Для миллионов людей во всем мире было и остается самой сокровенной мечтой желание восстановить утраченные органы или части тела. Сегодня для достижения этой цели медицина использует 3 подхода: биологический, классический инжиниринг и тканевую инженерию. Биологический подход основан на трансплантации живых тканей и органов. Первые попытки биотрансплантации были предприняты в XVI веке в Италии. Врач Tagliacozzi в труде «Decusorum Chirurgia per Insitionem» описал процедуру пересадки носа, сделанного им из лоскута кожи предплечья. Однако биотрансплантация может иметь негативные последствия, такие как отторжение трансплантата, инфицирование и появление опухоли. Классический инжиниринг основан на имплантации в организм искусственных материалов для замены поврежденной ткани или органа. Однако искусственные материалы могут вызывать реакцию тканей больного, быть недостаточно функциональными и недолговечными. Недостатки этих методов породили идею о комбинированном подходе — тканевой инженерии.

Появление тканевой инженерии связывают с работами W. Green. В 70-х годах прошлого столетия он культивировал хондроциты для выращивания хряща. В 1987 г. на семинаре Национального научного фонда в Нью-Йорке тканевая инженерия получила определение как «использование инженерных и биологических наук в производстве биологических эквивалентов для замены тканей или органов по медицинским показаниям» [10]. Потенциально высокая эффективность тканевой инженерии сделала ее чрезвычайно востребованной в разных областях медицины. Попытки удовлетворить эту потребность были предприняты очень давно. При раскопках в Египте археологи обнаружили искусственный зуб в челюсти человека, который жил 5 с половиной тысяч лет назад [13]. Этот зуб имел все признаки сращивания с живой тканью. Так что можно утверждать, что у истоков тканевой инженерии в медицине, задолго до работ Грина, стояла стоматология.

С чем связана востребованность тканевой инженерии в стоматологии? Потеря зубов приводит к нарушению речи и первичной обработки пищи, ухудшает эстетический вид, здоровье и качество жизни индивида. Для компенсации функций утраченного зуба используют искусственные коронки или имплантаты. Однако они не имеют иммунных клеток, нервных окончаний и кровеносных сосудов, цемента и периодонтальных связок, поэтому не реагируют на инфекцию, не имеют чувствительности, не регенерируют дентин и не имеют амортизирующей подложки как натуральные зубы. Тканевая инженерия могла бы обеспечить практически полное восстановление функций утраченных зубов. В обзоре будут рассмотрены основные направления развития, достижения и проблемы биоинженерии зуба.

Тканевая инженерия зуба использует: 1) живые клетки; 2) материалы, имитирующие экстраклеточный матрикс (ЭКМ) и 3) молекулы, индуцирующие регенерацию ткани (рис. 1) [24, 26, 32].

Манипулирование живыми клетками составляет первый компонент тканевой инженерии. В тканевой инженерии зуба используют естественные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Эти клетки в результате определенных манипуляций могут приобрести нужный для тканевого роста фенотип.

Стволовые клетки классифицируют по диапазону дифференцировки, происхождению и стадиям онтогенеза. По диапазону дифференцировки стволовые клетки делят на: тотипотентные, которые дифференцируются в любой тип клеток; плюрипотентные, которые продуцируют клетки эктодермы, эндодермы и мезодермы; мультипотентные, которые продуцируют ограниченный набор типов клеток, например клетки крови; олигопотентные, которые дифференцируются в еще меньшее количество типов клеток, и унипотентные, которые дифференцируются только в один тип клеток. По происхождению стволовые клетки делят на: аутологичные — собственные клетки индивида; аллогенные — клетки донора того же вида; ксеногенные — клетки донора другого вида; сингенные — клетки близнецов или линейных животных, а также на клетки эндо-, мезо- или экдодермального происхождения. В соответствии со стадией онтогенеза стволовые клетки делят на эмбриональные и фетальные, клетки новорожденного и взрослого организма.

Для тканевой инженерии зуба лучшим источником стволовых клеток является сам зуб (рис. 2), потому что стволовые клетки зуба, в отличие от других стволовых клеток могут обладать способностью индуцировать рост зуба [34]. Стволовые клетки выделяют из пульпы зуба (DPSC), периодонтальной связки (PDLSC), зубного фолликула (DFPC), сосочка (SCAP) и из молочных зубов (SHED) [1, 35, 36].

