Биопленки полости рта запускают хронические воспалительные реакции, которые обусловливают деструктивные процессы. Однако характерные особенности специфических реакций организма человека на биопленки плохо изучены.

Зубная биопленка — это мультивидовое микробное сообщество, формирующееся в условиях текучих сред (слюна, десневая и ротовая жидкость) со сложной структурной организацией, включающей полимерно-клеточный матрикс и микроколонии микробов, регулирующееся многочисленными сигнальными взаимодействиями по типу прямых и обратных связей на уровне рецепторов и сигнальных молекул [1].

При пародонтите во время активных фаз разрушения тканей пародонта десневая жидкость обычно содержит высокие уровни медиаторов, таких как провоспалительные цитокины, способствующих воспалению [2].

Цитокины — короткоживущие, небольшие (10—30 кДа) гликопротеины, продуцируемые de novo в ответ на иммунные стимулы. Они опосредуют и регулируют иммунитет, воспаление, рост клеток, их дифференцировку и гемопоэз. Секретируются в основном лимфоцитами, моноцитами и макрофагами, но взаимодействуют с огромным числом клеток. Связываясь с рецепторами на клеточных мембранах, они запускают комплексы вторичных мессенжеров, которые переносят сигнал в ядро клетки; при этом меняется экспрессия многих генов. Цитокины являются мощными (функционирующими в наномолярных концентрациях), избыточными (многие из них индуцируют один и тот же ответ), плейотропными (отдельные цитокины индуцируют множественные реакции) веществами, действующими локально между соседними клетками. Они могут индуцировать синергичный (усиливая) или антагонистический (ослабляя) биологический ответ.

По мнению R. Medzhitov и C. Janeway, цитокины являются «молекулярными светофорами», регулирующими скорость и степень иммунных реакций [3].

Современные исследования указывают на то, что ответ десневых клеток различен в случае инфицирования полости рта (ПР) однородной биопленкой [4], многовидовыми биопленками [5] и планктонными бактериями [6].

В ПР обитают резиденты и патогены, которые поддерживают гомеостаз с эпителием [7]. Это может быть обусловлено тем, что система врожденного иммунитета высокоактивна в здоровых тканях. Нарушение баланса в этой системе может оказать воздействие на ткани пародонта [8].

Данные ряда зарубежных и отечественных исследователей позволяют выделить пародонтопатогенные виды 1-го порядка («красный комплекс») и 2-го порядка («оранжевый» и частично «желтый комплекс»), а также ряд видов, встречающихся в ПР постоянно, но количество которых резко возрастает при развитии пародонтита.

К пародонтопатогенам 1-го порядка относят Aggrega-tibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis и Tannerella forsythia, доказана возможность их распространения в человеческой популяции по типу экзогенного инфекционного агента и выражена их тенденция к внутриклеточному паразитизму в десневом эпителии и тканях пародонта.

К пародонтопатогенам 2-го порядка относятся грам-отрицательные анаэробные бактерии Prevotella intermedia/nigrescens, Treponema denticola, Eykenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Wollinella recta, а также грамположительные — Streptococcus intermedius, Parvimonas micra и некоторые представители рода Actinomyces [9].

R. Peyyala и соавт. [4] разработали модели биопленок со Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Actinomyces naeslundii, F. nucleatum и P. gingivalis на твердых газопроницаемых контактных линзах. Биопленки и планктонные культуры инкубировали при анаэробных условиях с линией OKF4 эпителиальных клеток в течение 24 ч. При этом биопленки P. gingivalis значительно ингибировали продукцию онкогена, регулирующего рост (Gro-1α), интерлейкина (ИЛ) α, ИЛ-6, ИЛ-8, трансформирующего фактора роста-α (TGF-α), фракталкина (CX3CL1), макрофагального белка воспаления α (MIP α) и интерферон — α индуцибельного протеина 10 (IP-10). В целом биопленки всех видов бактерий ингибировали продукцию Gro-1α, TGF-α и фракталкина, тогда как биопленки F. nucleatum, напротив, стимулировали значительное увеличение продукции ИЛ-1α, ИЛ-6, ИЛ-8 и IP-10. Биопленки A. naeslundii также индуцировали повышенные уровни ИЛ-6, ИЛ-8 и IP-10. Планктонные стрептококки полости рта и в виде биопленки слабо стимулировали выделение любого из этих медиаторов эпителиальными клетками.

