Введение

В последние годы в связи с увеличением продолжительности жизни наблюдается повышение частоты встречаемости нейродегенеративных заболеваний, в первую очередь болезни Паркинсона (БП) и болезни Альцгеймера (БА), у пациентов пожилого и старческого возраста. Главную роль в таком повышении частоты нейродегенеративных заболеваний играет идиопатическая возрастная нейродегенерация, которая может проявляться в различных клинических вариантах [1]. Важно отметить, что для БА характерно диффузное поражение нейронов коры головного мозга в целом, тогда как при БП патологический процесс сосредоточен на дофаминергических нейронах черной субстанции с нарушением функции базальных ганглиев, ведущих к развитию характерных для этого заболевания моторных и не моторных нарушений [1]. Лечение при БП в основном связано с применением препаратов на основе L-DOPA, но продолжительное использование этих препаратов не приводит к остановке процессов нейродегенерации и сопровождается развитием побочных реакций. В связи с этим, в течение последних 30—40 лет производятся попытки создать принципиально новые методы лечения этого заболевания — такие как глубокая стимуляция головного мозга и заместительная клеточная терапия нейрональными клетками [2—4]. Первые идеи об использовании заместительной клеточной терапии при БП были высказаны в начале семидесятых годов прошлого века [5, 6], и за это время был проведен ряд экспериментальных и клинических исследований с использованием разных источников клеток — мезенхимальных стволовых клеток [7], стволовых клеток обонятельного эпителия [8] нейрональных стволовых клеток [9], эмбриональных стволовых клеток [10, 11]. При этом из мышиных эмбриональных стволовых клеток удалось получить обогащенную популяцию нервных стволовых клеток среднего мозга и формируемые такими клетками дофаминергические нейроны демонстрируют электрофизиологические и функциональные качества, характерные для нейронов среднего мозга. Однако использование эмбриональных стволовых клеток связано с сложными деонтологическими проблемами и в последние годы интерес исследователей сосредоточен на репрограмированных клетках, полученных из клеток пациента [12, 13].

Открытие феномена репрограммирования человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) позволило получить уникальный ресурс для регенеративной медицины с принципиальной возможностью получения широкого спектра клеточных культур, и в том числе нейрональных культур, клетками различной эргичности. При этом крайне важным является не просто получение клеток определенного типа, а их получение в форме трехмерной культуры, воссоздающей цитоархитектонику регенерируемой ткани. Один из возможных подходов к решению данной задачи — использование в качестве подложек при культивировании клеток гидрогелей на основе различных природных белков (например, белка шелка [14] или созданных на их основе рекомбинантных белков). Ранее было показано, что одним из эффективных носителей при культировании нейрональных клеток может быть рекомбинантный белок-спидроин rS1/9, и при культивировании на этом носителе могут быть получены нейрональные клетки-предшественники, стимулирующие скорость клеточной пролиферации в модели острого ишемического инсульта [15]. Дальнейший анализ возможности использования этого носителя для получения на основе ИПСК культур нейрональных клеток позволил разработать протокол для получения на микрогелевых гранулах на основе рекомбинантного спидроина. Было показано, что на трехмерном матриксе в виде микрогеля на основе рекомбинантного спидроина rS1/9 ИПСК эффективно дифференцируются в гетерогенную клеточную популяцию, обогащенную дофаминергическими нейронами, экспрессирующими потенциал-чувствительные ионные каналы [16, 17].

Для дальнейшего изучения в рамках настоящего исследования функциональной зрелости и активности полученной нейрональной культуры она была использована для введения мышам с токсической моделью БП с целью оценки регенеративного потенциала и перспективности использования нейрональных культур, культивируемых на микрогелевом матриксе на основе спидроинов, в клеточной терапии нейродегенеративных процессов. Так как при БП первыми фенотипическими проявлениями заболевания оказываются моторные нарушения [1], то в первую очередь была проведена оценка влияния данных нейрональных культур на моторное поведение мышей с токсическим поражением дофаминергических нейронов черной субстанции.

Материал и методы

Для проведения экспериментов по трансплантации дифференцированных in vitro на спидроиновом матриксе нейрональных клеток были использованы мыши с токсической моделью ранней симптомной стадии БП. Для содержания мышей использовали виварий со свободным доступом к пище и воде и естественной сменой освещения. Экспериментальная работа с лабораторными животными проводилась в соответствии «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» [18] и была одобрена этическим комитетом НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ (протокол № 22/5 от 16 декабря 2022 г.).

Для получения данной модели мышам линии C57BL/6 в возрасте 6 нед был проведен курс из 4-кратных подкожных инъекций водного раствора 1–метил–4–фенил–1,2,3,6–тетрагидропиридина (МФТП) в концентрации 12,5 мг/кг. При таком введении у мышей через 2 недели после введения токсина развивается ранняя симптомная стадия заболевания [2, 3]. До введения токсина все мыши прошли тест «Открытое поле», и для проведения исследования было сформировано 6 групп из 5 мышей в каждой группе с одинаковым базальным уровнем двигательной активности для проведения стереотаксических операций. Через 7 дней после введения токсина на этапе интенсивной гибели дофаминергических нейронов мышам из каждой группы были проведены операции по стереотаксическому введению различных препаратов.

