Введение

Несмотря на несомненные успехи современной фармакологии в области разработки новых местноанестезирующих лекарственных средств (МАС), оптимизации способов направленного транспорта анестезирующих агентов к месту приложения эффекта, клиническая практика продолжает испытывать очевидные трудности с достижением удовлетворительной по продолжительности и глубине местной анестезии [1, 2]. При этом одной из наиболее распространенных причин потери местного обезболивающего эффекта большинства МАС в стоматологической практике является наличие острого или хронического воспалительного процесса в области пульпы зуба, периапикальной зоны, пародонта или альвеолярной области [1—3].

Практикующие специалисты часто испытывают большие трудности с индукцией глубокой и продолжительной местной анестезии зубов инфильтрационным методом или блокадой дентальных нервов у пациентов с признаками пульпита или апикального периодонтита [4]. Клинические исследования показали, что у 30—45% пациентов с воспалительным поражением нижних коренных зубов блокада нижнего альвеолярного нерва даже опытным стоматологом оказывается полностью неэффективной, тогда как в 19—56% случаев наблюдается неудовлетворительная анестезия [5]. Примечательно, что ни комбинированное инфильтрационное введение МАС с язычной и щечной стороны, ни сочетание инфильтрационного и проводникового методов часто не приводит к клиническому успеху, и это придает проблеме адекватной местной анестезии в стоматологии особое значение с позиции как практической медицины, так и фундаментальной фармакологии [1, 5].

Диметилфенилацетамид (лидокаин) давно и с успехом используется в клинической практике в качестве МАС [5] и является «золотым стандартом» среди анестетиков. В последние годы были созданы третичные производные диметилфенилацетамида, превосходящие лидокаин по силе и длительности местнообезболивающего эффекта на экспериментальных моделях терминальной и проводниковой анестезии [6—9].

Цель исследования — изучение токсичности и местноанестезирующего действия новых отечественных фармацевтических композиций, содержащих третичное производное диметилфенилацетамида, антиоксидант и вазоконстриктор, у животных с хроническим периодонтитом.

Материал и методы

Исследование выполнено в полном соответствии с требованиями приказа Минздрава России № 199н от 01.04.16 «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», прошло этическую экспертизу на заседании локального этического комитета ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (протокол № 7 от 06.07.17). Фармацевтическая композиция (лабораторный шифр ЛХТ-15-32) была разработана в отделе химии, технологии синтетических лекарственных средств и аналитического контроля АО «ВНЦ БАВ» (Россия) в виде 2% раствора N-ацетил-L-глутамината 2-диэтиламино-2’,6’-диметилфенилацетамида (ЛХТ-4-00 в виде фармацевтической субстанции, АО «ВНЦ БАВ», чистота субстанции 99,75%).

В 1 мл раствора композиции содержатся 2 мг этилметилгидроксипиридина малата и 1:200 тыс. эпинефрина. Фармакологические свойства ЛХТ-15-32 сравнивали с активностью действующего вещества ЛХТ-4-00 в виде 2% водного раствора, приготовленного ex tempore, и лидокаина (Lidocaine HCI, 20 мг/мл во флаконах по 20 мл, «Hospira Inc.», США). Непосредственно перед введением рН рабочих растворов композиции и препаратов сравнения доводили до 7,35 с помощью 8,4% раствора бикарбоната натрия.

Исследование выполнено на 66 белых беспородных мышах (самцах и самках) весом 18—20 г, приобретенных в филиале «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, 15 лягушках Rana radibunda, полученных на биостанции ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева», и 50 крысах-самцах Sprague Dawley весом 250—300 г, полученных из вивария ФГБНУ «ФИЦ Пущинский центр биологических исследований РАН».

Животные содержались в стандартных условиях вивария при неограниченном доступе к корму и воде при температуре окружающей среды 25±2 °C и влажности воздуха 60%. Для токсикологического эксперимента мыши были случайным образом разделены на одиннадцать групп по 10 животных в каждой (по 5 самок и самцов). Крысы были разделены на пять групп по 10 животных в каждой: интактные животные, контроль, лидокаин, ЛХТ-4-00 и животные основной группы. Седалищные нервы лягушек выделяли, готовили препараты длиной 3,5 см, которые помещали на 30—40 мин в охлажденный до температуры 22 °C раствор Рингера перед стимуляцией. Недифференцированные нейроны выделяли из окологлоточных ганглиев моллюсков Limnea stagnalis [10].

