На данном этапе развития клинической и морфологической наук исследуют проявление черепно-мозговой травмы (ЧМТ) для установления клинических и морфологических критериев диффузного аксонального повреждения (ДАП). Основная часть исследований проводится на животных in vivo. Предложена модель CHIMERA (Closed-Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration), с помощью которой на мышах моделируется повреждение нервной системы при ротационном движении [1, 2]. Данная модель наиболее близка к изменениям, которые возникают у людей при ДАП. При серебрении срезов ткани зрительного нерва, обонятельной луковицы, мозолистого тела выявлены варикозное расширение аксонов, активация микроглии. Исследовали белки плазмы крови, специфичные для ЧМТ, особое внимание уделялось S-100, tau-белкам, фосфорилированной субъединице NF-N нейрофиламента [3—7].

Подобные исследования некоторые ученые [8—10] проводили на свиньях и мышах. Наиболее перспективным является изучение биомаркеров нервной системы, которые могут быть специфичными не только для диагностики повреждения нервной ткани, но и для прогноза тяжести состояния и динамики восстановления после нейротропной терапии [11]. Для этого требуется полное понимание основных клеточных и молекулярных механизмов вторичного повреждения нейронов после ЧМТ. Разнообразие клеток в месте повреждения после ЧМТ, таких как нейроны, глия, воспалительные и эндотелиальные, позволяет отследить последствия травмы на конкретных видах клеток в течение различных временны́х промежутков. Ценным дополнительным инструментом является моделирование травмы in vitro на клеточной культуре. Модели могут быть использованы для идентификации возможных биомаркеров, установления их клеточного источника и функции, для дальнейшей их оценки в естественных условиях. Установили, что клеточные модели in vitro на 90% близки к процессам, протекающим в естественных условиях in vivo, что подтверждает их пользу [12]. Разработано несколько различных моделей ЧМТ: статическое механическое повреждение (рассечение, сжатие и баротравма), динамическая механическая травма (ускорение/замедление), гидродинамическая травма, модели клеточного растяжения [13]. Несмотря на некоторое упрощение этих моделей in vivo, многие аспекты посттравматических изменений воспроизводятся в культивируемых клетках, особенно ультраструктурные изменения, ионные нарушения, изменения в электрофизиологии и продукция свободных радикалов. C. Loov и соавт. [14—16] использовали модель «травмы-царапины» на смешанной культуре первичных нейронов, астроцитов и олигодендроцитов без каких-либо элементов микроглии, чтобы определить белки, которые специфически экспрессируются непосредственно и в клетках, и в окружающей среде через 24 ч после травмы. Модель заключается в локальной травматизации клеток, с четкой границей от окружающих неповрежденных клеток [14]. Важные преимущества модели — высокая воспроизводимость и хорошая видимость травмы, что позволяет сравнить реакцию травмированных и прилежащих неповрежденных клеток. Модель подходит для покадровой микроскопии отдельных клеток, иммуногистохимического (ИГХ) и масс-спектрометрического (MS) анализов белков в клетках и окружающей среде. Благодаря своей простоте модель имеет некоторые ограничения, но при этом является хорошим инструментом для скрининга биомаркеров. Исследовали клетки коры головного мозга мышей фенотипа E14, дифференцирующиеся в течение 8 дней в нейроны, астроциты и олигодендроциты [16]. Клеточный слой резали скальпелем 20 раз в двух направлениях. После травмы клеточные кластеры инкубировали в течение 24 ч, фиксировали и обрабатывали иммуноцитохимическим методом для выявления специфических маркеров нейронов (βIII tubulin), астроцитов (GFAP) и олигодендроцитов (CNPase). Путем ИГХ и покадровой микроскопии для подробного изучения изменений белков, экспрессирующих на различных этапах после травмы, исследовали такие общеклеточные процессы, как деление, гибель клеток, миграция, синтез актина [17]. Обнаружили интересное явление — манифестацию после травмы нескольких актинассоциированных белков, хотя сам актин не был выявлен. Два из них эзрин и моэзин представляют особый научный интерес, так как они высоко манифестируют в MS-экспериментах травмы мозга in vivo [18]. Эзрин и моэзин обычно находятся внутриклеточно вместе с радиксином и упоминаются как белки Ezrin/Мoezin /Radixin (ERM-белки). Радиксин не был идентифицирован как специфический фактор повреждения, однако выявление ERM-белков может нести дополнительную информацию, учитывая их внутриклеточную функцию.

