Введение

Поиск эффективных методов лечения хронических заболеваний вен (ХЗВ) является одной из актуальных проблем современной медицины, поскольку эта патология вызывает широкий спектр симптомов вплоть до трофических изменений кожи и окружающих тканей, формирования венозных язв.

Патогенез ХЗВ является сложным и многокомпонентным [1]. Ремоделирование венозной стенки известно как один из ведущих механизмов развития варикозной болезни. Эндотелий поддерживает регуляцию тонуса сосудов, процессов воспаления, коагуляции, ангиогенеза, пролиферации гладкомышечных клеток, лейкоцитарных взаимодействий путем синтеза широкого спектра вазоактивных молекул [2]. Дисфункция эндотелия и сосудистое воспаление лежат в основе процесса ремоделирования сосудов.

Биофлавоноиды являются одними из наиболее часто применяемых средств в лечении пациентов с ХЗВ, активно изучается их потенциальное использование и при других нозологиях [3]. Гесперидин и диосмин — пролекарства, которые превращаются в организме в их активные метаболиты — гесперетин и диосметин, оказывающие основные терапевтические эффекты: выраженные антиоксидантное, противовоспалительное и венотонизирующее действия. Комбинация вышеуказанных биофлавоноидов способствует уменьшению повреждения и активации эндотелия, а также адгезии лейкоцитов, позволяя сохранять целостность капилляров и улучшать венозный тонус [4, 5].

Среди основных маркеров ремоделирования сосудистой стенки известны фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor, vWF), молекула клеточной адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам-1 1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1, или CD31), фибронектин (fibronectin, FN), виментин (vimentin, VIM), ингибитор активации плазминогена 1-го типа (plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1). vWF и CD31 являются специфичными маркерами эндотелиальных клеток, FN и VIM — клеток мезенхимального происхождения [6]. Вышеуказанные показатели отражают ремоделирование сосудистой стенки с позиции эндотелиально-мезенхимального перехода (endothelial mesenchymal transition, EndMT), одним из потенциальных маркеров которого в том числе является PAI-1.

Влияние биофлавоноидов, включая гесперидин и диосмин, на молекулярно-клеточные механизмы ремоделирования сосудов и воздействие их на отдельные клеточные элементы стенки вен у пациентов с ХЗВ остаются не до конца изученными. Активное использование клеточных технологий в последние десятилетия позволяет изучать сложные молекулярных процессы in vitro на специфичных для того или иного патологического или физиологического процесса клеточных культурах [7].

Цель исследования — изучить влияние активных метаболитов биофлавоноидов гесперидина и диосмина (гесперетина и диосметина) на уровень маркеров ремоделирования (PAI-1, FN, VIM, vWF, CD31) в первичной культуре эндотелиальных клеток пуповины человека (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) in vitro.

Материал и методы

Исследование выполнено на первичных культурах HUVEC. Пуповины забирали от здоровых женщин-доноров, подписавших информированное согласие. Биоматериал был получен после физиологических родов или операции кесарева сечения. Пуповину помещали в стерильный транспортный контейнер с культуральной средой. После поступления в лабораторию клеточных технологий пуповину тщательно отмывали от крови, обильно обрабатывали 70% этиловым спиртом во избежание контаминации микроорганизмами и слегка массировали для удаления сгустков из сосудов. Затем пуповинную вену промывали от тромбов, после чего заполняли ее 0,1% раствором коллагеназы, пережимали зажимами и помещали на 20 мин в CO₂-инкубатор при 37 °C. После извлечения из CO₂-инкубатора содержимое пуповины помещали в центрифужную пробирку с параллельным осторожным массированием. После центрифугирования в течение 5 мин при 500g супернатант удаляли, клеточный осадок ресуспендировали и центрифугировали повторно в течение 5 мин при 500g для окончательного удаления коллагеназы, после чего супернатант вновь удаляли. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в культуральной ростовой среде ECGM и бережно гомогенизировали путем пипетирования. Клетки засеивали в культуральные флаконы, предварительно обработанные 0,1% желатином, после чего на 24 ч помещали в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂. Через сутки производили смену среды и микроскопию клеток. Смену питательной среды осуществляли 1 раз в 48 ч. По достижении 80—90% плотности монослоя (конфлюэнтности) и после подсчета на автоматическом счетчике количества жизнеспособных клеток пересеивали на лабораторный пластик большей площади для наращивания количества [8]. Полученные клетки засеивали на 6-луночные планшеты. После достижения монослоя выполняли эксперимент. К монослою клеток в культуральную среду добавляли тестируемые вещества в концентрациях: диосметин 1,5 мкМ, гесперетин 0,5 мкМ, комбинация диосметин 1,5 мкМ+гесперетин 0,5 мкМ; диосметин 15 мкМ, гесперетин 5 мкМ, комбинация диосметин 15 мкМ+гесперетин 5 мкМ; диосметин 150 мкМ, гесперетин 50 мкМ, комбинация диосметин 150 мкМ+гесперетин 50 мкМ. В контрольные лунки добавляли питательную среду, содержащую 1% ДМСО — растворитель тестируемых веществ. Длительность инкубации составляла 24 ч. Каждый эксперимент повторяли трижды.