Увеличение количества медиаторов острого воспаления (например, ИЛ-8) усиливает рекрутирование нейтрофилов и потенцирует удаление любых внедрившихся микробов [10]. Биопленки P. gingivalis индуцировали экспрессию генов ИЛ-8, тогда как секреция ИЛ-8 не коррелировала с экспрессией генов. Это можно объяснить тем, что бактерии выделяют гингипаины, ключевые факторы вирулентности P. gingivalis, оказывающие влияние на компоненты иммунной системы человека [11]. Поэтому авторы считают, что данная модель позволяет отличать биопленки от планктонных бактерий, патогенов и комменсалов [4].

R. McLaughlin и A. Hoogewerf [12] также представили доказательства того, что биопленки и планктонные бактерии по-разному реагируют на химические медиаторы. Так, биопленки Staphylococcus aureus, обработанные 2 нг/мл ИЛ-1β в течение 6 ч, содержали в 2,5 раза больше клеток, чем необработанные биопленки. В планктонных культурах увеличения роста бактерий не наблюдалось. С помощью проточной цитометрии было показано, что ИЛ-1β связывался с 63% клеток биопленки, но только с 11% планктонных клеток. По-видимому, бактерии в биопленке ускользают от защитных реакций организма человека, размножаясь более быстро при выделении медиаторов воспаления активированными протективными клетками. S. Kanangat и соавт. [13] также показали, что рост биопленок S. aureus in vitro увеличивался в присутствии ИЛ-1β. Линейные пептидные фрагменты (<5 кДа) ИЛ-1β человека также усиливали их рост. Помимо этого, ИЛ модулировали экспрессию гена биопленок S. aureus. Они уменьшали экспрессию некоторых декодирующих токсины генов и повышали экспрессию генов, ответственных за прикрепление к тканям организма хозяина.

Результаты данных исследований показали, что биопленки и планктонные бактерии ПР индуцировали разные ответы. Более того, некоторые виды бактерий в биопленках обладали высокой стимулирующей активностью и при взаимодействии с рецепторами клеток организма индуцировали ответ, отличный от такового у отдельных бактерий.

Одновидовые биопленки более эффективно индуцировали секрецию ИЛ-8 эпителиальными клетками ПР, чем планктонные бактерии, за исключением P. gingivalis [4, 14], особенно если они находились в составе 3-видовой биопленки.

Cпособность P. gingivalis в планктонной форме ингибировать экспрессию генов ИЛ-8 эпителиальными клетками десен назвали «хемокиновым параличом» [15, 16].

Известно, что A. actinomycetemcomitans — единственный пародонтопатоген, который способен и распознавать, и связывать ИЛ-1β. У клинических штаммов этого вида наблюдался физиологический ответ на цитокины, выражавшийся в снижении метаболизма и увеличении массы биопленки [17]. Биопленки A. actinomycetemcomitans, культивируемые в модели органотипической слизистой десны, связывали ИЛ-1β, но использование антибиотиков во время их совместного культивирования ингибировало его связывание. Более того A. actinomycetemcomitans, по-видимому, поглощают ИЛ-1β, так как этот цитокин был обнаружен в межклеточном пространстве и цитоплазме этих бактерий [18]. Внутриклеточные протеины (трехмерная форма субъединицы β-синтазы аденозинтрифосфата и бактериальный подобный гистону протеин HU) могут взаимодействовать с ИЛ-1β человека [17, 18]. Взаимодействие интернализированного ИЛ-1β с ключевым протеином в выработке клеточной энергии и протеином HU, конденсирующим геномную ДНК, может объяснить описанные выше физиологические ответы A. actinomycetemcomitans. Эти результаты позволяют предположить, что жизнестойкие клетки A. actinomycetemcomitans обладают специфическим механизмом усваивания ИЛ-1β. В геноме A. actinomycetemcomitans закодирован липопротеин внешней мембраны, специфичный к Pasteurellaceae и ответственный за взаимодействие с ИЛ-1β [18]. При снижении жизнеспособности клеток в составе биопленок блокируется их способность связывать ИЛ-1β, что приводит к утечке ИЛ-1β в культуральную среду. В некоторых клетках A. actinomycetemcomitans ИЛ-1β локализуется во внешней кромке нуклеоида. Близкий контакт с живыми биопленками A. actinomycetemcomitans уменьшал пролиферацию и апоптоз десневых кератиноцитов человека. Авторы предполагают, что биопленки A. actinomycetemcomitans могут нарушать решающий первый этап локального воспаления при пародонтите, связывая и интернализируя ИЛ-1β [17].

