Биопленки полости рта запускают хронические воспалительные реакции, которые обусловливают деструктивные процессы. Однако характерные особенности специфических реакций организма человека на биопленки плохо изучены.
Зубная биопленка — это мультивидовое микробное сообщество, формирующееся в условиях текучих сред (слюна, десневая и ротовая жидкость) со сложной структурной организацией, включающей полимерно-клеточный матрикс и микроколонии микробов, регулирующееся многочисленными сигнальными взаимодействиями по типу прямых и обратных связей на уровне рецепторов и сигнальных молекул [1].
При пародонтите во время активных фаз разрушения тканей пародонта десневая жидкость обычно содержит высокие уровни медиаторов, таких как провоспалительные цитокины, способствующих воспалению [2].
Цитокины — короткоживущие, небольшие (10—30 кДа) гликопротеины, продуцируемые de novo в ответ на иммунные стимулы. Они опосредуют и регулируют иммунитет, воспаление, рост клеток, их дифференцировку и гемопоэз. Секретируются в основном лимфоцитами, моноцитами и макрофагами, но взаимодействуют с огромным числом клеток. Связываясь с рецепторами на клеточных мембранах, они запускают комплексы вторичных мессенжеров, которые переносят сигнал в ядро клетки; при этом меняется экспрессия многих генов. Цитокины являются мощными (функционирующими в наномолярных концентрациях), избыточными (многие из них индуцируют один и тот же ответ), плейотропными (отдельные цитокины индуцируют множественные реакции) веществами, действующими локально между соседними клетками. Они могут индуцировать синергичный (усиливая) или антагонистический (ослабляя) биологический ответ.
По мнению R. Medzhitov и C. Janeway, цитокины являются «молекулярными светофорами», регулирующими скорость и степень иммунных реакций [3].
Современные исследования указывают на то, что ответ десневых клеток различен в случае инфицирования полости рта (ПР) однородной биопленкой [4], многовидовыми биопленками [5] и планктонными бактериями [6].
В ПР обитают резиденты и патогены, которые поддерживают гомеостаз с эпителием [7]. Это может быть обусловлено тем, что система врожденного иммунитета высокоактивна в здоровых тканях. Нарушение баланса в этой системе может оказать воздействие на ткани пародонта [8].
Данные ряда зарубежных и отечественных исследователей позволяют выделить пародонтопатогенные виды 1-го порядка («красный комплекс») и 2-го порядка («оранжевый» и частично «желтый комплекс»), а также ряд видов, встречающихся в ПР постоянно, но количество которых резко возрастает при развитии пародонтита.
К пародонтопатогенам 1-го порядка относят Aggrega-tibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis и Tannerella forsythia, доказана возможность их распространения в человеческой популяции по типу экзогенного инфекционного агента и выражена их тенденция к внутриклеточному паразитизму в десневом эпителии и тканях пародонта.
К пародонтопатогенам 2-го порядка относятся грам-отрицательные анаэробные бактерии Prevotella intermedia/nigrescens, Treponema denticola, Eykenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Wollinella recta, а также грамположительные — Streptococcus intermedius, Parvimonas micra и некоторые представители рода Actinomyces [9].
Биопленки и планктонные бактерии индуцируют разные сигнальные ответы
R. Peyyala и соавт. [4] разработали модели биопленок со Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Actinomyces naeslundii, F. nucleatum и P. gingivalis на твердых газопроницаемых контактных линзах. Биопленки и планктонные культуры инкубировали при анаэробных условиях с линией OKF4 эпителиальных клеток в течение 24 ч. При этом биопленки P. gingivalis значительно ингибировали продукцию онкогена, регулирующего рост (Gro-1α), интерлейкина (ИЛ) α, ИЛ-6, ИЛ-8, трансформирующего фактора роста-α (TGF-α), фракталкина (CX3CL1), макрофагального белка воспаления α (MIP α) и интерферон — α индуцибельного протеина 10 (IP-10). В целом биопленки всех видов бактерий ингибировали продукцию Gro-1α, TGF-α и фракталкина, тогда как биопленки F. nucleatum, напротив, стимулировали значительное увеличение продукции ИЛ-1α, ИЛ-6, ИЛ-8 и IP-10. Биопленки A. naeslundii также индуцировали повышенные уровни ИЛ-6, ИЛ-8 и IP-10. Планктонные стрептококки полости рта и в виде биопленки слабо стимулировали выделение любого из этих медиаторов эпителиальными клетками.