Далее из культур клеток готовили клеточные лизаты согласно общепринятым протоколам (Western Blot Protocol Bio-Rad, США) [9]. Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически. Молекулярная масса PAI-1, FN, VIM, vWF, CD31 была подтверждена путем сравнения с маркерами молекулярной массы (Bio-Rad, США). Содержание PAI-1, FN, VIM, vWF, CD31 оценивали относительно уровня белка домашнего хозяйства GAPDH 68 (Invitrogen, США).

Выбор концентраций тестируемых веществ был обусловлен их концентрацией в плазме крови после приема лекарственных веществ, содержащих диосмин и гесперидин, используемыми концентрациями диосметина в исследованиях in vitro и результатами, полученными in vitro при оценке влияния тестируемых веществ на уровень маркеров ремоделирования в образцах вен пациентов [10—12]. В настоящей работе использовали активные метаболиты субстанций гесперидина и диосмина, которые предоставила компания ООО «Биннофарм Групп» (препарат ВЕНАРУС).

Статистический анализ. Полученные результаты анализировали с помощью программ GraphPad Prism Version 9.5.0. Результаты представлены в виде M±SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения с контролем выполняли с помощью критерия Тьюки. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

Изменения относительного количества изучаемых показателей в первичных культурах HUVEC при воздействии разных концентраций гесперетина, диосметина и их комбинаций представлены в таблице и на рис. 1—15.

Изменение относительного количества изучаемых показателей при воздействии разных концентраций гесперетина (Г), диосметина (Д) и их комбинаций (%)

Примечание. Г — гесперетин; Д — диосметин; Д+Г — комбинация диосметина и гесперетина; VIM — виментин; vWF — фактор фон Виллебранда; CD31 — молекула клеточной адгезии 1; PAI-1 — ингибитор активации плазминогена 1-го типа; FN — фибронектин; Н/з — нет значимого влияния.

Рис. 1. Влияние диосметина (1,5 мкМ), гесперетина (0,5 мкМ) и их комбинации на относительное количество виментина в клетках HUVEC.

Здесь и на рис. 2—15: а — результаты детекции; б — результаты денситометрического анализа; ns — нет статистически значимых различий относительно группы ДМСО 1%. * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001; ns — нет статистически значимых различий.

Рис. 2. Влияние диосметина (15 мкМ), гесперетина (5 мкМ) и их комбинации на относительное количество виментина в клетках HUVEC.

Рис. 3. Влияние диосметина (150 мкМ), гесперетина (50 мкМ) и их комбинации на относительное количество виментина в клетках HUVEC.

Рис. 4. Влияние диосметина (1,5 мкМ), гесперетина (0,5 мкМ) и их комбинации на относительное количество фактора Виллебранда в клетках HUVEC.

Рис. 5. Влияние гесперетина (5 мкМ), диосметина (15 мкМ) и их комбинации на относительное количество фактора Виллебранда в клетках HUVEC.

Рис. 6. Влияние гесперетина (50 мкМ), диосметина (150 мкМ) и их комбинации на относительное количество фактора Виллебранда в клетках HUVEC.

Рис. 7. Влияние гесперетина (0,5 мкМ), диосметина (1,5 мкМ) и их комбинации на относительное количество CD31 в клетках HUVEC.

Рис. 8. Влияние гесперетина (5 мкМ), диосметина (15 мкМ) и их комбинации на относительное количество CD31 в клетках HUVEC.

Рис. 9. Влияние гесперетина (50 мкМ), диосметина (150 мкМ) и их комбинации на относительное количество CD31 в клетках HUVEC.

Рис. 10. Влияние гесперетина (0,5 мкМ), диосметина (1,5 мкМ) и их комбинации на относительное количество PAI-1 в клетках HUVEC.

Рис. 11. Влияние гесперетина (5 мкМ), диосметина (15 мкМ) и их комбинации на относительное количество PAI-1 в клетках HUVEC.