Многовидовые биопленки обладают уникальными признаками, а в зависимости от видового состава они могут быть ассоциированы со здоровым пародонтом, гингивитом или пародонтитом, что было подтверждено при использовании сканирующей электронной микроскопии в сочетании с полимеразной цепной реакцией [19].

P. gingivalis, T. forsythia и T. denticola — пародонтопатогены так называемого «красного комплекса». Они ассоциированы с поддесневой биопленкой в участках повреждения при пародонтите. G. Belibasakis и соавт. [10] показали, что при культивировании многослойной органотипической культуры эпителиальных клеток человека с 10-видовой биопленкой — Campylobacter rectus (OMZ 697), F. nucleatum (OMZ 596), P. gingivalis ATCC 33277^T (OMZ 925), P. intermedia ATCC 25611^T (OMZ 278), T. forsythia OMZ1047, T. denticola ATCC 35405^T (OMZ 661), Veillonella dispar ATCC 17748^T (OMZ 493), Actinomyces oris (OMZ 745), Streptococcus anginosus (OMZ 871) и S. oralis SK 248 (OMZ 607)) или 7-видовой, в которой отсутствовали пародонтопатогены «красного комплекса», через 3 ч повышалась экспрессия генов ИЛ-8 одинаково независимо от видового состава биопленки. При добавлении пародонтопатогенов «красного комплекса» экспрессия генов ИЛ-8 увеличивалась в 3 раза. Через 24 ч секреция ИЛ-8 снижалась до 50% уровня в контрольных клетках, культивируемых на гидроксиапатите, обработанном слюной. Но это не происходило при отсутствии пародонтопатогенов «красного комплекса». Авторы пришли к выводу, что пародонтопатогены «красного комплекса» в составе биопленки по-разному регулируют хемотаксический ответ. Другие авторы также показали, что экспрессия ИЛ-8 индуцируется T. denticola, P. gingivalis, T. forsythia, а также их ассоциациями [20].

В 9-видовой системе без T. denticola наблюдалось повышение секреции ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-8 через 4 ч и снижение через 24 ч [5].

Можно предположить, что как полимикробные ассоциации, так и P. gingivalis, T. denticola и T. forsythia могут регулировать хемоаттрактантный ответ ИЛ-8 эпителиальных клеток, обладая потенциалом разрушения гомеостаза организма хозяина с микробом, возможно, в качестве стратегии манипулирования локальным ответом врожденной иммунной системы и повышения шанса их выживания в поддесневой нише.

Этим результатам соответствуют данные о том, что биопленки одного вида F. nucleatum, A. naeslundii, S. gordonii и S. oralis также повышали экспрессию генов ИЛ-8 в эпителиальных клетках ПР через 6 ч культивирования in vitro, тогда как S. sanguinis не влияли, а P. gingivalis даже понижали их экспрессию [21].

Биопленка, состоящая из S. gordonii, A. naeslundii и F. nucleatum, индуцировала увеличение, а включающая S. gordonii, F. nucleatum и P. gingivalis — уменьшала секрецию ИЛ-8 [22]. Это может указывать на то, что P. gingivalis способны снижать хемоаттрактантный ответ эпителиальных клеток [10].

R. Peyyala и соавт. [22] выявили специфические медиаторы, уровень которых был значительно выше при стимуляции многовидовыми биопленками по сравнению с тем, которого можно было бы ожидать при простом аддитивном эффекте монобиопленок. Наконец, многие биопленки проявляют ингибирующее действие либо не изменяют нормальные фоновые уровни медиаторов, трансляции и секреции и (или) разрушают различные медиаторы в модельных системах биопленок. Это часто контрастирует с уровнями медиаторов, ожидаемыми при стимуляции монобиопленками или заражении планктонными бактериями [4].