Определяли летальную дозу, вызывающую гибель 100% животных (ЛД₁₀₀), ЛХТ-15-32 при внутривенном введении композиции мышам. Летальную дозу, вызывающую гибель 50% животных (ЛД₅₀), рассчитывали через 14 сут после подкожного введения композиции мышам методом пробит-анализа [8].

Экспериментальный периодонтит воспроизводили у наркотизированных (тиопентал-натрий, «Sandoz, GmbX», Австрия, 40 мг/кг внутрибрюшинно) крыс путем перевязки второго верхнего моляра шелковой лигатурой (5-0, «Ethicon Inc.», США) по [9].

На 15-й день у наркотизированных животных, помещенных на подогреваемую платформу стереотаксической установки SR-5R («Narishige Co, Ltd», Япония), в пораженном воспалительным процессом зубе высверливали два отверстия диаметром 0,3 мм и глубиной 3—4 мм, куда с помощью стоматологического клея фиксировали концы платиновых стимулирующих электродов («ADInstruments», США). Свободные концы выводили на холку животных и фиксировали кисетными кожными швами. Стимуляцию проводили на 4-й день после операции нарастающими по силе (0,1—10,0 мА) прямоугольными импульсами с частотой 20 имп/с (BIOPAC MP-160, «BIOPAC Systems Inc.», США) для определения порога болевой чувствительности (ПБЧ), который фиксировали по двигательной реакции и вокализации животных. Исследуемый раствор в объеме 0,2 мл вводили животным инфраорбитально через 10 мин после регистрации исходных значений ПБЧ. За полное подавление чувствительности принимали отсутствие реакции крыс на 5-секундную стимуляцию импульсами силой тока 10,0 мА.

Антирадикальную активность и интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали хемолюминесцентным методом в ткани слизистой оболочки десны крыс, выведенных из эксперимента через сутки после введения раствора анестетика [9].

Концентрацию интерлейкинов (ИЛ) 1β, ИЛ-10 и фактора некроза опухоли (ФНО) альфа определяли в ткани десны с помощью количественного иммуноферментного анализа, наборов тест-систем Rat Interleukin 1β (CSB-E08055r), Rat Interleukin 10 (CSB-04595r) и Rat TNF-a (CSB-11987r) ELISA Kits («Cusabio Technology, LLC», Китай) на автоматическом ридере StatFax 4200 (США).

Амплитуду потенциала действия (АПД) седалищного нерва лягушки озерной измеряли на изолированном препарате, который перфузировали насыщенным кислородом раствором Тироде (мM: NaCl 145,0; KCl 4,0; MgCl₂ 1,0; CaCl₂ 1,80; Tris 5,0; глюкоза 10,0; pH 7,3—7,5), содержащим 10^–3, 10^–4, 10^–5 или 10^–6 M ЛХТ-15-32, при температуре 22—24 °C. Стимуляцию проводили линейными импульсами при помощи позолоченных медных электродов («ADInstruments», США) и стимулирующего блока системы BIOPAC MP-160 («BIOPAC Systems Inc.», США). Для создания умеренного ацидоза рН перфузионного раствора доводили соляной кислотой до 6,3—6,5. Проводимость натриевых каналов недифференцированных нейронов брюхоногого моллюска оценивали в конфигурации «whole-cell» методом «patch-clump». Диализ нейронов осуществляли оксигенированным раствором следующего состава (мM): CsCl 120; Tris-OH 2, pH 7,3—7,4. Наружную мембрану перфузировали ЛХТ-15-32-содержащим раствором (мM: NaCl 110; MgCl₂, Tris-OH 2, pH 7,5) [7, 10, 11].

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS (версия 16,0). После проверки нормальности распределения с помощью одномерного дисперсионного анализа (ANOVA) использовали параметрический критерий Ньюмена-Кейлса [12].

Результаты

Показатель ЛД₁₀₀ при внутривенном введении фармацевтической композиции ЛХТ-15-32 мышам составил 205±7 мг/кг, тогда как для действующего вещества ЛХТ-4-00 он был равен 108±12 мг/кг (рис. 1). При подкожном введении токсичность композиции и ее действующего компонента снижалась — показатель ЛД₅₀ составил 657±21 и 297±20 мг/кг соответственно.

Инфраорбитальное введение лидокаина приводило к умеренной анестезии зуба у крыс с периодонтитом продолжительностью не более 17,3±2,3 мин (рис. 2). Действующее вещество композиции ЛХТ-4-00 вызывало более глубокую анестезию длительностью 32,4±3,4 мин при снижении скорости ее наступления (р=0,001 при сравнении с лидокаином). Композиция ЛХТ-15-32 вызывала полную анестезию через 32,1±1,7 мин после инфраорбитального введения. Животные основной группы не реагировали на болевую стимуляцию в течение 72,1±2,6 мин (р=0,001 при сравнении с ЛХТ-4-00 и лидокаином).

