в левом — t(p)=0,76. Расстояние между телами клеток Пуркинье во 2-й группе в правом полушарии мозжечка было на 5,16%, а в левом полушарии на 1,29% больше, чем в 1-й группе соответственно (табл. 1).

Таблица 1. Расстояние (в микрометрах) между телами клеток Пуркинье в коре мозжечка

Более информативная морфологическая характеристика коры мозжечка оказалась при использовании иммуногистохимического метода исследования с антителами к виментину. Выявили статистически достоверное увеличение иммунопозитивных тел клеток Пуркинье во 2-й группе (с наркотической зависимостью): в правом полушарии t(p)=1,99, в левом — t(p)=1,97.

Таким образом, во 2-й группе количество иммунопозитивых к виментину клеток Пуркинье в правом полушарии на 52%, а в левом — на 52,9% превышало количество таких клеток в 1-й группе соответственно (табл. 2) (рис. 2 на цв. вклейке).

Таблица 2. Количество (в процентах) иммунопозитивных клеток Пуркинье к виментину

Рис. 2. Фрагменты мозжечка условно здорового мужчины 24 лет (а) и мужчины 27 лет с опиоидной зависимостью (б).

Иммунопозитивные к виментину клетки Пуркинье. Ув. 150.

Количество иммунопозитивных тел клеток Пуркинье у лиц сравниваемых групп имеет статистически достоверное различие: в правом полушарии t(p)=1,99, в левом — t(p)=1,97.

Наиболее известной функцией промежуточных нитей белка является обеспечение механической целостности клеток. У трупов с опиоидной зависимостью в обоих полушариях мозжечка обнаружили около 70% иммунопозитивных к виментину клеток Пуркинье. Это позволяет трактовать полученной результат как признак нейродегенерации, так как сверхэкспрессия виментина объясняется действием компенсаторных механизмов, протекающих в нейронах. Динамика формирования нитей виментина, определяющая структурную организацию белка в клетке, по мнению исследователей [13—15], важна для поддержания механической целостности клеток, особенно во время их миграции и стресса. Надо также отметить, что в исследованиях, выполненных на лабораторных мышах с нарушенными двигательными функциями, установлено, что виментин проявляет себя в качестве нейротрофического фактора, усиливающего аксональную активность и компенсирующего восстановление локомоции [16]. Таким образом, исследование показало, что нарастание экспрессии виментина в клетках Пуркинье можно использовать для распознавания наличия повреждения нейронной сети при опиоидной зависимости [16].

Полученные данные позволяют более качественно дать характеристику погибшему с опиоидной зависимостью при судебно-медицинской экспертизе.

1. При исследовании коры мозжечка с использованием рутинных гистологических методик существенного различия ее цитоархитектоники у лиц с опиоидной зависимостью и условно здоровых не отмечается.

2. Расстояние между телами клеток Пуркинье у лиц с опиоидной зависимостью и условно здоровых не имеет статистически достоверного различия.

3. У лиц с опиоидной зависимостью в обоих полушариях мозжечка около 70% клеток Пуркинье иммунопозитивны к виментину.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.