Увеличение количества медиаторов острого воспаления (например, ИЛ-8) усиливает рекрутирование нейтрофилов и потенцирует удаление любых внедрившихся микробов [10]. Биопленки P. gingivalis индуцировали экспрессию генов ИЛ-8, тогда как секреция ИЛ-8 не коррелировала с экспрессией генов. Это можно объяснить тем, что бактерии выделяют гингипаины, ключевые факторы вирулентности P. gingivalis, оказывающие влияние на компоненты иммунной системы человека [11]. Поэтому авторы считают, что данная модель позволяет отличать биопленки от планктонных бактерий, патогенов и комменсалов [4].
R. McLaughlin и A. Hoogewerf [12] также представили доказательства того, что биопленки и планктонные бактерии по-разному реагируют на химические медиаторы. Так, биопленки Staphylococcus aureus, обработанные 2 нг/мл ИЛ-1β в течение 6 ч, содержали в 2,5 раза больше клеток, чем необработанные биопленки. В планктонных культурах увеличения роста бактерий не наблюдалось. С помощью проточной цитометрии было показано, что ИЛ-1β связывался с 63% клеток биопленки, но только с 11% планктонных клеток. По-видимому, бактерии в биопленке ускользают от защитных реакций организма человека, размножаясь более быстро при выделении медиаторов воспаления активированными протективными клетками. S. Kanangat и соавт. [13] также показали, что рост биопленок S. aureus in vitro увеличивался в присутствии ИЛ-1β. Линейные пептидные фрагменты (<5 кДа) ИЛ-1β человека также усиливали их рост. Помимо этого, ИЛ модулировали экспрессию гена биопленок S. aureus. Они уменьшали экспрессию некоторых декодирующих токсины генов и повышали экспрессию генов, ответственных за прикрепление к тканям организма хозяина.
Результаты данных исследований показали, что биопленки и планктонные бактерии ПР индуцировали разные ответы. Более того, некоторые виды бактерий в биопленках обладали высокой стимулирующей активностью и при взаимодействии с рецепторами клеток организма индуцировали ответ, отличный от такового у отдельных бактерий.
Одновидовые биопленки более эффективно индуцировали секрецию ИЛ-8 эпителиальными клетками ПР, чем планктонные бактерии, за исключением P. gingivalis [4, 14], особенно если они находились в составе 3-видовой биопленки.
Cпособность P. gingivalis в планктонной форме ингибировать экспрессию генов ИЛ-8 эпителиальными клетками десен назвали «хемокиновым параличом» [15, 16].
Медиаторы, выделяемые в ответ на одновидовые и многовидовые биопленки
Известно, что A. actinomycetemcomitans — единственный пародонтопатоген, который способен и распознавать, и связывать ИЛ-1β. У клинических штаммов этого вида наблюдался физиологический ответ на цитокины, выражавшийся в снижении метаболизма и увеличении массы биопленки [17]. Биопленки A. actinomycetemcomitans, культивируемые в модели органотипической слизистой десны, связывали ИЛ-1β, но использование антибиотиков во время их совместного культивирования ингибировало его связывание. Более того A. actinomycetemcomitans, по-видимому, поглощают ИЛ-1β, так как этот цитокин был обнаружен в межклеточном пространстве и цитоплазме этих бактерий [18]. Внутриклеточные протеины (трехмерная форма субъединицы β-синтазы аденозинтрифосфата и бактериальный подобный гистону протеин HU) могут взаимодействовать с ИЛ-1β человека [17, 18]. Взаимодействие интернализированного ИЛ-1β с ключевым протеином в выработке клеточной энергии и протеином HU, конденсирующим геномную ДНК, может объяснить описанные выше физиологические ответы A. actinomycetemcomitans. Эти результаты позволяют предположить, что жизнестойкие клетки A. actinomycetemcomitans обладают специфическим механизмом усваивания ИЛ-1β. В геноме A. actinomycetemcomitans закодирован липопротеин внешней мембраны, специфичный к Pasteurellaceae и ответственный за взаимодействие с ИЛ-1β [18]. При снижении жизнеспособности клеток в составе биопленок блокируется их способность связывать ИЛ-1β, что приводит к утечке ИЛ-1β в культуральную среду. В некоторых клетках A. actinomycetemcomitans ИЛ-1β локализуется во внешней кромке нуклеоида. Близкий контакт с живыми биопленками A. actinomycetemcomitans уменьшал пролиферацию и апоптоз десневых кератиноцитов человека. Авторы предполагают, что биопленки A. actinomycetemcomitans могут нарушать решающий первый этап локального воспаления при пародонтите, связывая и интернализируя ИЛ-1β [17].
