Морфология пульпарного пространства первых моляров нижней челюсти (НЧ) отличается сложной организацией и вариабельностью, поскольку часто встречаются анастомозирующие корневые каналы с многочисленными ответвлениями [1]. Такое обстоятельство создает трудности при эндодонтическом лечении для эффективной механической обработки, дезинфекции и пломбирования каналов [2]. Многие проблемы, которые возникают на этапах лечения и после их завершения, связаны с недостатком знаний о возрастных анатомо-топографических особенностях корневых каналов. С увеличением возраста человека пульповая камера и каналы зуба заметно суживаются не только в результате кариозного процесса и его лечения, но и за счет системных патофизиологических изменений. Перитубулярный дентин после третьего десятилетия жизни человека становится все более минерализованным, наблюдается уменьшение среднего числа дентинных канальцев на единицу объема, сужение канальцев, вплоть до их полной облитерации [3, 4]. С возрастом гидратация дентина снижается, а структура коллагена видоизменяется, что сопровождается потерей прочности и вязкости, эластичности ткани [5]. В результате в пожилом возрасте чаше наблюдается прогрессивное вертикальное разрушение корня и развитие апикального периодонтита [6]. При старении организма иммунные изменения в тканях обусловлены перестройкой в клетках пульпы экспрессионной активности генов, связанных с хемотаксисом в воспалительные ткани макрофагов [7]. Кроме того, наблюдается снижение экспрессии генов, регулирующих транскрипцию мРНК и активность белкового синтеза, а также усиление экспрессии генов, участвующих в регуляции апоптоза [8]. В связи с изложенным актуальным является уточнение, насколько возрастные системные изменения экспрессионной активности транскрипционных и генов апоптоза, индуцируемые воспалением, связаны с изменением морфологии пульпарной камеры и корневых каналов моляров. Понимание патогенетических основ перестройки системы строения каналов зубов поможет в разработке прогностических моделей оценки эффективности эндодонтического лечения у пациентов различного возраста и в практическом обосновании применения современных технологий лечения (конусно-лучевая конусная томография — КЛКТ, оптический бинокулярный эндоскопический микроскоп, самоадаптирующиеся эндодонтические файлы).
С внедрением в медицинскую КЛКТ появилась возможность изучать топографию корневых каналов [9, 10], а развитие лабораторно-диагностической службы в стоматологии позволяет выявить молекулярно-генетические факторы патогенеза возрастных изменений пульпарного пространства зубов.
Цель исследования — изучение сопряжения возрастных системных изменений апоптоза, опосредованного воспалением, с особенностями анатомии системы пульпы первых нижнечелюстных моляров у пациентов при хроническом пульпите и периодонтите.
Материал и методы
В исследование включены 55 пациентов (26 мужчин и 29 женщин) с диагнозом хронический пульпит (К04.0 по МКБ-10) или хронический периодонит (К04.5 по МКБ-10) в возрасте от 18 до 75 лет трех возрастных групп (согласно классификации ВОЗ): молодой (18—44 года; n=17), средний (45—59 лет; n=18), пожилой (60—74 года; n=20) с показаниями к эндодонтическому лечению.
Пациенты были разделены на две группы в зависимости от диагноза: 1-я группа — 31 пациент с хроническим пульпитом (K04.0 по МКБ-10); 2-я группа — 24 пациента с хроническим периодонтитом (К04.5 по МКБ-10).
При этом руководствовались следующими критериями включения: мужчины и женщины в возрасте от 18 до 75 лет с хроническим воспалением пульпы и периодонта (хронический пульпит — K04.0 по МКБ-10 или хронический периодонтит — К04.5 по МКБ-10); значения индексов Silness-Loe и Muhlemanna mod. Cowell не более 1,0; отсутствие тяжелых соматических и аллергических заболеваний в анамнезе.
Критерии исключения: генетические, системные, соматические заболевания в стадии обострения и декомпенсации; острые и хронические инфекционные и вирусные заболевания; онкологические заболевания; курение; беременность и лактация; отсутствие добровольного информированного согласия на участие в исследовании.
