Фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) представляет собой морфологический паттерн, основой развития и прогрессирования которого являются тяжелое повреждение и гибель подоцитов с фиброзированием капиллярных петель клубочков [1–4]. Тяжелые нарушения цитоскелета и цитоплазмы подоцитов, хорошо заметные при ультраструктурном анализе, связаны со структурно-функциональными изменениями цитоподий, гломерулярной базальной мембраны, щелевой диафрагмы и с выраженной утечкой плазменных белков в мочу [5]. Как клинико-морфологический синдром ФСГС гетерогенен по этиологии повреждения подоцитов и клиническому течению [3]. В отличие от гемодинамического и генетически обусловленного вариантов болезни молекулярные основы этиопатогенеза первичного (идиопатического) ФСГС (пФСГС) остаются недостаточно изученными для разработки стратегии эффективной терапии [6]. Жизнеспособность подоцитов при пФСГС может быть нарушена вследствие их отслойки, апоптоза или некробиоза, а их депопуляция служит основой прогрессирования болезни и развития терминальной почечной недостаточности [1]. В результате пФСГС, на долю которого приходится около 40% всех случаев подоцитопатий у взрослых [5], представляет собой серьезную клиническую проблему [2].

Одним из мастер-регуляторов фенотипа и функций подоцитов является белок опухоли Вильмса (WT1) [7]. WT1 представляет собой транскрипционный фактор, содержащий домен цинковых пальцев (zinc fingers), обильно экспрессируемый зрелыми подоцитами [7]. WT1-зависимые механизмы регулируют специфичный для подоцитов транскриптом, определяющий их дифференцировку и развитие, включая структуру щелевой диафрагмы, белки цитоскелета и фокальной адгезии [7]. При ФСГС подоциты подвергаются выраженным повреждениям цитоскелета [8] и, возможно, дедифференцировке в результате эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) [9], механизмы которого обсуждаются в контексте гломерулопатий в целом и подоцитопатий в частности [10]. При ФСГС изменения молекулярного фенотипа подоцитов, вероятно, носят первичный характер, в то время как при других иммунных гломерулопатиях могут быть вторичным ответом на депозицию иммунных комплексов в соседних структурах клубочка как, например, при IgA-нефропатии (IgAN) [11].

Своевременное выявление повреждений подоцитов существенно для прогнозирования и дифференциальной диагностики пФСГС. В основу представляемого разведочного исследования положена гипотеза об изменении молекулярного фенотипа подоцитов при иммунных гломерулопатиях с фокусом на экспрессии молекул эпителиального (WT1) и мезенхимального (десмин, виментин) фенотипов. Полученные в клинических моделях первичного и вторичного повреждения подоцитов (пФСГС и IgAN соответственно) данные были подвергнуты сравнительному анализу.

Материал и методы

В исследование включили 28 пациентов с подтвержденными клинически и морфологически пФСГС (n=14) и IgA-нефропатией (n=14) (рис. 1). В группу негативного контроля вошли случаи без клинических признаков существенного повреждения подоцитов, когда образцы визуально неизмененной коры почек получены при лапароскопической нефрэктомии у пациентов со злокачественными новообразованиями почки и мочевого пузыря (n=12) (см. рис. 1). Критерии исключения: число клубочков в биоптате менее 10, диагностическая биопсия почек на фоне иммуносупрессивной терапии или ренотоксичных лекарств, сочетание пФСГС или IgAN с другими заболеваниями почек, любые клинически существенные острые или хронические экстраренальные заболевания по усмотрению исследователей (см. рис. 1; таблица). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Все пациенты дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Рис. 1. Дизайн эксперимента и группы исследования.

IgAN — IgA-нефропатия; пФСГС — первичный фокально-сегментарный гломерулосклероз.

Клинические и морфологические показатели в группах исследования

Клинические данные

На момент биопсии почки регистрировали демографические и клинические данные: пол, возраст, суточную потерю белка, альбумин в сыворотке крови, расчетную скорость клубочковой фильтрации.