Многовидовые биопленки обладают уникальными признаками, а в зависимости от видового состава они могут быть ассоциированы со здоровым пародонтом, гингивитом или пародонтитом, что было подтверждено при использовании сканирующей электронной микроскопии в сочетании с полимеразной цепной реакцией [19].
P. gingivalis, T. forsythia и T. denticola — пародонтопатогены так называемого «красного комплекса». Они ассоциированы с поддесневой биопленкой в участках повреждения при пародонтите. G. Belibasakis и соавт. [10] показали, что при культивировании многослойной органотипической культуры эпителиальных клеток человека с 10-видовой биопленкой — Campylobacter rectus (OMZ 697), F. nucleatum (OMZ 596), P. gingivalis ATCC 33277T (OMZ 925), P. intermedia ATCC 25611T (OMZ 278), T. forsythia OMZ1047, T. denticola ATCC 35405T (OMZ 661), Veillonella dispar ATCC 17748T (OMZ 493), Actinomyces oris (OMZ 745), Streptococcus anginosus (OMZ 871) и S. oralis SK 248 (OMZ 607)) или 7-видовой, в которой отсутствовали пародонтопатогены «красного комплекса», через 3 ч повышалась экспрессия генов ИЛ-8 одинаково независимо от видового состава биопленки. При добавлении пародонтопатогенов «красного комплекса» экспрессия генов ИЛ-8 увеличивалась в 3 раза. Через 24 ч секреция ИЛ-8 снижалась до 50% уровня в контрольных клетках, культивируемых на гидроксиапатите, обработанном слюной. Но это не происходило при отсутствии пародонтопатогенов «красного комплекса». Авторы пришли к выводу, что пародонтопатогены «красного комплекса» в составе биопленки по-разному регулируют хемотаксический ответ. Другие авторы также показали, что экспрессия ИЛ-8 индуцируется T. denticola, P. gingivalis, T. forsythia, а также их ассоциациями [20].
В 9-видовой системе без T. denticola наблюдалось повышение секреции ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-8 через 4 ч и снижение через 24 ч [5].
Можно предположить, что как полимикробные ассоциации, так и P. gingivalis, T. denticola и T. forsythia могут регулировать хемоаттрактантный ответ ИЛ-8 эпителиальных клеток, обладая потенциалом разрушения гомеостаза организма хозяина с микробом, возможно, в качестве стратегии манипулирования локальным ответом врожденной иммунной системы и повышения шанса их выживания в поддесневой нише.
Этим результатам соответствуют данные о том, что биопленки одного вида F. nucleatum, A. naeslundii, S. gordonii и S. oralis также повышали экспрессию генов ИЛ-8 в эпителиальных клетках ПР через 6 ч культивирования in vitro, тогда как S. sanguinis не влияли, а P. gingivalis даже понижали их экспрессию [21].
Биопленка, состоящая из S. gordonii, A. naeslundii и F. nucleatum, индуцировала увеличение, а включающая S. gordonii, F. nucleatum и P. gingivalis — уменьшала секрецию ИЛ-8 [22]. Это может указывать на то, что P. gingivalis способны снижать хемоаттрактантный ответ эпителиальных клеток [10].
R. Peyyala и соавт. [22] выявили специфические медиаторы, уровень которых был значительно выше при стимуляции многовидовыми биопленками по сравнению с тем, которого можно было бы ожидать при простом аддитивном эффекте монобиопленок. Наконец, многие биопленки проявляют ингибирующее действие либо не изменяют нормальные фоновые уровни медиаторов, трансляции и секреции и (или) разрушают различные медиаторы в модельных системах биопленок. Это часто контрастирует с уровнями медиаторов, ожидаемыми при стимуляции монобиопленками или заражении планктонными бактериями [4].