Всем участникам проводили стандартное стоматологическое обследование. Стандартные диагностические мероприятия дополняли КЛКТ New Tom 3G с использованием оптического увеличения при эндодонтическом лечении. Объектом изучения служили первые моляры НЧ. В работе использовали дентальный цифровой 3D-конусно-лучевой компьютерный томограф Vatech (Fordent, Южная Корея). Срезы формировались в трех плоскостях (аксиальной, фронтальной, сагиттальной). Полученные изображения во время сканирования передавались на персональный компьютер. С помощью программы Ez3D Plus осуществляли трехмерную визуализацию снимка, 2D-анализ (получение ортопантомограммы), трассировку каналов. При томографическом исследовании в первом моляре НЧ фиксировали количество корней, корневых каналов и тип строения корневых каналов. Для идентификации типа строения корневых каналов использовали классификацию, разработанную F. Vertucci (1979) [11], согласно которой выделяют 8 типов.
Кровь из правой срединной локтевой вены в объеме 6 см3 отбирали утром натощак. Для лабораторного исследования 1 мл цельной крови вносили в питательную среду DMEM 4 мл, добавляли гентамицин (100 мкг/мл), гепарин (2,5 ед/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Использовали наборы для культивирования клеток цельной крови Цитокин-Стимул-Бест («Вектор Бест», Россия). Образцы крови в среде инкубировали 24 ч. Затем отбирали 1 мл супернатанта и методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли концентрацию антиапоптозного протеина Bcl-xL и α-фактора некроза опухоли (α-ФНО).
Фракцию мононуклеарных клеток периферической крови получали путем наслаивания 4 мл клеточной суспензии на раствор фиколлверографина («МедБиоСпектр», Россия) с дальнейшим центрифугированием (5000 об/мин) в течение 30 мин. Выделенные мононуклеарные клетки дважды отмывали в фосфатно-солевом буфере и 1 мл клеточной суспензии, содержащей 5×106 клеток, лизировали в специальном растворе (Sigma Aldrich, США), добавляли 1% раствор ингибитора протеаз (Sigma Aldrich, США), выдерживали на льду при температуре 4—5 °C в течение 15 мин, аликвотировали и замораживали при температуре –76 °C. В полученных лизатах методом ИФА определяли содержание субъединицы p65 ядерного фактора транскрипции NF-κB.
Для определения содержания Bcl-xL применяли набор для ИФА Human B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xl) (Cusabio, Китай), p65 — набор NF-κBp65 (Total) (Invitrogen, США), α-ФНО — набор Альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ («Вектор Бест», Россия).
В качестве контроля использовали лабораторные показатели здоровых пациентов (n=31) в возрасте 40—60 лет.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica-12 (StatSoft, США).
Результаты
Из 55 обследованных первых моляров НЧ в 54 (98,2%) зубах было два корня, а в одном (1,8%) зубе — три. В мезиальном корне у всех обследуемых было два канала. В дистальном корне из 55 зубов у 26 (47%) было два канала, а в 29 (53%) зубах — один канал. Распределение формы входного отверстия каналов (всего 55 зубов, 81 канал) в дистальном корне первого моляра НЧ было следующим: овальный тип встречался в 51% случаев и чаще именно в молодой возрастной группе (94%). В среднем возрасте овальную форму наблюдали в 55% и у пожилых пациентов в 26% случаев. По результатам дисперсионного анализа возраст играл статистически значимую роль (p<0,001) в распределении овального и щелевидного типов строения канала: в молодом возрасте это соотношение составило 94 и 6% (p<0,001), среднем возрасте — 55 и 45% (p=0,11) и в пожилом возрасте — 26 и 74% (p=0,002) (табл. 1). В пожилом возрасте в результате анализа срезов выявлена значительная облитерация пульпового пространства на всем протяжении длины корня.
Таблица 1. Тип формы входного отверстия каналов дистального корня первого моляра нижней челюсти у пациентов в зависимости от возраста
| Тип строения канала дистального корня | Возраст пациентов | p* | ||
| молодой, 17 каналов (%) | средний, 29 каналов (%) | пожилой, 35 каналов (%) | ||
| Овальный | 16 (94,0) | 16 (55,0) | 9 (26,0) | <0,001 |
| Щелевидный | 1 (6,0) | 13 (45,0) | 26 (74,0) | |
| p | <0,001 | 0,11 | 0,002 | |
Примечание. p* — для различий между тремя возрастными группами, критерий Фридмана; p — для различий между частотой типов строения канала в каждой подгруппе.