Концентрацию альбумина сыворотки крови определяли колориметрическим фотометрическим методом с бромкрезоловым зеленым; экскрецию белка — методом с пирогаллоловым красным; концентрацию креатинина в сыворотке и моче –модифицированным методом Яффе на анализаторе DxC 700 AU с использованием соответствующих тест-систем (Beckman Coulter, США). Скорость клубочковой фильтрации рассчитывали по концентрации креатинина с использованием формулы CKD-EPI (2013).

Рутинное морфологическое исследование

Для патогистологического исследования образцы почечной паренхимы фиксировали незамедлительно после их получения в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 24 ч при комнатной температуре. Гистологическую проводку выполняли с помощью автоматического процессора Tissue-Tek Vip 5Jr (Sakura Finetek Inc., США) с применением раствора IsoPREP (ООО «БиоВитрум», Россия). Для пропитывания обезвоженной ткани и приготовления гистологических блоков применяли среду HISTOMIX (ООО «БиоВитрум», Россия). Из парафиновых блоков изготавливали серийные срезы толщиной 2 мкм на ротационном микротоме Accu-cut SRM (Sakura Finetek Inc., США). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа (PAS), конго красным, использовали также трихромальную окраску, серебрение по Джонсу. Исследование проводили в светооптическом микроскопе Carl Zeiss Imager Z 2 (Carl Zeiss, Германия). При световой микроскопии определяли долю полностью склерозированных клубочков и клубочков с фокально-сегментарным склерозом.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Для ультраструктурного анализа образцы почки фиксировали в стандартном альдегидном фиксаторе, затем — в четырехокиси осмия и заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали на трансмиссионном микроскопе JEM 7A (JEOL, Япония).

Иммуноморфологическое исследование

Иммуномаркирование на парафиновых срезах проводили методами иммуногистохимии или иммунофлюоресценции с использованием первичных моноклональных антител к белку опухоли Вильмса (WT1 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (6L9X6), разведение 1:1000), десмина (Desmin Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (DES, 2960R), разведение 1:200), виментина (Vimentin Monoclonal Antibody (SP20), разведение 1:200) (все Invitrogen, США). При выполнении иммуногистохимического (ИГХ) исследования для всех микропрепаратов применяли высокотемпературную демаскировку в цитратном буфере (pH 6,0). Для визуализации использовали полимерную систему детекции Novolink Polymer Detection System (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Великобритания).

Многоцветное иммунофлюоресцентное окрашивание выполняли с использованием системы визуализации OPAL 3-COLOR MANUAL IHC KIT 50 SLIDES (Akoya bio, США). Коэкспрессию молекулярных маркеров анализировали методом иммунофлюоресценции на парафиновых срезах и с помощью конфокальной микроскопии Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Германия).

Количественная морфометрия

Количественную морфометрию размерных характеристик почечного тельца (площади почечного тельца, клубочка и пространства капсулы Шумлянского–Боумена), а также площадей ИГХ-окрашивания антителами к WT1, десмину и виментину выполняли во всех образцах почек (n=40) не менее чем в 10 клубочках для каждого гистологического препарата на оцифрованных изображениях (3DHISTECH PANNORAMIC Midi, Carl Zeiss, Германия) с использованием программ анализа изображений Pannoramic Viewer Version 1.15.4 и QuPath Version 0.5. 1. Гломерулярную экспрессию рассчитывали как отношение площади позитивного ИГХ-окрашивания подоцитов, расположенных на базальной мембране капиллярных петель клубочка, к суммарной площади капиллярных петель, мезангия и подоцитов с исключением участков склероза. Результаты выражали в процентах. Экспрессию в париетальных клетках рассчитывали как разницу между площадями экспрессии во всем клубочке с капсулой Шумлянского–Боумена и площадью гломерулярной экспрессии и выражали в процентах от суммарной площади клубочка. При анализе межгрупповых различий гистологических характеристик выполняли сравнение измерений для всех проанализированных клубочков в группе (120—160 измерений для каждой группы).

Статистический анализ

Для статистического анализа данных применяли пакет прикладных программ STATISTICA 10. Результаты представляли в виде медианы и интерквартильного размаха (Me, Q1 — Q3). Для проверки значимости различий в случае двух групп применяли непараметрический критерий Манна–Уитни, а в случае более двух групп — критерий Краскела–Уоллиса. Для исследования связей между переменными рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Межгрупповые различия и регрессионные коэффициенты считали статистически достоверными при p<0,05.

