Рак слизистой оболочки рта (СОР) и красной каймы губ по-прежнему занимает ведущее место в общей структуре заболеваемости и смертности среди других форм онкологической патологии. Поэтому актуальными остаются вопросы раннего выявления и диагностики «потенциально злокачественных заболеваний» (ППЗ) полости рта [1, 2]. Понятие «потенциально злокачественные заболевания» введено Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для патологий, представляющих риск развития эпителиальной дисплазии и плоскоклеточного рака [3].

Эпителиальная дисплазия слизистой оболочки рта (oral epithelial dysplasia) — диагностический термин, используемый для описания гистопатологических (структурных и клеточных) изменений, связанных с повышенным риском трансформации в плоскоклеточный рак и наблюдаемых при хронических заболеваниях СОР [4, 5].

Основной проблемой диагностики «эпителиальных дисплазий» является низкая воспроизводимость современных диагностических критериев, которые оценивают наличие злокачественной трансформации эпителиальных клеток СОР (цитологические методы исследования, иммунология слюны, в частности провоспалительные цитокины и иммуноглобулины, гистологические методы).

В настоящее время иммуногистохимические методы исследования являются наиболее информативными при постановке диагноза предрака и рака СОР [6—10].

Наиболее частыми ПЗЗ являются лейкоплакия, эритроплакия, актинический хейлит, преканцерозный хейлит (в российской литературе описан как абразивный преканцерозный хейлит Манганотти), подслизистый фиброз полости рта, а также эрозивная форма красного плоского лишая (КПЛ) [11—13].

Важную роль в развитии ПЗЗ полости рта играют такие факторы, как курение и жевание табака, бетеля, наса, употребление алкоголя, горячей и острой пищи, микротравмы протезами или разрушенными зубами [14, 15].

В связи с этим актуальным остается поиск новых диагностических методов, позволяющих на ранних стадиях развития заболевания оценить злокачественный потенциал.

В данном случае иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) является одним из важных диагностических методов, позволяющим с большей вероятностью, на ранних стадиях развития заболевания поставить правильный диагноз.

Существует достаточное количество маркеров, применяемых при ИГХИ для выявления начала озлокачествлений различных заболеваний СОР [16, 17].

В нашей работе мы использовали такие маркеры, как цитокератин-15 (СК15) и Ki-67.

Белок СК15 относится к первому типу кератинов, который не имеет белка-партнера 2-го типа. Недавние исследования показали, что в неизмененном эпителии синтез кератина-15 отмечается только в клетках базального слоя. Кроме того, в нашей работе для понимания течения патологического процесса мы исследовали ген-супрессор p53, мутации которого встречаются примерно в половине всех случаев рака у человека [18, 19].

Цель исследования — повышение эффективности диагностики и детализации особенностей клиники «потенциально злокачественных новообразований слизистой оболочки рта».

Материал и методы

В течение 3 лет в отделение заболеваний СОР обратились 124 пациента с такими заболеваниями, как эритроплакия (12 пациентов), веррукозная лейкоплакия (52 пациента), эрозивная форма лейкоплакии (35 пациентов), хейлит Манганотти (25 пациентов).

Из общего числа пациентов (124) было 75 женщин и 49 мужчин. Возраст пациентов колебался от 35 до 80 лет.

Всем пациентам выполняли гистологические исследования и ИГХ.

При гистологическом исследовании для изучения биопсийного материала СОР кусочки ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (pH 7,4) в течение 24 ч, после проводки на гистопроцессоре карусельного типа STP 120 Thermo scientific на станции заливки EC350 Thermo scientific погружали в парафин с температурой плавления 54 °C. Затем на аппарате Microm HMS изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм, которые впоследствии на аппарате 740 Thermo scientific окрашивали в автоматическом режиме гематоксилином и эозином и заключали в среду Bio-Mount (Bio Optica Milano S.P.A., Италия). ИГХ биопсийного материала проводили в соответствии со стандартным протоколом: из блоков, приготовленных для гистологического исследования, на микротоме нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. На каждом стекле крепили этикетку, на которой была отображена следующая информация: порядковый номер стекла, номер биопсии, название маркера, дата исследования и индивидуальный штрих-код для считывания. Депарафинизацию и высокотемпературную демаскировку антител осуществляли при помощи PT-модуля (Thermo scientific, Великобритания) в течение 20 мин при температуре 98 °C. Для выявления ядерных антигенов при депарафинизации и демаскировании применяли буфер pH 6,0, при изучении цитоплазматических белков использовали буфер pH 9,0.