Таким образом, с возрастом распространенность каналов щелевидной формы дистального корня первого моляра НЧ возрастала (p<0,001).
В дальнейшем анализировали типы каналов в дистальном корне первого моляра НЧ по классификации Vertucci. С возрастом структура типов каналов в дистальном корне первого моляра нижней челюсти изменялась (табл. 2): I тип встречался от молодого к среднему и пожилому возрасту реже (94, 17 и 25% соответственно), а более сложные по архитектуре типы с объединением и расхождением каналов наблюдались чаще.
Таблица 2. Характеристика типов каналов в дистальном корне первого моляра нижней челюсти по классификации Vertucci
| Тип каналов зуба по Vertucci | Возраст пациентов | p* | ||
| молодой, 17 зубов (%) | средний, 18 зубов (%) | пожилой, 20 зубов (%) | ||
| I (1—1) | 16 (94,0) | 3 (17,0) | 5 (25,0) | <0,01 |
| II (2—1) | — | 6 (33,0) | 7 (35,0) | |
| II (1—2—1) | 1 (6,0) | 4 (22,0) | — | |
| V (2—2) | — | 5 (28,0) | 6 (30,0) | |
| VI (2—1—2) | — | 2 (10,0) | ||
Примечание. p* — для различий между тремя возрастными группами, критерий Фридмана.
У 19 (95%) пациентов молодого возраста был выявлен I тип каналов по F. Vertucci: входное отверстие канала имело овальную форму на всем протяжении (95%) и канал заканчивался широким апикальным отверстием. У 1 обследуемого имелся III тип канала. В средней возрастной группе III тип канала встречался в 22% случаях: дистальный корневой канал начинался единым входом в устьевой части и примерно на уровне 2/3 корня раздваивался на два отдельных канала, которые затем вновь соединялись в единое апикальное отверстие (III тип каналов). Вариант строения канала, начинающийся двумя устьями, сливающимися в одно (II тип), либо наличие двух каналов на всем протяжении корня в среднем возрасте определены соответственно в 33 и 28% случаев. Только в 17% дистальный корневой канал имел овальную форму и относился к I типу. Безусловно, эндодонтическое вмешательство при выявлении III—IV типа строения корневой системы первого нижнечелюстного моляра вызывает существенные технические сложности и требует адекватной механической и медикаментозной обработки. В пожилом возрасте чаще встречались узкие щелевидные каналы с перешейками сложной конфигурации.
Средняя длина обследованных дистальных каналов по всей группе вне зависимости от возраста составляла 11,4±0,4 мм от устья до апикального отверстия.
КЛКТ — один из наиболее точных диагностических инструментов за счет нескольких факторов: возможность трехмерного анализа, отсутствие наложения зубных и костных структур, отсутствие геометрических искажений, более низкие дозы облучения по сравнению с компьютерной томографией и более высокое разрешение [10].
Имеется большое количество работ, посвященных в основном изучению строения корней и выявлению С-образных каналов в жевательной группе зубов при помощи КЛКТ в разных популяциях [9]. Однако практически отсутствуют работы, посвященные возрастным изменениям анатомии каналов. Между тем, как показали результаты исследования, проведенного нами на небольшой выборке, такой фактор, как возраст непосредственно влияет на форму корневых каналов.
Содержание антиапоптозного фактора (Bcl-xL) и провоспалительного цитокина (α-ФНО) в крови, транскрипционного фактора p65 в мононуклеарных клетках у пациентов общей клинической группы в зависимости от возраста представлено в табл. 3.