В 2006 г. Takahashi и Yamanaka показали, что соматические клетки могут быть репрограммированы в iPSC с помощью факторов транскрипции Oct¾, Sox2, C-Myc и Klf4 [39]. Применение iPSC ограничивается риском роста опухоли и их чрезвычайной гетерогенностью [47]. Интересно, что iPSC из клеток зуба еще не использовались, а «незубные» iPSC уже используются для регенерации тканей парадонта [6], пульпы, дентина и эмали [5].

Во многих случаях для регенерации поврежденной ткани или органа, помимо клеток, нужен второй компонент тканевой инженерии зуба — материал, имитирующий ЭКМ, или другими словами скэффолд. ЭКМ обеспечивает прочность ткани, высвобождение факторов роста, опору для сосудов и нервов, адгезию, миграцию, деление и дифференцировку клеток. Чтобы скэффолд способствовал регенерации ткани, важно правильно выбрать материал скэффолда, а для этого необходимо ответить «да» на несколько вопросов: имитирует ли структура материала архитектуру ЭКМ для обеспечения миграции и адгезии клеток, васкуляризации и иннервации; биосовместим и биодеградируем ли этот материал; обеспечивает ли материал депонирование и выделение факторов роста.

Для производства скэффолдов используют синтетические материалы, такие как поликапролактон, биоактивное стекло и разные композиты, а также биоматериалы, такие как коллаген, хитозан и гиалуроновая кислота. Синтетические материалы позволяют готовить скэффолды нужной формы, однако плохая биосовместимость и токсичность ограничивают их использование. Биоматериалы состоят из макромолекул, которые входят в состав ЭКМ, или молекул, близких по своим свойствам. Поэтому биоматериалы, как правило, хорошо биосовместимы и биодеградируемы и способствуют росту ткани. Однако они часто имеют сниженную прочность и могут вызывать реакции отторжения.

Взаимодействие скэффолда с клетками и факторами роста определяет успех тканевого роста. Поэтому скэффолд, полученный из ЭКМ (ЭКМ-скэффолд), является наилучшим [33]. Так, DPSC и PDSC на ЭКМ-скэффол-дах дифференцировались в одонтогенном направлении [34] и формировали пульпу с одонтобластами. В обзоре N. Monteiro, P. Yelick [24] представлено много примеров использования разных скэффолдов для регенерации тканей зубов.

Для биоинженерии ткани необходим также третий компонент тканевой инженерии зуба — регуляторы тканевого роста. В качестве таких регуляторов используют факторы роста, гены и интерферирующие РНК.

Факторы роста обеспечивают взаимодействие между клетками с целью регуляции роста ткани, синтезируются клетками в неактивной форме и сразу связываются с мембраной клетки или ЭКМ. При повреждении клетки или ЭКМ факторы роста высвобождаются и запускают механизмы регенерации ткани и ангиогенез [37]. Известно, например, что дентин регенерирует благодаря тому, что факторы роста пульпы зуба стимулируют дифференцировку мезенхимальных клеток в одонтобласты — клетки, которые откладывают дентин. Поэтому когда ткань пульпы утрачивается из-за кариеса или удаляется при стоматологических вмешательствах, регенерация дентина прекращается.

Для доставки факторов роста в зону роста ткани используют растворы с факторами роста, клетки — продуценты факторов роста, наночастички и скэффолды с фиксированными факторами роста. Хороший носитель должен связывать много факторов роста, не нарушать их биоактивность, быть биосовместимым и нетоксичным.

Во время развития зуба повышается продукция костного морфогенетического белка (BMP), трансформирующего фактора роста (TGF-β₁), сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), факторов роста фибробластов (FGF) и нервов (NGF) [19]. Это обосновывает их использование в биоинженерии зуба (см. таблицу). Основная проблема использования факторов роста в биоинженерии зуба состоит в сложности создания нужных концентраций ключевых факторов роста в зоне роста ткани [33].