Выявление тканевых антигенов осуществляли с помощью кроличьих поликлональных антител к HPV16 (ABBIOTEC) в разведении 1:400, моноклональных антител p16INK4a (Clon EPR1473, EPITOMICS) 1:200 и Ki-67 (MM1, Diagnostic Biosystems) 1:100. Кроме того, использовали моноклональные мышиные антитела к белку p53 (Clone D-07, EPITOMICS) и к цитокератину 15 (Clone EP14, EPITOMICS).

Процедуру иммуногистохимического окрашивания осуществляли в автоматическом режиме на Autostainer 360 Thermo с использованием системы визуализации QUANTO.

Результаты и обсуждение

Клинически у пациентов с эритроплакией отмечали наличие на СОР ограниченного пятна ярко-красного цвета с гладкой, иногда бархатистой поверхностью, напоминающей мелкие сосочковые разрастания. У некоторых выявлялась незначительная атрофия слизистой оболочки в области очага поражения, создающее ощущение, что он слегка западает и выглядит втянутым. Наблюдалась следующая локализация патологического элемента: на кончике языка, на слизистой оболочке щеки, на альвеолярном отростке, на небе (рис. 1).

Рис. 1. Эритроплакия слизистой оболочки щеки.

При гистологическом исследовании определялись комплексы атипичных клеток плоского эпителия с инвазивным ростом в подслизистый слой (рис. 2). Измененные клетки имели цитологические признаки злокачественности. При ИГХ наблюдалась высокая распространенность мутаций гена p53 у пациентов с эритроплакией от легких диспластических поражений до тяжелых (рис. 3). Частота выявления p53 была значительно выше в образцах, взятых со слизистой оболочки неба и слизистой оболочки нижней губы, что позволяет предположить высокий канцерогенный потенциал эритроплакии.

Рис. 2. Гистологическая картина при эритроплакии слизистой оболочки рта.

Окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

Рис. 3. Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к маркеру p53 при эритроплакии слизистой оболочки рта.

Окраска ДАБ и гематоксилином Майера, ув. 200. ДАБ — диаминобензидин.

Клиническая картина у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии характеризовалась наличием на СОР резко выступающих над уровнем окружающих тканей бляшками, либо «бородавчатыми» образованиями белого цвета, при пальпации очага поражения отмечалась его плотная консистенция. Часто очаги поражения локализовались на дорзально-боковой поверхности языка, дне полости рта с переходом на вентральную поверхность языка, слизистой оболочки щек (рис. 4).

Рис. 4. Веррукозная лейкоплакия слизистой оболочки вентрально-боковой поверхности языка.

При эрозивной форме лейкоплакии в полости рта на фоне белых гиперкератотических бляшек отмечали эрозии, располагавшиеся по периферии или ближе к центру очага поражения. При дотрагивании некоторые из них кровоточили (рис. 5).

Рис. 5. Эрозивная лейкоплакия слизистой оболочки вентральной поверхности языка.

При гистологическом исследовании лейкоплакии выявляли мощный гиперкератоз, сочетающийся с небольшими очагами паракератоза. В отдельных случаях отмечали выраженный акантоз, иногда наблюдали изменение клеток шиповатого слоя (рис. 6).

Рис. 6. Гистологическая картина лейкоплакии слизистой оболочки рта без атипии.

Окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

При ИГХ экспрессия белка Ki-67 выявлялась в ядрах клеток многослойного плоского эпителия. При лейкоплакии СОР без атипии клетки с положительной окраской ядер распределялись как в базальном, так и парабазальном клеточных слоях эпителия; кроме того, количество профилирующих клеток в шиповатом слое увеличивалось с явлениями дисплазии различной степени SIN1-3 (рис. 7). При этом выявлены особенности экспрессии белка p16INK4a, которые отмечались в ядрах многослойного плоского эпителия в 77% случаев при различной степени диспластических изменений (рис. 8).