В системе мультивидовых биопленок на гидроксиапатитных дисках, культивируемых с эпителиальными клетками, клетками периодонтальных связок или пульпы зубов, наблюдалось значительное увеличение апоптоза и деградации ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8. Биопленки, представленные некоторыми видами, значительно увеличивали содержание ряда медиаторов, тогда как биопленки P. gingivalis оказывали противоположное действие даже на базальную продукцию цитокинов/хемокинов [5]. Кроме того, были выявлены гингипаины P. gingivalis инактивирующие фактор некроза опухоли (ФНО-α) [23].
Установлено, что биопленки, состоящие из S. gordonii, S. oralis, S. sanguinis, F. nucleatum и P. gingivalis, индуцируют более высокие уровни ИЛ-1α и проявляют синергичную стимулирующую активность по сравнению с аддитивным ответом 3 индивидуальных видов бактерий. Только биопленки S. gordoni/A. naeslundii и A. naeslundii/F. nucleatum индуцировали более высокие уровни секреции ИЛ-6, чем в контроле. При культивировании с S. gordoni/A. naeslundii/F. nucleatum первым секретировался ИЛ-8, хотя его уровень был не выше предполагаемого композиционного, индуцируемого монобиопленками [24].
Эпителиальные клетки распознают резидентные и патогенные микробы
Распознавание как резидентов, так и патогенов может инициировать врожденный иммунный ответ через толл-подобные рецепторы (ТЛР) [25]. E. Millhouse и соавт. [26] выявили четкие различия в ответе эпителиальных клеток после заражения комменсалами и патогенами. Эти данные согласуются с данными B. Dickinson и соавт. (2011) и Y. Hasegawa и соавт. (2007), которые изучали in vitro реакции десневого эпителия на патогены и резиденты [27, 28]. Резиденты П.Р. S. gordonii, а также F. nucleatum индуцировали транскриптом эпителиальных клеток менее значительно по сравнению с пародонтопатогенами P. gingivalis и A. actinomycetemcomitans. Ограниченность этой работы была в том, что с эпителиальными клетками культивировали суспензию бактерий.
Другие исследователи также выявили разный ответ эпителиальных клеток (секрецию цитокинов и хемокинов) на биопленки патогенов и резидентов [4]. Они определили также меньший уровень продукции ИЛ-8 и ИЛ-1α на P. gingivalis и Streptococcus spp.
R. Peyyala и J. Ebersole считают, что способность разных видов бактерий в составе зубной биопленки индуцировать разный цитокиновый профиль эпителиальных клеток десны может отражать их индивидуальную вирулентность или статус резидента [6]. Так, P. gingivalis индуцировали высокие уровни ИЛ-1β, A. actinomycetemcomitans — ИЛ-8, F. nucleatum — ИЛ-1β и ИЛ-6, S. gordonii вызывали минимальный хемокиновый ответ.
Все пародонтопатогены «красного комплекса» способны синергично колонизировать десневые эпителиальные клетки. Отмечена тенденция совместной локализации P. gingivalis и T. denticola. При отсутствии пародонтопатогенов «красного комплекса» десневой эпителий колонизируют стрептококки, преимущественно S. oralis. Исходя из этого антагонизма, авторы полагают, что бактерии «красного комплекса» могут регулировать вирулентность биопленки, играющей роль в патогенезе пародонтита [29].
Биопленки смешанных патогенов и биопленки P. gingivalis обладают огромным числом факторов вирулентности, которые могут индуцировать врожденный иммунный ответ. P. gingivalis контактируют с эпителиальными клетками с помощью фимбрий и гингипаинов и проникают в клетки [30]. Липополисахарид и его компонент липид, А P. gingivalis индуцируют сильный ответ иммунной системы человека, поскольку связываются с комплексом ТЛР, способствуя секреции провоспалительных цитокинов эпителиальными клетками и клетками других типов [31]. Гингипаины P. gingivalis разрушают цитокины и сеть цитокиновых рецепторов хозяина, включая ИЛ-1β, интер-ферон-γ (ИФН-γ) и ФНО-α [32].