Результаты

Случаи пФСГС и IgAN характеризовали типичные клинические и морфологические паттерны (см. таблицу; рис. 3). В сравнении с IgAN более высокая протеинурия и гипоальбуминемия, наблюдаемые в группе пФСГС и являющиеся типичными симптомами болезни, отражали более тяжелое повреждение подоцитов (см. таблицу). В группе контроля показатели протеинурии были в пределах нормы, а возраст достоверно больше, чем в экспериментальных группах (см. таблицу). Более низкие значения расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ) по сравнению с группами IgAN и пФСГС, вероятно, были обусловлены возрастными и/или сосудистыми изменениями почек (см. таблицу).

Рис. 3. Репрезентативные светооптические и ультраструктурные изменения гломерул (подоцитов) при IgA-нефропатии и фокально-сегментарном гломерулосклерозе (ФСГС).

а — IgA-нефропатия. Экспансия мезангиального матрикса с сегментарной пролиферацией (белая стрелка), сегментарный склероз капиллярных петель (черная стрелка) и сегментарная эндокапиллярная гиперклеточность, ×400; б — ФСГС. Классический (NOS) тип сегментарного склероза капиллярных петель без признаков гиперклеточности в структурах гломерулы (белые стрелки), ×400; в — IgA-нефропатия. Многочисленные вакуоли в цитоплазме подоцитов (*) при относительной сохранности клеточных органелл. Очаговое слияние вторичных отростков цитоподий (до 25% длины гломерулярной базальной мембраны) подоцитиов (белые стрелки), ×6000; г — ФСГС. Гигантские вакуоли в цитоплазме подоцитов с признаками фокального цитоплазматического некроза (*) и блеббинга. Тотальное слияние вторичных отростков цитоподий (до 90% длины гломерулярной базальной мембраны) подоцитов (белые стрелки), ×6000.

а, б –PAS-реакция, в, г — трансмиссионная электронная микроскопия.

Площадь почечного тельца, клубочка и пространства капсулы Шумлянского–Боумена не различались между группами пФСГС и IgAN (рис. 2), как и рСКФ (см. таблицу).

Рис. 2. Усредненные количественные характеристики почечного тельца в группах негативного контроля (NC), IgA-нефропатии (IgAN) и первичного фокально-сегментарного гломерулосклероза (пФСГС).

Клубочки почек у пациентов с пФСГС были без признаков гиперклеточности с закономерным склерозом отдельных капиллярных петель (см. рис. 3, б). Типичные ультраструктурные изменения подоцитов были представлены гигантскими вакуолями в цитоплазме с признаками фокального цитоплазматического некроза и блеббинга, диффузным распластыванием цитоподий (во всех случаях от 80 до 100% периметра гломерулярной базальной мембраны) (см. рис. 3, б, г). При IgAN, как правило, находили сегементарную мезангиальную и эндокапиллярную гиперклеточность как отражение воспалительного характера болезни (см. рис. 3, а). Выраженность повреждения подоцитов и протеинурия при IgAN были закономерно меньше (см. рис. 3, а, в).

В целом высокие медианные значения рСКФ и небольшая доля глобального и сегментарного гломерулосклероза в экспериментальных группах (см. таблицу) указывали на относительно раннюю стадию изучаемых болезней.

В пределах клубочка WT1 определяли в ядре и цитоплазме подоцитов (рис. 4, а–в), а также в ядрах эпителиоцитов капсулы Шумлянского–Боумена (см. рис. 4, а–в). Доля WT1-позитивной площади клубочка была ниже в группах пФСГС и IgAN по сравнению с негативным контролем (рис. 4, д); экспрессия WT1 в париетальном эпителии была ниже при пФСГС по сравнению с контролем и IgAN (рис. 4, е). В объединенной группе экспрессия WT1 негативно коррелировала с суточной потерей белка (r=-0,50, p=0,006, см. рис 4, г).

Рис. 4. Репрезентативные микрофотографии и количественная морфометрия экспрессии белка WT1 в клубочках.

