Введение

Аномальное маточное кровотечение наблюдается у 30% женщин репродуктивного периода [1].

Клиническими проявлениями гиперпластических процессов в эндометрии служат обильные менструации, межменструальные маточные кровотечения при регулярном цикле или олигоменорее [2]. Своевременная диагностика и адекватная терапия гиперплазии эндометрия без атипии, сопровождающейся аномальным маточным кровотечением и без него, являются актуальными [3]. Согласно клиническим рекомендациям Минздрава РФ «Гиперплазия эндометрия» 2021 г. и зарубежным исследованиям [4] после проведения гистероскопии, раздельного диагностического выскабливания слизистой оболочки матки с лечебной и диагностической целью и последующей морфологической верификации диагноза показана гормональная терапия в течение 6 мес.

Препаратами выбора являются прогестины: внутриматочные гормональные системы, инъекционные формы, а также пероральные препараты в непрерывном или циклическом режиме. При использовании прогестинов гиперплазия эндометрия без атипии (ГЭ), по данным разных авторов, происходит в 54,8—91,8% наблюдений [5—7].

Опубликовано большое количество работ, изучающих эффективность терапии при ГЭ различными видами гестагенов [4, 5, 8—10]. Многие из исследований включают группы женщин, смешанные по возрасту и менопаузальному статусу, а также в них отсутствует информация о восстановлении экспрессии рецепторов в соответствии с фазами менструального цикла.

Широкая вариабельность ответа на терапию диктует необходимость поиска маркеров оценки эффективности терапии [11].

Среди них авторы [12—16] рассматривают изменения молекулярно-генетических и белковых факторов, одними из которых являются индекс клеточной пролиферации Ki-67 и уровень экспрессии ядерных рецепторов к прогестерону PR — (PR-A и PR-B) и эстрогенам — ER (ERα и ERβ) в ткани эндометрия.

Сочетанное изучение рецепторного статуса и индекса клеточной пролиферации Ki-67 в ткани гиперплазированного эндометрия потенциально позволит определить превалирующие механизмы развития гиперплазии эндометрия и определить возможные причины резистентности к гормональной терапии. С целью повышения информативности данных маркеров целесообразно изучение исходных показателей до начала терапии, сравнение их с показателями после лечения и сопоставление с ответом на терапию.

Материал и методы

В исследование включены 78 пациенток репродуктивного периода с аномальными маточными кровотечениями. Возраст больных колебался от 27 до 45 лет, средний — 39±6,51 года. Длительные кровяные выделения из половых путей, возникшие после задержки менструации, были у 57 (73,08%), обильные менструации — у 14 (17,95%), межменструальные скудные кровяные выделения — у 7 (8,97%). У всех пациенток при патоморфологическом исследовании удаленной ткани эндометрия выявлена гиперплазия эндометрия без атипии, гормональную терапию норэтистерона ацетатом получали все пациентки в течение 6 мес.

Ретроспективно больные были разделены на две группы: с эффектом от лечения и без него. Эффективность терапии оценивалась на основании клинических, ультразвуковых данных и патоморфологического исследования аспирата эндометрия. В 1-ю группу вошли 62 (79,49%) пациентки с эффектом от терапии, у которых не было клинических и ультразвуковых критериев патологии эндометрия, по результатам патоморфологического исследования аспирата после лечения выявлен эндометрий без патологии в средней стадии пролиферации; 2-ю группу сформировали 16 (20,51%) пациенток с признаками патологии эндометрия, по данным ультразвукового исследования (УЗИ) органов малого таза и повторно выявленной ГЭ по результатам морфологического исследования аспирата эндометрия после лечения, что было расценено как отсутствие эффекта от терапии.

Контрольную группу составили 18 женщин без патологии эндометрия, которым была выполнена аспирационная биопсия эндометрия при обследовании по поводу бесплодия. Биоптат эндометрия был получен в середине фазы пролиферации. У всех пациенток отмечен регулярный менструальный цикл длительностью 28 дней, гормональные препараты женщины не получали (с контрацептивной и лечебной целью) последние 6 мес до обследования.

Критериями включения были возраст от 18 до 45 лет, наличие аномального маточного кровотечения, впервые выявленная гиперплазия эндометрия, по данным патоморфологического заключения.