Основным преимуществом приведенной системы по сравнению с традиционным нейронно-глиальным культивированием является то, что клетки культивируют вместе в одном виде среды на протяжении всего эксперимента, что исключает изменение в экспрессии белка в результате смены среды. Кроме того, культура на основе нейронных стволовых клеток позволяет культивировать нейроны, астроциты и олигодендроциты без каких-либо микроглиальных и прочих клеток, которые могут вызывать помехи в эксперименте.

Покадровая микроскопия показала, что в первые минуты после травмы выявляется максимальная дегенерация нейронов и глии возле разреза, после чего клетки начинают восстанавливаться. Сам разрез не убивает клетки, если он не проходит напрямую через ядра или вблизи них. С помощью покадровой съемки ИГХ βIII тубулина и фаллоидина (для идентификации актина из конуса роста аксонов) пока установили, что регенерирующие нейроны растут вдоль линии повреждения, кроме того, нейроны активно мигрируют в направлении очага повреждения и вдоль него. Астроциты восстанавливают свои функции после травмы быстрее, чем нейроны, но не мигрируют в направлении повреждения. ИГХ-анализ GFAP и фаллоидина выявил, что ламеллоподии астроцитов достигают места повреждения, но очень редко пересекают его. Олигодендроциты после травмы ведут себя иначе, чем другие виды клеток. Некоторые из них диффузно экспрессируют актинсвязанные белки, и лишь единичные имеют актиновые расширения на концах: регенерация олигодендроцитов после повреждения менее выражена, чем астроцитов. Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать белки, наиболее специфичные для травматического повреждения. С помощью MS провели поиск возможных биомаркеров травмы нервной ткани как внеклеточных, так и внутриклеточных белков, рано выявляющихся после травмы. В результате очень строгого отбора критериев обнаружили 53 белка в среде после травмы. Клеточная фракция содержала 46 специфичных для травмы белков.

Актин является одним из наиболее распространенных белков в клетке и функционирует в клеточной структуре во время миграции, пролиферации, клеточной сигнализации и фагоцитоза [19]. Интересный результат обнаружили при проведении MS: некоторые из самых высоких сложных белков, обнаруженных после травмы во фракции среды, имели свойства, родственные актину, хотя таковые считаются внутриклеточными белками. Из 53 специфичных травме белков 15 (28%) были связаны с актином. Сам актин не обнаружили, что делает вероятным тот факт, что белки, родственные актину, свободно выходят во внеклеточное пространство как реакция на травму. В отличие от фракции среды поврежденные клетки имели более низкую экспрессию актинассоциированных белков (4 из 46,9%). Появление после травмы во внеклеточном пространстве белков, которые в нормальных условиях находятся исключительно внутриклеточно, обусловливает возможность их использования в качестве биомаркеров травмы.