Чтобы хотя бы частично преодолеть сложности использования факторов роста, были разработаны технологии доставки генов в геном клетки для усиления продукции нужных факторов роста [42]. В качестве переносчиков генов используют разные вирусы [15]. Для увеличения синтеза фактора роста применяют или ген этого фактора роста (рис. 3, а), или ген фактора транскрипции этого фактора роста (см. рис. 3, б) [23]. Технология доставки генов была успешно использована на зубных мезенхимальных клетках [38] для регенерации периодонтальной связки [49].

Для управления дифференцировкой клеток используют также интерферирующие РНК (РНКи) [46]. РНКи — это двухцепочечная РНК, связывание которой с мРНК приводит к прекращению синтеза полипептида [46]. Для доставки РНКи в клетки используют гидрогели или нановолокно с плазмидной ДНК, которая кодирует РНКи [46]. В работе Z. Ma и соавт. [21] с помощью РНКи-зависимого подавления RANK-пути удалось увеличить эффективность регенерации периодонтальной связки.

По мнению многих исследователей, успех в выращивании зуба может быть достигнут с помощью технологий, воспроизводящих естественный путь развития этого органа. Одонтогенез представляет собой сложный процесс, в котором взаимодействие эпителиальных и мезенхимальных клеток регулирует развитие зуба. Для воспроизведения этого процесса тканевая инженерия использует технологии клеточно-тканевой рекомбинации, клеточных пластов, клеточной компартментализации и зубных комплексов.

Технология клеточно-тканевой рекомбинации состоит из 5 этапов (рис. 4): 1) выделение зачатка зуба; 2) выделение эпителиальных и мезенхимальных клеток из зачатка зуба; 3) объединение (рекомбинация) обоих пулов клеток и культивирование для воспроизведения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий одонтогенеза; 4) перенос клеточного-тканевого конструкта in vivo в субринальную капсулу или in vitro до формирования биоинженерного зачатка зуба; 5) перенос зачатка зуба в лунку зуба [11]. Благодаря этому методу удалось получить эквиваленты зубной ткани и целого зуба [26, 28].

Открытие новых механизмов одонтогенеза позволило усовершенствовать методы клеточно-тканевой рекомбинации. Например, было обнаружено, что в запуске одонтогенеза важную роль играют механические силы [22]. Оказалось, что механическое давление, которое возникает при инвагинации эпителия в мезенхиму, стимулирует секрецию фактора движения клеток FGF8 и фактора торможения движения клеток Sema3f. Сочетанное действие FGF8 и Sema3f приводит к конденсации мезенхимы и экспрессии ключевых триггеров одонтогенеза Pax9, Msx1 и Bmp4 в мезенхиме (рис. 5). T. Mammoto и соавт. [22] воспроизвели действие механического фактора in vitro и показали, что увеличение давления на мезенхимальные клетки увеличивало экспрессию тех же самых триггеров одонтогенеза.

Открытие механозависимых механизмов одонтогенеза было важной подсказкой, которой воспользовалась другая группа ученых. B. Hashmi и соавт. [8] использовали полимер, который сжимался при увеличении температуры с 34 до 37 °C. Этот полимер нагрузили мезенхимальными клетками при 34 °C и поместили в субренальную капсулу мыши. При температуре тела 37 °C полимер сократился и вызвал механическую конденсацию мезенхимальных клеток. Этого оказалось достаточно для индукции Pax9, Msx1 и Bmp4 и развития зубной ткани. Таким образом, было еще раз показано, что природа оперирует простыми механизмами: чтобы развиваться, надо просто собраться вместе.

Понимание значимости механических сил позволило исследователям из Токийского университета наук продвинуться еще дальше [26]. В конденсирующий гель они внесли и мезенхимальные, и эпителиальные клетки зачатка зуба. Через 2 дня образовался зачаток зуба, его перенесли в субренальную капсулу и через 14 дней получили биоинженерный зуб.