Этим можно объяснить то, почему секреция данных цитокинов и хемокинов не коррелирует с экспрессией генов. Все эти факторы обусловливают патогенный потенциал P. gingivalis. Эпителиальные клетки не полностью защищают организм хозяина от действия биопленки, содержащей пародонтопатогенные виды бактерий.
В серии элегантных экспериментов T. Maekawa и соавт. [33] показали, что P. gingivalis ингибирует киллинг бактерий нейтрофилами и в то же время поддерживает сильный цитокиновый провоспалительный ответ. Эти процессы сопровождаются коактивацией ТЛР-2 и C5a-рецепторов нейтрофилов. Важно отметить, что данная работа дает доказательства, хотя бы на мышиной модели, того, что активация фосфатидилинозитол-3-киназы P. gingivalis не только усиливает собственную резистентность к фагоцитозу, но и другого ассоцианта дентальной биопленки — F. nucleatum.
По данным С.С. Афанасьева и соавт. [34], ИЛ и ИФН способны реагировать непосредственно с микробами, изменяя скорость их роста и биологические свойства, в том числе чувствительность к антибактериальным препаратам. Так, установлено, что ФНО-α и ИФН-γ повышали чувствительность штаммов S. aureus, Enterobacter cloacae и Escherichia coli к бензилпенициллину и тетрациклину, а ИФН-α2, наоборот, снижал чувствительность этих бактерий к антибиотикам, т. е. провоцировал устойчивость, блокируя даже совместное действие ФНО-α и ИФН-γ.
В настоящее время точно не известно, каким образом Streptococcus mitis взаимодействуют с системой врожденного иммунитета. Ранее было показано, что S. mitis значительно толерантны к β-дефензинам-2 человека и другим антимикробным пептидам (АМП) [35, 36]. S. mitis также могут модулировать экспрессию провоспалительного хемокина ИЛ-8 [37]. Исходя из этого, можно считать, что S. mitis в качестве полезного комменсала способны дополнять иммунитет хозяина, поддерживая тканевый гомеостаз.
Вирулентность Candida albicans выше в зрелых смешанных многовидовых биопленках, культивируемых на реконструированных эпителиальных клетках человека (RHOE), чем в одновидовых биопленках. При этом наблюдается повышение секреции ИЛ-18, активности лактатдегидрогеназы и инвазивности C. albicans. В ответ на инфицирование C. albicans эпителиальные клетки ПР продуцируют большие количества ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α. Это указывает на то, что цитокины играют значительную роль в контроле инфекций ПР [38, 39]. После контакта с Candida parapsilosis гингивальные эпителиальные клетки человека экспрессируют высокие уровни мРНК ТЛР-2, ТЛР-4, но не ТЛР-9. Повышенным уровнем цитокинов и АМП можно объяснить ингибирование роста C. parapsilosis на эпителиальных клетках десен [40, 41].
Таким образом, все эти исследования показали, что эпителиальные клетки по-разному реагируют на патогены и комменсалы. Точный механизм этих процессов не полностью понятен.
Известно, что образование биопленок вносит значительный вклад в формирование у бактерий резистентности к антибиотикам и факторам врожденного иммунитета организма хозяина [42, 43]. Механизмы устойчивости биопленок к защитным реакциям организма могут включать изменения в экспрессии генов, которые обеспечивают реактивность к химическим медиаторам. Так как биопленки более похожи на рост бактерий in vivo и участвуют в формировании инфекций, можно предположить, что они, но не планктонные клетки, должны были отвечать на цитокины.
Помимо разных видов бактерий, герпес-вирусы и дрожжевые грибы, обнаруживаемые в биопленках поддесневых областей, могут распознавать и связывать цитокины, вырабатываемые организмом хозяина [44].
Даже несмотря на то что в области изучения биопленок получены важные научные результаты, контроль биопленок остается все еще нерешенной проблемой и является центральным направлением современных исследований.
Таким образом, для системы врожденного иммунитета характерен дифференцированный цитокиновый ответ на бактерии ПР.
Значимость этих механизмов для широкой клинической практики определяет необходимость внедрения адекватных и надежных методов оценки компонентов систем ИЛ, дефензинов и их рецепторов, которые могут быть воспроизведены в условиях клинической лаборатории лечебно-профилактических учреждений.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.