Мышам 1-й группы (n=5) проводили введение физиологического раствора, и эту группу можно рассматривать как контроль ответа на оперативное вмешательство. мышам 2-й группы (n=5) вводили микрогель на основе спидроина, не содержащий нейрональных клеток. мышам остальных групп (групп 2-6 (n=5)) вводили нейрональные клетки с различным сроком дифференцировки in vitro (3 или 14 дней), как в среде с микрогелем (из 3% раствора смеси рекомбинантных белков спидроинов rS1/9 и rS2/12 в соотношении 1:1 с 10%-м суммарным содержанием гепарин-связывающего пептида и пептида RGDS), так и без микрогеля на подложке из матригеля.

При проведении операции подопытным животным вводили подкожно 50 мкл мелоксикама 20 мг/мл и помещали их в вентилируемый бокс со смесью изофлурана с воздухом, содержащей 4% изофлурана при воздушном потоке 0,8 л/мин. После потери животным признаков двигательной активности мышь перемещали в раму стереотаксического аппарата, закрепляя морду животного в маске для ингаляционной анестезии. На этом этапе состояние наркоза поддерживали смесью 3% изофолурана и воздуха при потоке 1 л/мин. Достижение животным состояния хирургического наркоза контролировали отсутствием педального рефлекса. Животному вводили ректальный зонд, подключенный к контроллеру обогреваемой платформы стереотаксического аппарата, для поддержания температуры 39 ^оС у животного в течение операции. Голову обривали ветеринарной электробритвой для мелких животных. Область спины и головы животного укрывали стерильной хирургической простыней. Место трижды очищали ватным тампоном, смоченным 0,05% раствором биглюканата хлоргексидина, от центра к периферии, осушали стерильным тампоном, наносили 10% повидон-йод. Обнажали череп, нанося скальпелем продольный разрез, место разреза подвергали инфильтрации смесью 1:1 20 мг/мл лидокаина и 5 мг/мл бупивакаина. Края разреза закрепляли зажимами типа «Бульдог», а надкостницу убирали. С закрепленной в держателе на раме стереотаксического аппарата микродрелью размечали место будущего введения в правое полушарие в ретикулярную часть черной субстанции (относительно брегмы черепа: AP –3,2 мм; ML 1 1,25 мм; DV 4,27 мм). Сверлили микроотверстие, заменяли микродрель на 10 мкл шприц с иглой 32 GA, заполненной 2 мкл среды, содержащей нейрональные клетки в количестве 1000 клеток на мкл среды, в соответствии с вышеописанными экспериментальными группами.

Иглу микрошприца опускали на запланированную глубину со скоростью 0,1 мм/с, оставляли на месте по достижении конечной точки на 2 мин, потом приподнимали на 0,2 мм и проводили микроинъекцию со скоростью введения 200 пкл/с. По окончании микроинъекции оставляли животное в покое на 2 мин, после чего извлекали иглу полностью со скоростью 0,1 мм/с. На разрез накладывали простой прерывающийся хирургический шов материалом Викрил 4/0. Ушитую рану обрабатывали мазью колистиметат натрия + хлорамфинекол + тетрациклин. Животное помещали в отдельную клетку с непосредственным доступом к еде и пище и обогревом, в отдельном помещении для содержания лабораторных животных.

Через 21 день после операции была произведена оценка двигательной активности при помощи теста «Открытое поле». При проведении теста животных помещали в центр поля («OpenScience», Россия) [19] и фиксировали латентное время первой побежки с центрального квадрата, число пересеченных квадратов (с выделением центральной, промежуточной и пристеночной зон), вставаний на задние лапы за 3 мин теста. Тестирование проводили для всех использованных в эксперименте мышей. После каждого тестирования поверхность открытого поля тщательно промывали водой, протирали и высушивали. Поведенческую активность животных оценивали с использованием ПО «IC Capture 2.4» (The Imaging Source, LLC, США) [20] и ПО «Минотавр» (ООО «Нейроботикс», Россия) [21]. Были проанализированы следующие параметры:

T, общее время — общее время нахождения животного в открытом поле;

T (акт) –время движения — время, за которое животное совершает все активные движения в открытом поле;

T (пас), с — время покоя — время, когда животное не совершает никаких действий, а находится в покое в одной точке открытого поля;

V, м/с — скорость общая — средняя скорость, с которой животное совершает все свои перемещения;

V (акт), м/с — скорость активная — средняя скорость, с которой животное совершает все свои перемещения в период T(акт);

S, м — дистанция, длина трека — расстояние, которое животное проходит в результате тестирования;

N — количество пересечений зон — количество пересеченных квадратов, которыми размечено открытое поле, за общее время.

На основании полученных первичных данных рассчитывали кратность изменения параметра (Fold change, FC), а достоверность отличий в величине FC в разных группах животных рассчитывали с применением непараметрического U-теста Манна—Уитни и использованием пакета программ “Statistica for Windows 8.0” (StatSoft, Inc. (2007) и программного обеспечения MS Excel 2016 (Microsoft). Достоверные повышения FC выделены в табл. 1—3 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_04_015_add.zip) красным цветом, понижения — зеленым, а желтым обозначены варианты с тенденцией к изменению (p<0,1).