Разработать еще одну эффективную технологию биоинженерии зуба — технологию пластов клеток позволило понимание еще одной важной особенности одонтогенеза. Эта особенность состоит в том, что одонтогенез запускает инвагинация пласта эпителиальных клеток в пласт мезенхимальных [24] (см. рис. 5). Многие процессы формирования зуба также осуществляются пластами клеток, например пласты амелобластов синтезируют белки эмали, пласты одонтобластов покрывают изнутри пульпарную камеру и обеспечивают регенерацию дентина, а пласты эпителиальных клеток формируют ниши стволовых клеток, сеть Малассе и корневое влагалище Гертвига. Поэтому неудивительно, что идея использования пластов клеток в тканевой инженерии зуба оказалась весьма продуктивной. Выяснилось, что пласты клеток хорошо прикрепляются к тканям и имеют хорошую выживаемость после имплантации. Технологии клеточных пластов успешно используют для тканевой инженерии тканей пародонта, регенерации корней зуба [43, 50] и восстановления ткани пульпы и слоя одонтобластов [25].

Описанные выше технологии клеточно-тканевой рекомбинации и клеточных пластов были разработаны на основе понимания роли эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, но не учитывали еще одной важной особенности одонтогенеза — каждая стадия развития зуба имеет четкую компартментализацию эпителиальных и мезенхимальных клеток. Эти стадии даже были названы по форме компартментов клеток: «почка», «колпачок» и «колокол» (см. рис. 5). Природа в ходе длительной эволюции не оставляет «несущественных» деталей, и поэтому компартментализация клеток может иметь значение. Не исключено, что именно эти соображения легли в основу нового метода, метода клеточной компартментализации или, по другой терминологии, — биоинженерных зачатков. Этот метод воспроизводил компартменты клеток на ранних стадиях одонтогенеза [26] (рис. 6). При использовании этого метода на 1-м этапе так же, как и в методах клеточно-тканевой рекомбинации и клеточных пластов, выделяли эпителиальные и мезенхимальные клетки из зачатков зубов. Далее, уже в отличие от этих методов два типа клеток не смешивали и не наслаивали пластами, а вносили в коллагеновую каплю так, чтобы мезенхимальный пул клеток окружал эпителиальный, имитируя компарт-ментализацию этих клеток на стадии «колпачка» естественного развития зуба. Биоинженерные зачатки зубов, полученные таким методом, помещали в субренальную капсулу и они формировали полноценные зубы [26]. Позже выяснилось, что длина контакта между компартментами эпителиальных и мезенхимальных клеток предопределяет ширину коронки и количество бугорков на зубах [14]. Таким образом, еще раз подтвердилось, что природа оперирует простыми механизмами, а у исследователей появилась возможность контролировать форму коронки зуба.

Чтобы использовать метод биоинженерных зачатков в стоматологии, необходимо было ответить на три серьезных вопроса, возникающих при трансплантации таких зачатков: как обеспечить правильное прорезывание биоинженерного зачатка во взрослой лунке, как обеспечить правильное смыкание биоинженерного зуба с природным зубом, как «подключить» новый зуб к существующей системе иннервации и кровоснабжения. Поиск ответов на эти вопросы успешно начала группа Tsuji из Токийского университета науки. Они добились того, что биоинженерный зачаток прорезался, сформировал зуб, достиг противоположного зуба и сохранил с ним окклюзионный контакт [26]. Успех в использовании нового метода закрепила группа Tzong-Fu Kuo [45]. Они засевали верхний компартмент скэффолда эпителиальными клетками из десны и одонтобластами, полученными из DPSC, а нижний — остеобластами, полученными также из DPSC мини-свиней. После этого скэффолд с клетками переносили в зубную лунку мини-свиньи. Через 14 мес у 7 из 8 мини-свиней прорезались полноценные зубы.

Другая плодотворная идея в области решения вопросов интеграции зуба с тканями реципиента состояла в том, чтобы сначала выращивать биоинженерный комплекс, содержаший зрелый зуб, периодонтальные связки и альвеолярную кость, а затем переносить комплекс в лунку в челюсти [30]. M. Oshima и соавт. [30] разработали технологию получения такого комплекса (рис. 7). Они показали, что зубной комплекс, перенесенный в лунку, интегрировался с костью, сохраняя периодонтальные связки, и формировал контакт с противоположным зубом [30].