Рис. 12. Влияние гесперетина (50 мкМ), диосметина (150 мкМ) и их комбинации на относительное количество PAI-1 в клетках HUVEC.

Рис. 13. Влияние гесперетина (0,5 мкМ), диосметина (1,5 мкМ) и их комбинации на относительное количество фибронектина в клетках HUVEC.

Рис. 14. Влияние гесперетина (5 мкМ), диосметина (15 мкМ) и их комбинации на относительное количество фибронектина в клетках HUVEC.

Рис. 15. Влияние гесперетина (50 мкМ), диосметина (150 мкМ) и их комбинации на относительное количество фибронектина в клетках HUVEC.

Обсуждение

В настоящем исследовании изучено влияние активных метаболитов биофлавоноидов гесперидина и диосмина (гесперетина и диосметина), а также их комбинации на показатели ремоделирования венозной стенки PAI-1, FN, VIM, vWF, CD31 в первичных культурах эндотелиоцитов HUVEC in vitro.

Активные метаболиты гесперетин и диосметин, эффекты которых исследовались в настоящей работе, были получены из субстанций Гесперидин и Диосмин, применяемых в производстве препарата ВЕНАРУС (ООО «Биннофарм Групп»).

vWF — белок, который был впервые описан в 1924 г. шведским врачом Эриком фон Виллебрандом. Этот белок вырабатывается эндотелиальными клетками, которые выстилают внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, и хранится в α-гранулах тромбоцитов. Его основная функция заключается в обеспечении прикрепления тромбоцитов к поврежденной стенке сосуда и их агрегации, что приводит к образованию тромба и остановке кровотечения. vWF также стабилизирует фактор коагуляции VIII (FVIII) в крови, что важно для нормального функционирования системы свертывания крови. Важной функцией vWF является адгезия тромбоцитов к зоне нарушения целостности сосудистой стенки, что осуществляется путем связывания мультимерного комплекса vWF со специфическими гликопротеинами мембраны тромбоцитов и с компонентами соединительной ткани. vWF является одним из главных маркеров принадлежности клеток к эндотелиальным [13].

CD31 является трансмембранным белком, принадлежащим к семейству молекул клеточной адгезии иммуноглобулинового суперсемейства. Он участвует в формировании и поддержании межклеточных соединений, которые связывают эндотелиальные клетки, образуя барьер, регулирующий проницаемость сосудов и контролирующий движение жидкостей и клеток между кровью и тканями; является ключевым регулятором диапедеза лейкоцитов; играет роль в ангиогенезе и свертывании крови. CD31 помимо межклеточных контактов эндотелиальных клеток может экспрессироваться на поверхности тромбоцитов и лейкоцитов. CD31, наряду с vWF, является ключевым маркером эндотелиальных клеток [14].

FN — белок внеклеточного матрикса, который играет ключевую роль в адгезии клеток, миграции, пролиферации и дифференцировке. Он синтезируется клетками многих типов, включая фибробласты, эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки, и секретируется во внеклеточное пространство, где связывается с компонентами внеклеточного матрикса и поверхностными рецепторами клеток. FN участвует в формировании и поддержании структуры тканей, а также в процессах заживления ран и регенерации тканей. Является одним из маркеров сложного молекулярного процесса — эндотелиально-мезенхимального перехода, потенциально задействованного в таких заболеваниях, как сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания [15].

VIM представляет собой белок промежуточных филаментов, который обычно экспрессируется в мезенхимальных клетках, таких как фибробласты, гладкомышечные клетки, макрофаги и нейроны. Он играет важную роль в поддержании структуры и механической устойчивости клеток, их миграции и дифференцировке, а также в формировании межклеточных контактов, что важно для нормального функционирования клеток и тканей. VIM задействован в поддержании и закреплении положения органелл в цитоплазме, формы клеток, целостности цитоплазмы и стабилизации взаимодействий цитоскелета. Наряду с FN, этот белок рассматривается в качестве маркера эндотелиально-мезенхимального перехода [16].