а — группа негативного контроля (NC); б — группа позитивного контроля (IgAN); в — экспериментальная группа (первичный ФСГС, FSGS); г — корреляция гломерулярной экспрессии WT1 и суточной потери белка в группах исследования; д — количественная морфометрия, гломерулярная экспрессия WT1; е — экспрессия WT1 в париетальном эпителии.

а—в — иммуногистохимическая реакция, шкала — 50 мкм.

В клубочке виментин был экспресссирован в цитоплазме подоцитов и единичных париетальных эпителиоцитах капсулы Шумлянского–Боумена (рис. 5, а–в). В группах пФСГС и IgAN наблюдали одинаково выраженное небольшое, но статистически достоверное увеличение площади гломерулярной экспрессии виментина по сравнению с контролем (рис. 5, г).

Рис. 5. Репрезентативные микрофотографии и количественная морфометрия экспрессии виментина в клубочках.

а — группа негативного контроля (NC); б — группа позитивного контроля (IgAN); в – экспериментальная группа (первичный ФСГС, FSGS); г– количественная морфометрия экспрессии виментина в клубочке; д — экспрессия виментина в париетальном эпителии; шкала — 50 мкм.

а — в — иммуногистохимическая реакция, шкала — 50 мкм.

В клубочке десмин был локализован преимущественно в цитоплазме подоцитов, а также париетальных эпителиоцитов. Слабое неспецифическое окрашивание определяли в мезангиальных клетках (рис. 6, а–в). При пФСГС распространенность экспрессии десмина в клубочке варьировала в широких пределах, но была достоверно выше, чем в группах негативного контроля и IgA нефропатии (рис. 6, г). В париетальном эпителии экспрессия десмина была выше по сравнению с IgAN (рис.6, д).

Рис. 6. Репрезентативные микрофотографии и количественная морфометрия экспрессии десмина в клубочках.

а — минимальная экспрессия десмина в группе негативного контроля (NC); б — группа позитивного контроля (IgAN); в — экспериментальная группа (первичный ФСГС, FSGS); г — количественная морфометрия гломерулярной экспрессии десмина; д — экспрессия десмина в париетальном эпителии.

а — в — иммуногистохимическая реакция, шкала — 50 мкм.

При качественном конфокально-микроскопическом исследовании локализации десмина и WT1 в подоцитах выявлены различия между пФСГС и IgAN (рис. 7). При IgAN детектировали равномерный сигнал WT1 в подоцитах и значительно менее выраженную гранулярную экспрессию десмина (см. рис. 7, IgA-нефропатия). В случае пФСГС экспрессия WT1 была существенно снижена в отдельных сегментах клубочка, а четкий сигнал десмина регистрировали в неэкспрессирующих WT1 подоцитах (см. рис. 7, а, б фокально-сегментарный гломерулосклероз). Вместе с тем, гранулярную экспрессию десмина также наблюдали в некоторых WT1-позитивных подоцитах (рис. 7, в фокально-сегментарный гломерулосклероз).

Рис. 7. Конфокальная микроскопия экспрессии WT1 и десмина.

IgA-нефропатия (клубочек пациента с IgA-нефропатией и протеинурией 1,5 г): преобладает экспрессия WT1 (красный), экспрессия десмина (зеленый) менее выражена; фокально-сегментарный гломерулосклероз (клубочек пациента с пФСГС и протеинурией 7 г): а — экспрессия WT1 в подоцитах (красный), б — экспрессия десмина (зеленый) в WT1-негативных зонах, в — коэкспрессия WT1 (красный) и десмина (желтый, гранулярное окрашивание) в отдельных подоцитах. Residual — остаточная флюоресценция.

Обсуждение

Фокально-сегментарный гломерулосклероз относится к болезням с доминирующим повреждением подоцитов — подоцитопатиям [2]. Будучи одним из основных типов клеток клубочков, подоциты играют центральную роль в клубочковой ультрафильтрации, проницаемости и поддержании целостности гломерулярной базальной мембраны. Напротив, повреждение подоцитов приводит к их депопуляции, снижению эффективности клубочковой фильтрации, появлению протеинурии и гломерулосклероза — типичным проявлениям ФСГС [2].