Несмотря на достижения в регенерации зуба с помощью эмбриональных клеток, их клиническое использование по понятным причинам не имеет перспектив. Поэтому в качестве источника клеток для биоинженерии зуба стали интенсивно изучать iPSC [32, 44]. Так, K. Otsu и соавт. [32] смешивали в коллагеновом геле мезенхимальные клетки зачатка зуба с iPSC мыши. Затем рекомбинант имплантировали в субренальную капсулу мыши и через 4 нед обнаруживали структуры с маркером амелобластов амелогенином. В другой работе этой же группы [31] было показано, что кокультура дентальных эпителиальных клеток и клеток нервного гребня, полученных из iPSC, экспрессирует маркер одонтобластов костный сиалопротеин. Это означало, что iPSC способны дифференцироваться в одонтобласты. После трансплантации кокультуры в суб-ренальную капсулу мышей формировались зачатки зуба. Эффективность использования iPSC для реконструкции зачатка зуба показали также Wen и соавт. [44].

Перенос или другими словами трансляцию экспериментальных разработок тканевой инженерии зуба в стоматологическую клинику сдерживает отсутствие ответов на несколько важных вопросов.

1. Какой тип клеток выбрать. В эксперименте использование эмбриональных клеток привело к хорошим результатам, но породило много проблем: сложность получения аутологичных клеток и риск образования опухоли [32]. Поэтому исследователи обратили внимание на аутологичные взрослые стволовые клетки. Дентальные эпителиальные клетки есть в сети Малассе на корнях, но их забор весьма сложен. Дентальные мезенхимальные стволовые клетки есть во взрослом зубе. Они подходят для регенерации тканей зуба [36], но не для выращивания целого зуба, потому что не обладают одонтогенным потенциалом. Повысить шансы трансляции биоинженерии зуба в клинику могут iPSC, потому что они могут дифференцироваться в эпителиальные и мезенхимальные клетки [27, 31]. Другой источник клеток для выращивания зуба, вероятно, может быть получен путем репрограммирования фенотипа клеток. Например, минуя стадию iPSC, панкреатические клетки были репрограммированы в β-клетки [51]. Вероятно, аналогичным образом клетки слизистой рта могли бы быть репрограммированы в дентальные клетки.

2. Какую технологию использовать. Выращивать ли ткань in vitro или in situ — сложный вопрос. Условия in vitro более контролируемы. Однако нормальное формирование ткани нуждается в естественном микроокружении, что в условиях in vitro трудно обеспечить. Существующие технологии пока не могут надежно контролировать форму, цвет и число растущих зубов [14]. Частично эта проблема может быть решена так: сначала выращивать корни, а затем добавлять искусственную коронку.

3. Как обеспечить формирование поддерживающих тканей, кровоснабжение и иннервацию биоинженерного продукта. Парадонт играет ключевую роль в прикреплении зуба, а снабжение кровью и иннервация — в регенерации и функционировании зуба. Поэтому для трансляции тканевой инженерии зуба в клинику необходимо, чтобы биоинженерный зуб стимулировал формирование структур парадонта, реваскуляризацию и реиннервацию [7, 33].

4. Каким образом обеспечить приемлемый для клинического использования срок развития биоинженерного зуба. Для выращивания зуба человека требуется много времени, что делает проблематичным использование таких зубов в качестве альтернативы имплантатам. Эту проблему можно решить, разработав способ ускоренного формирования биоинженерных зубов человек.

5. Как при трехмерной тканевой инженерии учитывать четвертое измерение — время. Будет ли пересаженная биоинженерная ткань расти в соответствии с ростом окружающих естественных тканей и как со временем изменятся свойства пересаженной ткани? Есть данные, что через 20—30 лет такая ткань может инициировать рост опухоли.

Не вызывает сомнения, что в следующем десятилетии регенеративная стоматология станет неотъемлемым компонентом лечения многих трудно излечимых заболеваний зубов! Есть много оснований полагать, что технологии тканевой инженерии позволят производить весь зубной комплекс, состоящий из полноценного зуба и пародонта, и в значительной степени заменят существующие методы протезирования зубов. Важно и то, что разработанные в тканевой инженерии зуба подходы могут помочь развитию технологий регенерации других органов и окажут влияние на всю регенеративную медицину.

Благодарности. Авторы благодарны М.А. Морозовой за техническую помощь в оформлении статьи. Обзор написан при поддержке Министерства здравоохранения РФ (Государственное задание Министерства здравоохранения РФ от 2 февраля 2016 г. № 056−00139−16, уникальный номер реест-ровой записи 110 401 000 000 000 000 071 021 02).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.