Два актинассоциированных белка — эзрин и моэзин представляют особый интерес, так как их экспрессия, как известно, повышается после травмы мозга in vivo [18]. Для установления типа клеток, вырабатывающих ERM-белки и их активную фосфорилированную форму pERM, провели ИГХ-исследование со специфическими антителами против ERM-белков и pERM в сочетании с маркерами клеточных типов: GFAP (астроциты), βIII тубулин (нейроны) и CNPase (олигодендроциты). Перед травмой большинство астроцитов не имели специфических проявлений ERM, в то время как поврежденные астроциты показывали пальцевидную экспрессию в ламеллоподиях. Напротив, нейроны и олигодендроциты абсолютно не выражали какую-либо ERM- или рERM-активность, т. е. экспрессию белка в ответ на повреждение не выявили. Это свидетельствует о том, что астроциты являются наиболее вероятным источником внеклеточных эзрина и моэзина, найденных в среде после травмы. Для подтверждения того, что эзрин и моэзин присутствуют после ЧМТ in vivo, взрослых мышей подвергали контролируемому корковому повреждению (CCI). Иммунофлюоресцентная визуализация показала, что результаты in vitro соответствуют исследованиям in vivo.

Покадровая съемка и ИГХ нейронов показали четкую их регенерацию после повреждения. Сравнили нейроны с конусами роста вдоль травмы и в неповрежденных участках путем ИГХ с βIII тубулином и фаллоидином. Отметили значительное увеличение доли нейронов с конусами роста вокруг травмы по сравнению с контролем без повреждения. В поврежденной области 100% нейронов имели конусы роста, в то время как в неповрежденных контрольных культурах таких нейронов было 71,1%. Различия оказались не только в количестве конусов роста, но и в качестве: конусы, приближенные к повреждению, были заметно больше, чем вне повреждения. С помощью маркера Gap43 определяли размер конусов роста в неповрежденных и поврежденных культурах путем измерения их площади. Оказалось, что размеры конусов роста в поврежденной культуре были в 3 раза больше, чем в неповрежденной. Внеклеточно также обнаружили нуклеозид дифосфаткиназу A (NDKA), представляющую научный интерес, так как было показано, что она стимулирует рост аксонов [20]. Два других белка, обнаруженных вне клеток (ARP2 и MARCS), важны для образования ламеллоподий [21, 22]. ARP2 является, кроме того, важным фактором для роста аксонов [22].

Миграция нейронов к месту повреждения была упорядочена и индуцирована хемотаксисом по сравнению с хаотической миграцией, наблюдаемой в неповрежденной культуре. В противоположность нейронам как астроциты, так и олигодендроциты были совершенно неподвижны. Тем не менее после травмы астроциты тянулись ламеллоподиями к месту повреждения, но, как отмечалось ранее, оставались неподвижными вне зоны повреждения. Белок N (G)-диметиларгинин диметиламиногидролаза 1 (DDAH1) увеличивает подвижность клеток путем задействования RhoA [23, 24]. В отличие от этого высокое содержание выявленного в среде Rho-GDI — ингибитора диссоциации 1 (GDR1), также специфичного после травмы, оказывает ингибирующее действие на миграцию клеток [25, 26]. Нейроны мигрируют к повреждению издалека, поэтому инициация этого происходит скорее всего не только вследствие внеклеточных сигналов, но и в какой-то степени благодаря топографической ориентации и сигнализации от прилежащих астроцитов, что еще не до конца изучено [27].

В среде 58% специфических белков (31 из 53 белков) и 35% (16 из 46 белков) во фракции клеток были связаны с процессами гибели клеток, регенерацией и/или пролиферацией. Покадровая микроскопия показала, что нейроны делятся чаще после травмы, чем в неповрежденной культуре клеток. Для подтверждения этого подсчитали процент делящихся клеток, имеющих специфические маркеры для нейронов, астроцитов и олигодендроцитов. Культуры окрашивали антителами к специфическим маркерам пролиферации Ki-67 и маркерами клеточного типа βIII тубулина, GFAP и CNPase. Обнаружили, что вдоль места повреждения более половины делящихся клеток (54%) были нейронами/нейробластами, некоторые из Ki-67 положительных клеток (38%) — астроцитами, но ни одна (0%) из делящихся клеток не была олигодендроцитом. Важно отметить, что большинство нейронов в системе культуры клеток хотя и экспрессировали такие нейрональные маркеры, как βIII, но не являлись полностью зрелыми.

