Сохранение жизнеспособной пульпы или только корневой ее части при оперативных вмешательствах обеспечивает нормальную трофику тканей зуба и предупреждает развитие периапикальных осложнений [1, 7]. В нашей стране и за рубежом постоянно ведутся поиски наиболее эффективных средств, сохраняющих корневую пульпу и стимулирующих репаративный дентиногенез [2, 3].

Для покрытия корневой пульпы некоторые авторы предлагают препараты, содержащие коллаген, мукополисахариды, антибиотики, антисептики, анестетики, гормоны [4, 8]. Перспективно также использование коллагеновой губки в качестве матрицы-носителя для различных тканеинженерных конструкций [5, 9]. Особое значение приобретают эктомезенхимальные стволовые клетки, дающие начало одонтобластам пульпы зуба [6, 10]. В настоящее время в основе идентификации этих клеток лежит оценка их морфологии и поверхностных маркеров. Один из наиболее перспективных маркеров стволовых клеток — C-kit (CD117), который является рецептором к фактору стволовых прогенеторных клеток StemCellsFactor — SCF, что характеризует его как рецептор, маркирующий «взрослые» или «способные к дифференцировке» стволовые клетки. Встречаются данные об обнаружении С-kit-позитивных клеток у человека в сердце, желудке и кишечнике, мочеточниках, а также единичные сведения об их идентификации в почках, поджелудочной железе и пульпе зуба [11, 12]. Экспериментальная модель остеопороза (ОП) позволяет прогнозировать регенеративные возможности пульпы зуба у пожилых, что дает возможность решить вопрос о целесообразности ее сохранения при лечении осложнений кариеса зубов. В современной стоматологии представляется важным изучение аспектов сохранения и стимуляции саногенетических свойств пульпы зубов в условиях экспериментального ОП, что и стало целью настоящего исследования.

Цель исследования — иммуногистохимическое из-учение С-kit-позитивных клеток пульпы зуба в оптимизации репаративного дентиногенеза при биологических методах лечения пульпита в условиях экспериментального ОП.

Для покрытия корневой пульпы при биологическом методе лечения пульпита использовали тканеинженерную конструкцию, в состав которой входили гидрогель PuraMatrix/3DM с эктомезенхимальными клетками, иммобилизованными на коллагеновую губку. Данная тканеинженерная конструкция представляет собой синтетический биодеградируемый матрикс-гель на основе олигопептидных фрагментов, формирующий нанонити, и предварительно культивированные эктомезенхимальные клетки барана, обработанные 5-азацитидином. Выбор губки в качестве матрицы-носителя тканеинженерной конструкции обусловлен тем, что, меняя параметры исходного раствора и режима лиофилизации, можно варьировать структуру губки, изменяя тем самым ее механическую прочность, эластичность, адсорбционную емкость, скорость ангио- и неогенеза в зависимости от цели применения.

Экспериментальное исследование проведено на 20 двухлетних овцах северо-кавказской породы. Животные были разделены на две группы: основную (15 животных/120 зубов) и контрольную (5 животных/40 зубов). В основной группе формировали экспериментальную модель ОП: под наркозом (Zoletil 100) выполняли овариэктомию, затем в течение 3 мес проводили внутримышечные инъекции дексаметазона (10 мг/кг по 4 инъекции в 1 нед). Для лабораторной оценки состояния костной ткани животных использовали: характеристики кальций-фосфорного отдела и кальций-регулирующих гормонов; определение биохимических маркеров костного метаболизма, морфологических показателей состояния метаболизма в костной ткани, включая исследование пиридинолина, деоксипиридинолина и определение тартратрезистентной кислой фосфатазы.

Забор материала производили в области нижних резцов (зацепов) путем выделения зубоальвеолярных сегментов под наркозом через 1, 7, 14, 30 и 60 сут после начала опыта. В контрольной группе исследовали соответствующие зубоальвеолярные сегменты у интактных животных.

Для получения экспериментальной модели острого пульпита с язычной поверхности бором формировали полости и инфицировали различными штаммами микроорганизмов, выделенных из кариозных зубов человека, после чего зубы пломбировались. Как показали гистологические исследования, такая методика вызывала серозно-гнойное воспаление коронковой пульпы. Через 1 сут под общим обезболиванием в асептических условиях производили витальную ампутацию пульпы. Гемостаз пульпы осуществляли стерильными ватными шариками. В основной группе животных на дно полости зуба в области устья корневого канала накладывали тканеинженерную конструкцию, состоящую из коллагеновой губки, гидрогеля PuraMatrix/3DM и прекультивированных аутогенных эктомезенхимальных клеток (выделенных из тканей, полученных из области неба этих же животных) с последующим пломбированием зуба. В контрольной группе в состав коллагеновых губок вводили гидрокортизон, фурацилин, хондроитинсульфат, анестезин (всего 8 различных прописей). Зубы удаляли в сроки от 1 сут до 6 мес. Материал, взятый для гистологических исследований (n=96), фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты возрастающей плотности и ксилол, а затем заливали в гистологическую среду «Гистомикс» с использованием гистологического процессора замкнутого типа Tissue-Tek VIP 5 Jr. производства «Sakura» (Япония).