Результаты

Для моделирования БП в данном исследовании была использована токсическая модель, основанная на неоднократном введении токсина МФТП. При таком введении у мышей через 2 нед после введения токсина развивается ранняя симптомная стадия заболевания, которая характеризуется гибелью дофаминергических нейронов, снижением уровня дофамина в стриатуме и вызванным этим нарушением моторного поведения. Для анализа этих нарушений был использован тест «Открытое поле», в рамках которого оценивали траекторию и скорость перемещения животного в установке. На первом этапе был проведен сравнительный анализ подвижности мышей, которым через 7 дней после введения токсина при стереотаксической операции вводили физиологический раствор или использованный для культивирования клеток микрогель (см. табл. 1). Приведенные данные позволяют сделать вывод, что введение микрогеля не оказало очень заметного влияния на моторное поведение животных. Достоверно при его введении увеличилось только время активного поведения в пристеночной зоне с увеличением пройденного пути. В связи с этим при всех дальнейших расчетах проводили оценку моторного поведения у мышей с введением различных нейрональных культур относительно мышей, которым вводили микрогель. Это позволяет выявить эффекты, связанные с введением культуры клеток, без необходимости внесения поправки на активность в отношении моторного поведения самого микрогеля. Результаты такого анализа приведены в табл. 2 и позволяют сделать вывод, что использование при стереотаксических операциях клеточных культур сказывается на моторной активности — причем этот эффект максимален при коротком (трехдневном) культивировании. При этом оказывается, что такие клетки оказывают в основном негативный эффект на моторное поведение. Так, введение культивированных без микрогеля нейрональных клеток повышает пассивность мышей и снижает большинство показателей, указывающих на высокую моторную активность, такие как пройденный за время теста путь и скорость движения мышей. Такие мыши по сути «зависают» в центральной зоне и очень мало покидают ее. Культивирование на микрогеле в течение 3 дней очень незначительно улучшает ситуацию. Напротив, более длительное двухнедельное культивирование без микрогеля повышает активность мышей в центральной зоне — длительность активного пребывания там мышей нарастает с увеличением числа пересекаемых квадратов, а время пассивного пребывания в центральной зоне падает.

Обсуждение

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что культивирование нейрональных клеток in vitro на среде без микрогеля в течение 14 дней оказывает выраженный эффект на моторную активность мышей через 2 нед после их введения в мозг мышей. При таком сроке культивирования нейрональных клеток до момента введения их в мозг мышей у животных увеличивается двигательная активность, что проявляется в первую очередь увеличением длительности активного периода и пройденного расстояния. Особенно четко это проявляется при сравнении моторной активности у мышей, которым вводили культивированные на среде без микрогеля в течение 14 или 3 дней нейрональные клетки, — при кратковременном культивировании введение нейрональных клеток в мозг мышей приводит, напротив, к снижению моторной активности в тесте «Открытое поле» (см. табл. 3). Эти эффекты модулируются культивированием клеток на микрогеле, причем это влияние оказывается разным для различных нейрональных культур.

Ранее при изучении процессов дифференцировки in vitro нейрональных клеток было показано, что на среде с микрогелем нейроны, полученные из индуцированнных плюрипотентных стволовых клеток, экспрессируют и синтезируют необходимый паттерн ключевых нейронспецифичных генов и белков, при этом максимальный уровень их экспрессии достигается к 20-м суткам культивирования [16]. В моделировании моторного поведения мышей с токсической моделью БП культуры такого возраста также оказывают наиболее сильное влияние, что может быть связано с их большей функциональной зрелостью (см. табл. 3). Но в то же время в системе in vivo оказался мало выражен эффект культивирования клеток на микрогеле — культивирование клеток на матригеле оказалось даже более эффективным при модуляции моторного поведения. При этом само по себе введение микрогеля не влияло на моторное поведение (см. табл. 1) и только модифицировало эффект, связанный со сроком культивирования нейрональных клеток in vitro.

Заключение

Таким образом, полученные из ИПСК и дифференцированные in vitro культуры нейрональных клеток при стереотаксическом введении в мозг мышей с токсической моделью БП могут приводить к повышению двигательной активности, но этот эффект зависит как от срока культивирования клеток in vitro, так и от используемых в процессе культивирования матриксов. При этом культивирование на микрогеле на основе рекомбинантного спидроина rS1/9 в целом снижает влияние введения нейрональных клеток, введенных в область черной субстанции мышей с токсической моделью БП.

Финансирование. Работа была выполнена за счет соглашения №075-15-2023-324 с Министерством науки и высшего образования Российской Федерации.

Соблюдение этических стандартов. В ходе исследования были соблюдены все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных. Экспериментальная работа с лабораторными животными проводилась в соответствии «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» [18] и была одобрена этическим комитетом НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ. (протокол №22/5 от 16 декабря 2022 г.)

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.