MS-анализ показал, что белки, участвующие в регенерации, и белки, которые либо вызывают, либо уменьшают пролиферацию, такие как 14−3-3gamma (1433G), латексин, NACAM, белок NDRG2, MARCS, тимозин бета-4 (TYB4) и инсулиноподобный фактор роста—связывающий белок 2 (IBP2), можно определить внеклеточно после травмы. Наиболее интересный белок с высокой экспрессией — 1433G, являющийся фактором защиты астроцитов от постишемической гибели клеток за счет связывания активированного проапоптотического белка Bad [28].

Травма приводит к гибели значительного количества клеток и воспалительной реакции, что в настоящее время считают важным компонентом ЧМТ [29, 30]. Быстрое очищение от мертвых клеток имеет жизненно важное значение для уменьшения вторичного некроза и элиминации цитотоксического материала, усиливающего воспалительную реакцию. Ранее отмечалось, что астроциты могут поглощать целые мертвые клетки после травмы как in vitro, так и in vivo [14]. Обнаружены уникальные белки, связанные с захватом (фагоцитоз, макропиноцитоз и аутофагия) или разрушением клеток как в среде, так и в клеточной фракции после травмы.

Белки эзрин и моэзин (ERM-белки) обладают высокой экспрессией среди белков среды после травмы. Внутриклеточно активный эзрин стимулирует филаменты актина вокруг фагосом и имеет важное значение для правильного слияния лизосом [31]. ИГХ с применением специфических антител к ERM и рERM показывает, что в дополнение к их присутствию в ламеллоподиях астроцитов ERM-белки выраженно манифестируют вокруг мертвых клеток как in vitro, так и in vivo. Помимо этого, в среде клеточной фракции обнаружили два других белка, участвующих в фагосомальном созревании, — lamp1 и lamp2. Установили, что двойные мутации lamp1 и lamp2 ухудшают процесс разрушения клеток вследствие снижения способности слияния лизосом и фагосом [32].

Во время фагоцитоза повреждается мембрана клеток и активируются процессы ее восстановления, увеличивается количество синтазы жирных кислот [33], фермента, участвующего в синтезе мембран, который специфически найден в среде после травмы. Обнаружили также несколько других белков, связанных с процессами захвата, в том числе гелсолина, который, как известно, важен для формирования фагоцитарной чаши [34], и протонной АТФазы V-типа, принимающей участие в разрушении мертвых клеток микроглией [35]. В некоторых исследованиях высказано предположение, что астроциты могут выступать в качестве антигенпредставляющих клеток после повреждения, но их способность активировать Т-клетки остается противоречивой [36, 37]. Интересно, что один из самых высокоманифестирующих белков в среде — легумаин является белком презентации антигена [38]. Другой подобный белок — UDP-глюкоза: гликопротеин глюкозилтрансфераза 1, класс MHC I поверхностной экспозиции [39]. Пероксиредоксин-1, который специфически экспрессируется в среде после травмы, выступает в качестве сигнала опасности в силу его способности индуцировать секрецию TNF-α и IL-6, а также созревание дендритных клеток [40]. Активация и сбор воспалительных клеток в зоне травмы, как показывают исследования ЧМТ у крыс, а именно T-лимфоцитов и нейтрофилов, достигают пика через 24 ч после травмы. Макрофаги и микроглия активируются значительно позже, пик активации выявляется в течение 7 сут после травмы [41].

В среде нашли два актинассоциированных белка, специфичных для травмы: калпонин и кофилин-1. Калпонин приводит к эндотелиальному сокращению и гипоперфузии после ЧМТ [42]. Кофилин-1 участвует в реорганизации актина в дендритные шипики, его количество повышается в течение 24 ч после ЧМТ [43]. Знания, полученные в процессе изучения каскада реакций при повреждении центральной нервной системы (ЦНС), можно применять при лечении. Так, например, нейтрализация пептидил-пролил-цис-трансизомеразы (FKBP1A) в течение 1 ч после ЧМТ предотвращает активацию кофилина-1 и тем самым стабилизирует дендритные шипики и сохраняет целостность нейронных связей в травмированном мозге [43].