Рис. 7. Иммуногистохимическая реакция с антителами к белку Ki-67 при лейкоплакии слизистой оболочки рта.

Окраска ДАБ и гематоксилином Майера, ув. 200. ДАБ — диаминобензидин.

Рис. 8. Иммуногистохимическая реакция с антителами к белку p16INK4a при веррукозной лейкоплакии слизистой оболочки рта.

Окраска ДАБ и гематоксилином Майера, ув. 200. ДАБ — диаминобензидин.

При лейкоплакии СОР с явлениями SIN определялась экспрессия белка HPV16 в клеточных ядрах и цитоплазме эпителиальных клетках в бахальном, парабазальном и шиповатом клеточных слоях у 40 из 52 пациентов (рис. 9).

Рис. 9. Иммуногистохимическая реакция с антителами к белку HPV16 в ядрах эпителиальных клеток при лейкоплакии слизистой оболочки ртас явлениями SIN.

Окраска ДАБ и гематоксилином Майера, ув. 400. ДАБ — диаминобензидин.

Клиническая картина абразивного преканцерозного хейлита Манганотти проявлялась поражением красной каймы преимущественно нижней губы в виде эрозии. Эрозии имели овальную или неправильную форму, гладкую полированную поверхность ярко-красного цвета. Иногда эти эрозии были покрыты прозрачным истонченным эпителием или корочкой (кровянистой или серозной), плотно спаянной с подлежащей тканью (рис. 10).

Рис. 10. Абразивный преканцерозный хейлит Манганотти красной каймы нижней губы.

Гистологическая картина характеризовалась акантозом, наличием увеличенных эпителиальных выростов, внедрявшихся иногда в подлежащую строму. В некоторых случаях наблюдались явления атипии и различной степени дискомплексации клеток: увеличение размера и количества ядрышек, цитоплазма клеток плохо окрашивалась на фоне гиперхромазии ядер. Иногда обнаруживалось отшнуровывание тяжей эпителия (состоящих из клеток шиповатого слоя) от основного эпителиального пласта, что свидетельствует о трансформации абразивного хейлита в рак (рис. 11). Синтез белка СК15 в цитоплазме клеток парабазального и вышележащих слоев может служить диагностическим критерием начала малигнизации эпителия, в частности при абразивном преканцерозном хейлите Манганотти (рис. 12). Появление СК15 в цитоплазме клеток выше базального слоя при абразивном преканцерозном хейлите (у 12 пациентов из 25), вероятнее всего, связано с тем, что пролиферирующие клетки, локализующиеся только в базальном слое, перемещаются вверх без должной дифференцировки, что является характерной особенностью для злокачественной трансформации.

Рис. 11. Гистологическая картина абразивного преканцерозного хейлита Манганотти.

Окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

Рис. 12. Иммуногистохимическая реакция с антителами к белку СК15 при абразивном преканцерозном хейлите Манганотти.

Окраска ДАБ и гематоксилином Майера, ув. 200. ДАБ — диаминобензидин.

Заключение

Таким образом, использование иммуногистохимических маркеров пролиферации Ki-67, CK15 и pi53 позволяет более точно выявлять признаки озлокачествления при таких заболеваниях, как абразивный преканцерозный хейлит Манганотти и эритроплакия слизистой оболочки рта. При веррукозной и эрозивной формах лейкоплакии уровень экспрессии Ki-67, возникающей в базальном и парабазальном клеточных слоях, служит диагностическим критерием при этой патологии без атипии. Появление Ki-67 в клетках шиповатого слоя характерно при лейкоплакии с диспластическими изменениями SIN2, SIN3.

В заключение можно констатировать, что необходимым алгоритмом для диагностики ранних проявлений неопластических процессов при «потенциально злокачественных» заболеваниях является применение как классических гистологических, так и иммуногистохимических методов с различными маркерами.

Знания особенностей клинических проявлений в сочетании с морфологическими данными позволяют врачу на начальных этапах диагностировать озлокачествление патологического процесса, правильно поставить диагноз и своевременно направить пациента к онкологу.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.