PAI-1 — белок, который производится в печени и секретируется в кровь. Он играет важную роль в регуляции фибринолиза — процесса, при котором плазмин разрушает фибрин, основной компонент тромба. PAI-1 ингибирует активаторы плазминогена, такие как тканевой активатор плазминогена (tPA) и урокиназа, тем самым предотвращая чрезмерное разрушение тромба и поддерживая нормальное свертывание крови. Однако повышенный уровень PAI-1 связан с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку это может привести к образованию тромбов и блокированию сосудов. Кроме участия PAI-1 в процессах гемостаза и деградации внеклеточного матрикса, PAI-1 в настоящее время рассматривается в качестве маркера клеточного старения (сенесценции) и потенциального маркера эндотелиально-мезенхимального перехода [17—19]. Обычно PAI-1 экспрессируется в эндотелиальных клетках, но его уровень может повышаться в условиях перехода от эндотелия к мезенхиме, что указывает на возможную роль этого белка в процессе ремоделирования сосудистой стенки при варикозной болезни нижних конечностей (ВБНК). Повышенная экспрессия PAI-1 может способствовать усилению фиброза и нарушению нормальной функции эндотелия, что вносит вклад в развитие и прогрессирование ВБНК.

Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что все изученные вещества оказывают воздействие на уровень вышеуказанных маркеров в культуре первичных эндотелиоцитов HUVEC как по отдельности, так и в комбинации.

Следует отметить, что гесперетин в концентрации 0,5 и 5 мкМ снижал уровень vWF, что указывает на его значимое воздействие на ключевой показатель воспаления и гемостаза. Более высокая концентрация гесперетина (50 мкМ) приводила к снижению относительного количества CD31, что может свидетельствовать о его влиянии на межклеточные контакты эндотелиальных клеток.

Диосметин во всех изученных концентрациях снижал уровень vWF, что также может указывать на его антитромботические и противовоспалительные свойства. Более высокие концентрации диосметина приводили к снижению относительного количества VIM и CD31, что может свидетельствовать о его влиянии на структуру эндотелиальных клеток.

Комбинация гесперетина и диосметина продемонстрировала наиболее выраженное воздействие на маркеры ремоделирования, концентрации 150 мкМ/50 мкМ и 15 мкМ/5 мкМ приводили к снижению относительного количества VIM, CD31, PAI-1 и FN, что может указывать на комплексное влияние этой комбинации на эндотелий сосудов.

Полученные в ходе эксперимента результаты свидетельствуют о том, что гесперетин, диосметин и их комбинация могут оказывать значимое воздействие на эндотелий сосудов, предотвращая развитие процессов, связанных с ремоделированием сосудов.

Полученные результаты коррелируют с данными других авторов. В частности, гесперетин обладает антиоксидантной, противовоспалительной и антиканцерогенной активностью, снижает уровень липидов и холестерина в крови [20]. P. Mandal и соавт. в 2019 г. показали противоопухолевые, антиоксидантные и гиполипидемические свойства диосметина. Кроме того, диосметин способствовал повышению венозного тонуса и улучшению микроциркуляции, а также снижал системный окислительный стресс и обеспечивал защиту капилляров. В работе О.Б. Талибова продемонстрировано, что диосметин оказывает влияние на процессы свертывания крови, подавляя локальную агрегацию тромбоцитов, активируя фибринолиз и уменьшая проницаемость капилляров, тем самым способствуя улучшению микроциркуляции и предотвращая развитие тромбоза [21].

Таким образом, результаты настоящего исследования подтверждают целесообразность использования комбинации двух компонентов (гесперидин и диосмин) для профилактики и лечения заболеваний, связанных с ремоделированием эндотелия вен. Для подтверждения этих выводов могут быть проведены дальнейшие in vitro и in vivo исследования с использованием строгих методов анализа и оценки.

Заключение

Активные метаболиты гесперидина и диосмина (гесперетин и диосметин) оказывают значимое воздействие на уровень маркеров ремоделирования в первичной культуре эндотелиальных клеток HUVEC, при этом у гесперетина отмечалось умеренное влияние, у комбинации гесперетина и диосметина — наиболее выраженное.

Полученные данные косвенно свидетельствуют о целесообразности использования комбинации двух компонентов (гесперидин и диосмин) для значимого влияния на уровень маркеров ремоделирования в эндотелии сосудов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Сучков И.А., Калинин Р.Е., Мжаванадзе Н.Д.

Сбор и обработка материала — Мжаванадзе Н.Д., Щулькин А.В., Абаленихина Ю.В., Назимова Е.И.

Статистическая обработка данных — Щулькин А.В., Абаленихина Ю.В.

Написание текста — Щулькин А.В., Мжаванадзе Н.Д., Назимова Е.И.

Редактирование — И.А. Сучков, Р.Е. Калинин

Конфликт интересов: Исследование выполнено при поддержке ООО «Биннофарм Групп».

Conflict of interest: The study was supported by the Binnopharm Group LLC.