В системе мультивидовых биопленок на гидроксиапатитных дисках, культивируемых с эпителиальными клетками, клетками периодонтальных связок или пульпы зубов, наблюдалось значительное увеличение апоптоза и деградации ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8. Биопленки, представленные некоторыми видами, значительно увеличивали содержание ряда медиаторов, тогда как биопленки P. gingivalis оказывали противоположное действие даже на базальную продукцию цитокинов/хемокинов [5]. Кроме того, были выявлены гингипаины P. gingivalis инактивирующие фактор некроза опухоли (ФНО-α) [23].

Установлено, что биопленки, состоящие из S. gordonii, S. oralis, S. sanguinis, F. nucleatum и P. gingivalis, индуцируют более высокие уровни ИЛ-1α и проявляют синергичную стимулирующую активность по сравнению с аддитивным ответом 3 индивидуальных видов бактерий. Только биопленки S. gordoni/A. naeslundii и A. naeslundii/F. nucleatum индуцировали более высокие уровни секреции ИЛ-6, чем в контроле. При культивировании с S. gordoni/A. naeslundii/F. nucleatum первым секретировался ИЛ-8, хотя его уровень был не выше предполагаемого композиционного, индуцируемого монобиопленками [24].

Распознавание как резидентов, так и патогенов может инициировать врожденный иммунный ответ через толл-подобные рецепторы (ТЛР) [25]. E. Millhouse и соавт. [26] выявили четкие различия в ответе эпителиальных клеток после заражения комменсалами и патогенами. Эти данные согласуются с данными B. Dickinson и соавт. (2011) и Y. Hasegawa и соавт. (2007), которые изучали in vitro реакции десневого эпителия на патогены и резиденты [27, 28]. Резиденты П.Р. S. gordonii, а также F. nucleatum индуцировали транскриптом эпителиальных клеток менее значительно по сравнению с пародонтопатогенами P. gingivalis и A. actinomycetemcomitans. Ограниченность этой работы была в том, что с эпителиальными клетками культивировали суспензию бактерий.

Другие исследователи также выявили разный ответ эпителиальных клеток (секрецию цитокинов и хемокинов) на биопленки патогенов и резидентов [4]. Они определили также меньший уровень продукции ИЛ-8 и ИЛ-1α на P. gingivalis и Streptococcus spp.

R. Peyyala и J. Ebersole считают, что способность разных видов бактерий в составе зубной биопленки индуцировать разный цитокиновый профиль эпителиальных клеток десны может отражать их индивидуальную вирулентность или статус резидента [6]. Так, P. gingivalis индуцировали высокие уровни ИЛ-1β, A. actinomycetemcomitans — ИЛ-8, F. nucleatum — ИЛ-1β и ИЛ-6, S. gordonii вызывали минимальный хемокиновый ответ.

Все пародонтопатогены «красного комплекса» способны синергично колонизировать десневые эпителиальные клетки. Отмечена тенденция совместной локализации P. gingivalis и T. denticola. При отсутствии пародонтопатогенов «красного комплекса» десневой эпителий колонизируют стрептококки, преимущественно S. oralis. Исходя из этого антагонизма, авторы полагают, что бактерии «красного комплекса» могут регулировать вирулентность биопленки, играющей роль в патогенезе пародонтита [29].

Биопленки смешанных патогенов и биопленки P. gingivalis обладают огромным числом факторов вирулентности, которые могут индуцировать врожденный иммунный ответ. P. gingivalis контактируют с эпителиальными клетками с помощью фимбрий и гингипаинов и проникают в клетки [30]. Липополисахарид и его компонент липид, А P. gingivalis индуцируют сильный ответ иммунной системы человека, поскольку связываются с комплексом ТЛР, способствуя секреции провоспалительных цитокинов эпителиальными клетками и клетками других типов [31]. Гингипаины P. gingivalis разрушают цитокины и сеть цитокиновых рецепторов хозяина, включая ИЛ-1β, интер-ферон-γ (ИФН-γ) и ФНО-α [32].