Таблица 3. Содержание иммунологических показателей регуляции апоптоза, провоспалительного и транскрипционного факторов в крови и мононуклеарных клетках у пациентов общей клинической группы в зависимости от возраста
| Показатель | Возраст пациентов | Контроль, n=31 | ||
| молодой, n=17 | средний, n=18 | пожилой, n=20 | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Bcl-xL, нг/мл | 0,713±0,028 | 0,641±0,093 | 0,437±0,079 | 0,652±0,031 |
| p | p1—2=0,47 p1—3=0,026 p1—4=0,36 | p2—3=0,031 p2—4=0,89 | p3—4=0,032 | |
| α-ФНО, пг/мл | 11,9±0,6 | 13,6±0,8 | 62,3±2,5 | 6,3±0,17 |
| p | p1—2=0,16 p1—3<0,001 p1—4=0,027 | p2—3<0,001 p2—4=0,017 | p3—4<0,001 | |
| p65, нг/мл | 0,967±0,101 | 0,645±0,074 | 0,438±0,081 | 0,729±0,058 |
| p | p1—2=0,043 p1—3=0,01 p1—4=0,042 | p2—3=0,036 p2—4=0,45 | p3—4=0,027 | |
В молодом и среднем возрасте концентрация в периферической крови антиапоптозного фактора Bcl-xL не отличалась от таковых у здоровых доноров, а в пожилом возрасте была ниже (0,437±0,079 нг/мл против 0,652±0,031 нг/мл; p=0,032). Белок Bcl-xL локализуется на мембранах внутриклеточных структур — ядра, эндоплазматической сети, митохондрий и выполняет цитопротекторную и противовоспалительную функцию [12]. Белок Bcl-xL ингибирует проапоптозные факторы, снижает экспрессионную активность генов провоспалительных цитокинов путем противодействия фактора NF-kB в ядре [13]. Снижение содержания антиапоптозного белка Bcl-xL в крови в пожилом возрасте свидетельствовало об активации программ апоптоза и аутофагии мононуклеарными клетками.
Уровень провоспалительного цитокина α-ФНО, синтезируемого в основном моноцитами и макрофагами, повышался во всех возрастных группах в крови, но преимущественный рост концентрации маркера наблюдался в пожилом возрасте (62,3±2,5 пг/мл против 6,3±0,17 пг/мл; p3—4<0,001). Продукция цитокинов контролируется факторами транскрипции, в частности, ядерным фактором NF-κB [14]. NF-kB как семейство цитоплазматических белков, представлен многими белками, включая p65. При воспалении белки перемещаются в ядро, где повышают активность до 100 генов путем связывания с промоторами. Белок p65 при воспалении повышает выброс провоспалительных цитокинов, в том числе и α-ФНО [14]. Поэтому между концентрацией p65 и α-ФНО обычно существуют содружественные однонаправленные изменения [15]. У пациентов молодого возраста имелось сопряженное повышение концентрации p65 и α-ФНО. В среднем возрасте концентрация α-ФНО в крови умеренно повышалась, а изменения в содержании p65 в лизатах мононуклеарных клеток не наблюдались. В пожилом возрасте отмечен дисбаланс между провоспалительным и транскрипционным фактором. Несмотря на рост в крови уровня α-ФНО, содержание p65 в мононуклеарной фракции клеток снижалось. Активация NF-κB обычно задерживает апоптоз, продлевая жизнь клеток-эффекторов в очаге воспаления. Снижение активности белков семейства NF-κB может привести к развитию у пациентов в пожилом возрасте реинфекции, суперинфекции, а также определить склонность к затяжному характеру заболевания активировать апоптоз клеток [16].
Концентрация Bcl-xL у больных 1-й группы по сравнению с таковой в контрольной группе не изменялась (0,671±0,048 нг/мл против 0,652±0,031 нг/мл; p=0,38), содержание α-ФНО умеренно повышалось (12,5±0,47 пг/мл против 6,3±0,17 пг/мл; p=0,017), что было сопряжено с однонаправленным сдвигом концентрации транскрипционного белка p65 (0,874±0,075 нг/мл против 0,729±0,058 нг/мл; p=0,002). У пациентов 2-й группы по сравнению с 1-й группой концентрация Bcl-xL в крови снижалась (0,504±0,064 нг/мл против 0,671±0,048 нг/мл; p=0,031), провоспалительного цитокина α-ФНО резко повышалась (49,3±2,7 пг/мл против 12,5±0,47 пг/мл; p=0,0001) при снижении уровня p65 (0,706±0,051 нг/мл против 0,874±0,075 нг/мл; p=0,003). Таким образом, при хроническом периодонтите по сравнению с хроническим пульпитом наблюдались регуляторные изменения, способствующие активации апоптоза, синтеза иммунокомпетентными клетками провоспалительных цитокинов и снижение транскрипционных механизмов, способствующих эффективному действию клеток-эффекторов в очаге воспаления.
На следующем этапе у пациентов в подгруппах с овальной и щелевидной формой входного отверстия каналов дистального корня первого моляра нижней челюсти, а также при I типе или более сложных по архитектуре II, III, IV и VI типах определяли частоту дисбаланса между провоспалительным (повышение уровня α-ФНО относительно нормального) и транскрипционным фактором (снижение содержания p65 относительно нормы), снижение антиапоптозного фактора в крови, характерного для пожилого возраста.