На фоне формирования периодонтита активность гидроперекисных процессов в ткани десны увеличивалась более чем в 3 раза по сравнению с таковой у интактных животных на фоне пропорционального снижения антирадикального потенциала (см. таблицу).

Примечание. Различия достоверны (р<0,05) при сравнении * — с интактными животными; ** — с контролем; *** — с лидокаином (ANOVA; критерий Ньюмена—Кейлса).

ИЛ — интерлейкин; ФНО — фактор некроза опухоли; МАС — местноанестезирующие лекарственные средства; ПОЛ — перекисное окисление липидов; АОА— антиоксидантная активность.

Во всех исследуемых группах регистрировали изменения локальных процессов ПОЛ. Наблюдали снижение активности ПОЛ в группе крыс, получавших лидокаин, до 6,4±0,7 имп/с, в группе животных, получавших ЛХТ-4-00, — до 5,3±0,4 имп/с и у животных на фоне введения ЛХТ-15-32 — до 3,2±0,3 имп/с (р=0,03 при сравнении с лидокаином).

Общая антиоксидантная активность ткани десны в группе лидокаина была 1,7±0,4·10³ имп/с, в группе ЛХТ-4-00 — 3,9±0,3·10³ имп/с, в группе ЛХТ-15-32 — 4,7±0,5·10³ имп/с (р=0,005 при сравнении с лидокаином). У крыс с периодонтитом выявили увеличение уровня ИЛ-1β и ФНО альфа на фоне снижения концентрации ИЛ-10 в ткани десны. На фоне фармакологического воздействия ЛХТ-15-32 в отличие от лидокаина происходило снижение тканевого содержания ИЛ-1β и ФНО альфа при неизменной концентрации ИЛ-10 (см. таблицу).

Перфузия препарата седалищного нерва Rana radibunda ЛХТ-15-32 в диапазоне концентраций от 10^–6 до 10^–3 М сопровождалась нарастающим подавлением АПД в физио-логических условиях и в меньшей степени на фоне умеренного ацидоза (рис. 3), что было обусловлено зависимой от концентрации блокадой натриевых каналов с эффективной концентрацией (ЕС₅₀), равной 7,78·10^–5 M (рис. 4).

Обсуждение

Снижение эффективности МАС при воспалении связывают с рядом обстоятельств:

1) реакции периферической сосудистой системы [13, 14];

2) повреждения ноцицепторов вследствие активации свободнорадикальных процессов;

3) снижения чувствительности биологических мишеней для МАС [1].

Фармацевтическая композиция ЛХТ-15-32 была разработана с учетом указанных факторов. Так, в качестве действующего вещества композиция содержит N-ацетил-L-глутаминовую соль лидокаина с оптимальным фармакологическим профилем (острая токсичность, характеристики анестезирующего действия) [8]. Однако композиция ЛХТ-15-32 по силе, длительности местнообезболивающего эффекта на фоне хронического периодонтита превосходит как лидокаин, так и действующее вещество ЛХТ-4-00 в виде монотерапии, что не может объясняться лишь блокадой ионных каналов и подавлением АПД чувствительного нерва.

Возможные объяснения могут быть связаны с антиоксидантным и сосудосуживающим компонентами композиции.

Н. Tsuchiya и соавт. [1] показана прямая связь между местноанестезирующим действием и активностью ПОЛ клеточной мембраны. Введение ЛХТ-15-32 приводит к большему балансу местных свободнорадикальных реакций, чем лидокаин и ЛХТ-4-00. Цитокины болевого каскада играют критическое значение в реализации эффекта МАС [13]. Снижение тканевой концентрации ИЛ-1β и ФНО альфа свидетельствует о вовлеченности ЛХТ-15-32 в цитокиновую регуляцию местной болевой реакции при воспалении.

Вывод

Отечественная композиция ЛХТ-15-32 менее токсична, чем действующее вещество и лидокаин, вызывает более глубокую и длительную анестезию верхнего моляра у крыс с хроническим периодонтитом, снижает тканевую концентрацию цитокинов болевого каскада и активность перекисного окисления липидов, подавляет амплитуду потенциала действия чувствительного нерва вследствие блокады натриевых каналов и может рассматриваться как перспективный подход к повышению эффективности местной анестезии в стоматологической практике.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.