Этим можно объяснить то, почему секреция данных цитокинов и хемокинов не коррелирует с экспрессией генов. Все эти факторы обусловливают патогенный потенциал P. gingivalis. Эпителиальные клетки не полностью защищают организм хозяина от действия биопленки, содержащей пародонтопатогенные виды бактерий.

В серии элегантных экспериментов T. Maekawa и соавт. [33] показали, что P. gingivalis ингибирует киллинг бактерий нейтрофилами и в то же время поддерживает сильный цитокиновый провоспалительный ответ. Эти процессы сопровождаются коактивацией ТЛР-2 и C5a-рецепторов нейтрофилов. Важно отметить, что данная работа дает доказательства, хотя бы на мышиной модели, того, что активация фосфатидилинозитол-3-киназы P. gingivalis не только усиливает собственную резистентность к фагоцитозу, но и другого ассоцианта дентальной биопленки — F. nucleatum.

По данным С.С. Афанасьева и соавт. [34], ИЛ и ИФН способны реагировать непосредственно с микробами, изменяя скорость их роста и биологические свойства, в том числе чувствительность к антибактериальным препаратам. Так, установлено, что ФНО-α и ИФН-γ повышали чувствительность штаммов S. aureus, Enterobacter cloacae и Escherichia coli к бензилпенициллину и тетрациклину, а ИФН-α₂, наоборот, снижал чувствительность этих бактерий к антибиотикам, т. е. провоцировал устойчивость, блокируя даже совместное действие ФНО-α и ИФН-γ.

В настоящее время точно не известно, каким образом Streptococcus mitis взаимодействуют с системой врожденного иммунитета. Ранее было показано, что S. mitis значительно толерантны к β-дефензинам-2 человека и другим антимикробным пептидам (АМП) [35, 36]. S. mitis также могут модулировать экспрессию провоспалительного хемокина ИЛ-8 [37]. Исходя из этого, можно считать, что S. mitis в качестве полезного комменсала способны дополнять иммунитет хозяина, поддерживая тканевый гомеостаз.

Вирулентность Candida albicans выше в зрелых смешанных многовидовых биопленках, культивируемых на реконструированных эпителиальных клетках человека (RHOE), чем в одновидовых биопленках. При этом наблюдается повышение секреции ИЛ-18, активности лактатдегидрогеназы и инвазивности C. albicans. В ответ на инфицирование C. albicans эпителиальные клетки ПР продуцируют большие количества ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α. Это указывает на то, что цитокины играют значительную роль в контроле инфекций ПР [38, 39]. После контакта с Candida parapsilosis гингивальные эпителиальные клетки человека экспрессируют высокие уровни мРНК ТЛР-2, ТЛР-4, но не ТЛР-9. Повышенным уровнем цитокинов и АМП можно объяснить ингибирование роста C. parapsilosis на эпителиальных клетках десен [40, 41].

Таким образом, все эти исследования показали, что эпителиальные клетки по-разному реагируют на патогены и комменсалы. Точный механизм этих процессов не полностью понятен.

Известно, что образование биопленок вносит значительный вклад в формирование у бактерий резистентности к антибиотикам и факторам врожденного иммунитета организма хозяина [42, 43]. Механизмы устойчивости биопленок к защитным реакциям организма могут включать изменения в экспрессии генов, которые обеспечивают реактивность к химическим медиаторам. Так как биопленки более похожи на рост бактерий in vivo и участвуют в формировании инфекций, можно предположить, что они, но не планктонные клетки, должны были отвечать на цитокины.

Помимо разных видов бактерий, герпес-вирусы и дрожжевые грибы, обнаруживаемые в биопленках поддесневых областей, могут распознавать и связывать цитокины, вырабатываемые организмом хозяина [44].

Даже несмотря на то что в области изучения биопленок получены важные научные результаты, контроль биопленок остается все еще нерешенной проблемой и является центральным направлением современных исследований.

Таким образом, для системы врожденного иммунитета характерен дифференцированный цитокиновый ответ на бактерии ПР.

Значимость этих механизмов для широкой клинической практики определяет необходимость внедрения адекватных и надежных методов оценки компонентов систем ИЛ, дефензинов и их рецепторов, которые могут быть воспроизведены в условиях клинической лаборатории лечебно-профилактических учреждений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.