При диагностике и установлении давности ЧМТ, в том числе ДАП, отечественные и зарубежные ученые исследуют различные признаки, одним из которых является оценка морфологического состояния астроцитов [44—46]. Несмотря на довольно широкий спектр белков, образующихся при повреждении ткани ЦНС и последующих реакциях, в том числе астроцитарных, наибольшую популярность получила ИГХ-диагностика белков, выходящих из нейрона при его повреждении. Один из самых чувствительных, а поэтому наиболее широко применяющийся — белок β-APP. Его наличие чувствительно и специфично выявляет поврежденные нейроны. Этот белок принимает участие в формировании ткани мозга [47]. В нормально функционирующих нейронах белок транспортируется соответствующим путем и никогда не выявляется на тканевом срезе. Таким образом, нейроны с нарушенным транспортом аксоплазмы накапливают белок β-APP вплоть до места повреждения. Белок β-APP выявляется довольно рано, уже через 35 мин после повреждения [48], и остается позитивным длительное время — более 1 мес, а по данным Р. Blumbergs и соавт., — до 99 дней.

Методы ИГХ, в том числе для выявления биомаркеров ЧМТ и ДАП, прочно входят в практику, становятся рутинными; исследователи даже предлагают полуавтоматические методы диагностики. Для определения белка β-APP при диагностике ДАП парафиновые срезы толщиной 10 мкм изготавливают из кусочков мозолистого тела на уровне боковых коленчатых тел – области, наиболее часто подверженной аксональный травме. Срезы готовят по стандартному протоколу, по которому после депарафинизации обрабатывают 80% муравьиной кислотой в течение 8 мин, а затем инкубируют 10—12 ч с моноклональными антителами APP (22C11, «Boehringer»). Далее срезы обрабатывают по процедуре «авидин-биотин» («Vector Labs», Великобритания) и визуализируют с использованием диаминобензидина. Визуализация β-APP варьирует от слабого присутствия в слегка расширенных, но в остальном нормальных аксонах до накопления в варикозно-расширенных аксонах с полностью сформированными луковицами. Исследование повторяют 3 раза, а среднее пороговое значение используют для анализа всего среза. Площадь среза с экспрессией β-APP выражают в процентах от общей площади образца для выявления β-APP-нагрузки, что и служит критерием тяжести повреждения.

Исследования β-АРР проводят и при ЧМТ у детей [49]. L. Jensen и соавт. [50] изучали манифестацию β-APP в нервной ткани при внезапной и ранней смерти детей. Исследовали ткань мозга 176 умерших детей в возрасте 0—2 года. Каждый из репрезентативных случаев белка был градуирован, согласно простой шкале, основанной на количестве и типе изменений в 8 анатомических областях. Исследование секционного материала выявило различные уровни манифестации β-APP в 95% случаев: наибольший в случаях ЧМТ, наименьший при утоплении. β-APP присутствовал в минимальных количествах во всех 48 наблюдениях синдрома внезапной смерти младенцев (СВСМ). Распределение и количество β-АРР было различным при ЧМТ, инфекции и СВСМ, но приблизительно одинаковым при СВСМ и асфиксии.

Таким образом, выявление с помощью ИГХ биомаркеров нервной ткани, экспрессирующих после повреждения и в процессе воспалительно-репаративного процесса, является перспективным для судебно-гистологической диагностики ЧМТ и установления ее давности и, следовательно, требует дальнейшего изучения в целях разработки оптимальных методик. При диагностике повреждения аксонов, в том числе при ДАП, целесообразно исследовать белок β-АРР, так как этот маркер появляется в ближайшее время после травмы нейронов и сохраняется достаточно длительный период, что может позволить определять давность повреждения нервной ткани уже на раннем этапе.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.