Фокально-сегментарный гломерулосклероз гетерогенен по этиологии [3, 12], а причинами его развития могут быть генные мутации, вирусная инфекция, структурная и функциональная адаптация, лекарственная токсичность и злокачественные новообразования [13]. Первичный ФСГС остается идиопатической болезнью [2]. Предполагают, что пФСГС может быть обусловлен воздействием на подоциты циркулирующих факторов, приводящих к альтерациям этих клеток и резкому нарушению проницаемости гломерулярного барьера для макромолекул [6, 13].

Мы обнаружили, что клинико-морфологические проявления пФСГС отчетливо ассоциированы с депрессией WT1 в подоцитах. Так, WT1, главный транскрипционный фактор подоцитов регулирует профиль генов, критичных для дифференцировки, созревания, поддержания эпителиального фенотипа клеток и их выживания [14]. В экспериментальных и клинических моделях генетически обусловленное снижение экспрессии WT1 приводило к депрессии нисходящих генов-мишеней и катастрофическим нарушениям всей системы цитоскелета подоцитов [15, 16].

Типичные для пФСГС нарушения цитоскелета малых отростков подоцитов, базовым молекулярным компонентом которого является актин, проявляются их диффузным распластыванием при электронной микроскопии (см. рис. 3, г). Полученные пилотные данные о повышении экспрессии десмина и виментина при пФСГС могут свидетельствовать о более глубокой патологической перестройке цитоскелета, выходящей за пределы цитоподий второго порядка и ранее продемонстрированной экспериментально [17]. Эти молекулы являются основными компонентами промежуточных филаментов (ПФ), составляющими вместе с микротрубочками (МТ) каркас тела и цитоподий первого порядка [18]. Роль ПФ заключается в обеспечении биомеханики подоцитов в условиях постоянного гемодинамического стресса [19] за счет модуляции эластичности клубочков и взаимодействия с актином [20]. ПФ также влияют на организацию МТ и микрофиламентов, участвуют в механизмах контроля клеточного цикла, выживаемости клеток и апоптоза [19, 21–23].

Полученные данные позволяют предполагать, что изменения белков ПФ не являются уникальным признаком пФСГС, поскольку подобные изменения были обнаружены и в случаях IgAN. Не исключено, что та или иная степень реаранжировки цитоскелета представляет стандартный ответ на повреждение клубочков разной этиологии, не ограничиваясь иммунными гломерулопатиями. Так, ранее изменения десмина находили в моделях экспериментальных подоцитопатий [23–26], а также у пациентов с медленно прогрессирующими неиммунными болезнями клубочков — диабетической нефропатией [27] и возрастным гломерулосклерозом [28].

Насколько нам известно, в этом исследовании впервые показано, что при пФСГС десмин может быть маркером повреждения подоцитов на относительно ранних стадиях развития болезни в отсутствие признаков выраженного гломерулосклероза и дисфункции почек. Мы предполагаем, что в условиях тяжелых нарушений актинового цитоскелета вторичных цитоподий при пФСГС гиперэкспрессия протеинов ПФ может быть механизмом защиты от избыточного сдвига напряжения со стороны стенки капилляра при изменении давления крови и сохранения интеграции структур клубочка. Повышение гломерулярной экспрессии виментина было менее выражено и, вероятно, отражает пока неизвестные механизмы дифференциальной активации белков ПФ в ответ на разные воздействия [23].

Кроме того, нам впервые в клинических моделях удалось продемонстрировать разнонаправленные изменения экспрессии WT1 и белков ПФ, которые были наиболее явными в случае пФСГС. Такие изменения могут быть следствием глубокого ре-программирования подоцитов с существенными альтерациями их фенотипа. Последние заключаются в WT1-зависимых механизмах дедифференцировки эпителия клубочка в рамках вероятного ЭМП [29, 30], к маркерам которого, в свою очередь, относятся десмин и виментин.

Возможность сосуществования разных вариантов экспрессии WT1 и десмина в подоцитах была показана при конфокальной микроскопии. В частности, при пФСНС данный метод позволил принципиально продемонстрировать существование подоцитов, экспрессирующих только WT1 или только десмин (вероятно, сохраняющих фенотип эпителия или дедифференцированных в мезенхимном направлении, соответственно). Наличие отдельных коэкспрессирующих WT1 и десмин клеток может отражать промежуточные стадии дедифференцировки подоцитов в пределах одного клубочка.