У пациентов с щелевидной формой входного отверстия каналов дистального корня первого моляра нижней челюсти разнонаправленное изменение концентрации в крови провоспалительного цитокина и фактора транскрипции встречалось чаще, чем при овальной форме (40% против 4,9%; p=0,0002). Снижение содержания антиапоптозного фактора в данной клинической ситуации также наблюдалось чаще (37,5% против 14,6%; p=0,02) (табл. 4).
Таблица 4. Сопряжение системных иммунологических изменений и формы входного отверстия каналов дистального корня первого моляра нижней челюсти у пациентов клинической группы
| Признак | Овальная форма, n=41 | Щелевидная форма, n=40 | χ2, p | ||
| абс. | % | абс. | % | ||
| Дисбаланс α-ФНО и p65: | χ2=14,3 p=0,0002 | ||||
| есть, n=18 | 2 | 4,9 | 16 | 40,0 | |
| нет, n=37 | 39 | 95,1 | 24 | 60,0 | |
| всего | 41 | 100,0 | 40 | 100,0 | |
| Снижение Bcl-xL: | χ2=5,4 p=0,02 | ||||
| есть, n=21 | 6 | 14,6 | 15 | 37,5 | |
| нет, n=34 | 35 | 85,4 | 25 | 62,5 | |
| всего | 41 | 100,0 | 40 | 100,0 | |
Наличие у пациентов общей клинической группы сложных по структуре II—VI типов по F. Vertucci было сопряжено со снижением концентрации антиапоптозного фактора в крови (p=0,004), но не было связано с дисбалансом в системе провоспалительные цитокины—транскрипционные механизмы (p=0,62) (табл. 5).
Таблица 5. Сопряжение системных иммунологических изменений и типов строения каналов дистального корня первого моляра нижней челюсти у пациентов клинической группы
| Признак | I тип по Vertucci, n=24 | II—VI тип по Vertucci, n=31 | χ2, p | ||
| абс. | % | абс. | % | ||
| Дисбаланс α-ФНО и p65: | χ2=0,24 p=0,62 | ||||
| есть, n=18 | 7 | 29,2 | 11 | 35,5 | |
| нет, n=37 | 7 | 70,8 | 20 | 64,5 | |
| Всего | 24 | 100,0 | 31 | 100,0 | |
| Снижение Bcl-xL: | χ2=8,2 p=0,004 | ||||
| есть, n=21 | 4 | 16,7 | 17 | 54,8 | |
| нет, n=34 | 20 | 83,3 | 14 | 45,2 | |
| Всего | 24 | 100,0 | 31 | 100,0 | |
Заключение
В качестве патогенетических факторов, способствующих изменению морфологии пульпарной камеры и корневых каналов первых моляров нижней челюсти, требующих особого диагностического и лечебного подхода при эндодонтическом лечении пульпита и периодонтита, можно назвать пожилой возраст, а также многократное повышение в крови концентрации провоспалительных цитокинов, не сопровождающееся однонаправленным сдвигом p65 в мононуклеарных клетках, снижение содержания антиапоптозного фактора Bcl-xL. Все это в совокупности свидетельствует об усилении апоптоза клеток-эффекторов с противовоспалительной направленностью и затяжному характеру изменений в очаге воспаления.
В пожилом возрасте повышается распространенность узких щелевидных дистальных каналов первых моляров нижней челюсти с перешейками сложной конфигурации. Изменение морфологии дистальных каналов первых моляров нижней челюсти при хронических инфекционных процессах в пульпе сопряжено с системным снижением концентрации антиапоптозного фактора Bcl-xL, повышением синтеза провоспалительного цитокина и угнетением транскрипционных механизмов.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Н.Б. Петрухина, О.А. Зорина
Сбор и обработка материала — Н.Б. Петрухина, В.А. Венедиктова
Написание текста — В.А. Венедиктова
Редактирование — Н.Б. Петрухина, О.А. Зорина
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — N.B. Petrukhina, O.A. Zorina
Data collection and processing — N.B. Petrukhina, V.A. Venediktova
Text writing — V.A. Venediktova
Editing — N.B. Petrukhina, O.A. Zorina