Для обзорных целей гистосрезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и Массону согласно рекомендациям В.В. Семченко (2006). Для идентификации введенных в состав тканеинженерной конструкции прекультивированных клеток и собственных клеток пульпы использовали иммуногистохимический метод экспрессии C-kit — трансмембранного рецептора белка тирозина, который кодируется доминантной аллелью (насыщенным окрасом, white-spotting или ген W).

Для выявления рецептора стволовых клеток применяли моноклональные мышиные антитела к SCF-R (C-kit), клон Т595 (DiagnosticBioSystems, Нидерланды, 1:20 — 1:40) и моноклональные кроличьи антитела к CD117/C-kit, клон SP26 («SpringBioScience», США).

Микроскопию гистологических препаратов проводили на прямом микроскопе Olympus BX45 со встроенным фотоаппаратом C 300 (Япония).

Эксперимент на животных проводили в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт «Принципы надлежащей лабораторной практики» ГОСТ Р 53434−2009) и положительным заключением этического комитета ГБОУ ВПО СтГМУ Минздрава России № 32 от 12.02.15.

Используя коллаген в комбинации с другими препаратами при витальной ампутации пульпы зуба в эксперименте, мы исходили из принципов патогенетической терапии ран: закрытие раневой поверхности от вторичной инфекции; ускорение дентиногенеза за счет стимуляции его образования на поверхности тканеинженерной конструкции из коллагена с прекультивированными эктомезенхимальными клетками и гидрогелем PuraMatrix/3DM; стимуляция заживления раны и отложения солей кальция путем комплексообразования с хондроитинсульфатом, являющимся естественным активатором фибриллогенеза и связывающим ионы кальция; ускорение регенерации действием продуктов лизиса. Предполагалось, что коллаген в составе тканеинженерной конструкции может стать основой для образования новой ткани и, рассасываясь, постепенно будет замещаться дентином, образуя, таким образом, дентинный мостик, прикрывающий вход в корневые каналы.

Установлено, что в сроки 7—14 сут при гистологическом изучении пульпы зубов в контрольной группе обнаружились явления вакуолизации одонтобластов, гиперемия сосудов пульпы, внутрипульпарные кисты, кровоизлияния в ткани пульпы и слое одонтобластов, серозный отек плащевого дентина и частичное его отторжение (рис. 1, а).

В основной группе процессы регенерации пульпы протекали значительно быстрее, и к 1 мес развитие соединительной ткани на месте лизированной коллагеновой губки происходило не только с периферии, но и из центра корневой пульпы. Гистохимическими методами установлено, что в резорбции тканеинженерной конструкции активно участвуют гигантские многоядерные клетки, расположенные вокруг нерезорбированных фрагментов коллагеновой матрицы (см. рис. 1, в).

На 60-е сутки опыта в контрольной группе наблюдались фрагменты новообразованного дентина, расположенные на периферии корневого канала, но не смыкающиеся в центре; описанная картина на некоторых препаратах имела вид «прерванного моста». К данному сроку в основной группе во всех исследуемых препаратах отмечался четко сформированный дентинный мостик, по структуре схожий с дентином, отделяющим корневую пульпу от пульповой камеры (см. рис. 1, г). Новообразованный дентин с хорошо выраженными, параллельно расположенными дентинными канальцами образуется от стенок корневого канала и, смыкаясь, формирует четкий барьер. Корневая пульпа полностью сохранена, отмечается полнокровие сосудов. Слой одонтобластов хорошо выражен, на препаратах при четко сформированном дентинном мостике в корневой пульпе отмечаются склеротические изменения и очаги лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации.

Иммуногистохимические методы исследования показали, что оптимизация воспалительного процесса с активизацией пролиферации в основной группе была обеспечена клеточным составом тканеинженерной конструкции. В основной группе произошла активизация клеток как эктомезенхимального, так и мезенхимального стволовых компартментов пульпы зуба: прекультивированные эктомезенхимальные клетки из тканеинженерной конструкции реализовали свое участие в процессе регенерации пульпы на каждом этапе межклеточного взаимодействия по регуляции большинства биологических процессов в клетке, таких как пролиферация, дифференцировка, адгезия клеток и миграция (рис. 2, а,

Таким образом, в контрольной группе при использовании коллагеновой губки в комбинации с различными препаратами, призванными стимулировать регенерацию корневой пульпы после витальной ампутации, образование дентинного мостика протекало значительно медленнее, чем в основной группе. Намечающийся дентинный мостик в контрольной группе мы наблюдали только к 2 мес; напротив, в основной группе репаративный дентиногенез завершался построением дентинного моста к 30-м суткам. В ряде случаев корневая пульпа под дентинным мостиком в контрольной группе вообще не регенерировала, и на большинстве препаратов наблюдались явления ее фиброзного превращения.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что в ранние сроки наблюдения — от 1 до 7 сут — в корневой пульпе после витальной ампутации коронковой пульпы у экспериментальных животных основной и контрольной групп развивается асептическое воспаление. В последующие сроки наблюдения в основной группе разработанная тканеинженерная конструкция оказывает наиболее выраженное влияние на каждом этапе процесса заживления и регенерации: защищает пульпу от инфицирования, уменьшает экссудацию, дает гемостатический эффект, а в отдаленные сроки способствует значительному ускорению образования дентинного мостика.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.