Механизмы, приводящие к депрессии WT1 и инициации ЭМП в контексте гломерулопатий вообще и пФСГС в частности, нуждаются в дальнейшем изучении. Однако очевидно, что такие изменения высокоспециализированных, полифункциональных клеток гломерулярного эпителия должны приводить к глубоким нарушениям интеграции структур клубочка, определяя быстрое прогрессирование болезни даже без снижения числа подоцитов, которое считают основным фактором гломерулосклероза [31]. Эти предположения косвенно подтверждает достоверная обратная связь WT1 и протеинурии, клинического маркера повреждения подоцитов (см. рис. 4, г).

Помимо повреждения, дедифференцировки подоцитов и уменьшения их количества вероятным фактором прогрессирования пФСГС может быть снижение потенциала репарации этой клеточной популяции. Последний частично связан с париетальным эпителием (капсулы Шумлянского–Боумена), имеющим с подоцитами общее происхождение из метанефральной мезенхимы [32].

Снижение ядерной экспрессии основного фактора регулятора подоцитарного фенотипа WT1 и более высокая экспрессия десмина в париетальном эпителии соответствуют представлениям об их вероятном ЭМП. Эти изменения, обнаруженные впервые, могут отражать неизученные ранее механизмы прогрессирования пФСГС. Так, низкая экспрессия WT1 клетками париетального эпителия может быть связана со снижением их репарационного потенциала [14] в отношении популяции поврежденных подоцитов при пФСГС [32]. Мы также предполагаем, что отчетливое увеличение экспрессии десмина в эпителиоцитах капсулы связано с вероятным ЭМП, повышением их мобильности и фиброгенных свойств. Замещение такими клетками участков поверхности капиллярных петель, утративших подоцитарное покрытие, может быть механизмом развития склероза капиллярных петель — центрального фактора прогрессирования пФСГС [32].

Представленное поисковое исследование имеет ряд ограничений, требующих осторожности при интерпретации его результатов. К ним, во-первых, относится малое число случаев в группах, что могло повлиять на результаты сравнительного анализа. Вместе с тем данное ограничение было связано с жесткими критериями включения, потребовавшего тщательного отбора надежно доказанных клинико-морфологически случаев исследуемых болезней. В результате такие тщательно подобранные экспериментальные группы делают полученные данные достаточно надежными по крайней мере для планирования и продолжения исследований в этой области. Во-вторых, контроль не был представлен образцами абсолютно здорового органа, поскольку субъекты этой группы были существенно старше, имели более низкую расчетную скорость клубочковой фильтрации по сравнению с экспериментальными и признаки незначительного гломерулосклероза (вероятно, в результате сосудисто-ишемических изменений). Однако отсутствие патологической протеинурии позволило надежно исключить существенное текущее повреждение подоцитов в этой группе и использовать ее в сравнительных анализах в качестве негативного контроля.

Заключение

Таким образом, в этом поисковом исследовании мы показали разнонаправленные изменения гломерулярной экспрессии WT1 и белков промежуточных филаментов при пФСГС и IgAN. Выявленные молекулярные альтерации могут косвенно указывать на генетическое репрограммирование подоцитов и эпителия капсулы клубочка в рамках эпителиально-мезенхимального перехода и определять структурно-функциональные нарушения этих клеток, более выраженные в случае пФСГС.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда №23-15-00510.

В исследовании использовали оборудование ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ (дополнительное соглашение № 4 к Соглашению №С-111/24 от 24.02.2021 г. ID НП: С-111/24) и Центра коллективного пользования «Конфокальная микроскопия» Института физиологии им. ак. И.П. Павлова РАН.

Участие авторов:

Концепция, дизайн исследования — Богданова Е.О., Добронравов В.А.

Сбор и анализ клинических и морфологических данных — Сиповский В.Г., Богданова Е.О., Кочоян З.Ш., Анпилова А.О., Нарыгина Д.С., Костин Н.Ф., Добронравов В.А.

Подготовка проекта публикации — Богданова Е.О.

Редактирование — Добронравов В.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.