Критерии исключения из исследования: кровотечения на фоне беременности и после родов, прием гормональных препаратов — эстроген-гестагены, гестагены, агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ), в течение 6 мес до включения в исследование; сопутствующая гинекологическая патология (миома матки при ее величине, соответствующей таковой при беременности более 6 нед), образования яичников), тяжелая экстрагенитальная патология, коагулопатии, атипическая гиперплазия эндометрия, по данным патоморфологического заключения.

Среди сопутствующей гинекологической патологии у 36 (35,9%) пациенток был выявлен аденомиоз, по данным УЗИ; у 23 (29,49%) — миома матки небольших размеров. В анамнезе у 4 (5,13%) пациенток была выполнена лапароскопия, цистэктомия: у 3 (3,85%) из них по поводу эндометриодных кист с дополнительной коагуляцией очагов наружнего эндометриоза, у 1 (1,28%) — по поводу простой серозной цистаденомы.

Экстрагенитальная патология была представлена у 15 (19,23%) пациенток гипертонической болезнью, у 7 (8,97%) — нарушением толерантности к глюкозе, у 6 (7,69%) — анемией легкой степени (максимальное снижение уровня гемоглобина до 93 г/л), у 23 (29,49%) — избыточной массы тела (индекс массы тела — ИМТ 25—30 кг/м²), у 19 (24,36%) — ожирением II—III степени (ИМТ кг/м² 35—40 и выше).

Всем пациенткам было проведено стандартное обследование, включая УЗИ органов малого таза (Voluson 730 Expert с трансвагинальным конвексным датчиком). Исходно средняя толщина эндометрия у пациенток составляла 10,2±0,4 мм в 1-й группе и 10,5±0,3 мм — во 2-й группе. Эндометрий был утолщен, на всем протяжении имел неравномерную эхоструктуру с фокусами кровотока с ИР 0,5.

Дополнительно всем пациенткам до начала лечения было выполнено исследование гормонального профиля (эстрадиол, прогестерон, ФСГ, ЛГ, пролактин).

На первом этапе всем пациенткам выполнены гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание (РДВ) слизистой оболочки матки по стандартной методике с последующей патоморфологической верификацией. При осмотре полости матки у всех пациенток был выявлен утолщенный эндометрий бледно-розового цвета в виде складок и/или определялись полиповидные образования небольших размеров. Патоморфологически верифицирована гиперплазия эндометрия без атипии.

На втором этапе проводили пероральную терапию прогестинами (норэтистерона ацетат) в дозировке 5 мг 2 раза в сутки с 5-го по 25-й день менструального цикла в течение 6 мес, дополнительно проводили антиагрегантную терапию ацетилсалициловой кислотой 50—100 мг/сут в зависимости от массы тела пациентки. При проведении гормональной терапии определялась переносимость препарата, побочные эффекты.

Через 3 мес после окончания лечения для оценки ответа на терапию у всех пациенток были проанализированы жалобы, характер менструального цикла, выполнено УЗИ органов малого таза, контрольная аспирационная биопсия эндометрия в средине фазы пролиферации с последующей патоморфологической верификацией.

Дополнительно до лечения и после него проведено иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) биоптатов эндометрия, взятых для патоморфологической оценки, у 46 пациенток (30 из 1-й группы, 16 из 2-й). В железистом и стромальном эндометриях определяли экспрессию ядерного рецептора к эстрадиолу (ERα), ядерных рецепторов к прогестерону (PR-A, PR-B) и индекс клеточной пролиферации Ki-67.

Патоморфологическую оценку удаленного эндометрия проводили по стандартной методике. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30 заливали в парафин в автоматической станции Leica EG 1150. Гистологические срезы толщиной 4 мм окрашивали гематоксилином и эозином в автоматической станции Leica EG 1150. Микроскопическое исследование осуществляли в триокулярном микроскопе Leica DMLB с использованием цифровой камеры Leica DFC 420. В полученных микропрепаратах проводили патоморфологическую оценку эндометрия возможной патологии эндометрия.

ИГХИ выполняли в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH с использованием антител VENTANA CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody, связывающихся с изоформами PR-A, PR-B, VENTANA CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ERΑ) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody, связывающихся с ERα, и VENTANA-антитела к Ki-67 — Rabbit Monoclonal, 30-9, клон MIB (антитела кроличьи моноклональные к маркеру клеточной пролиферации Ki-67). Микроскопическое исследование выполняли на триокулярном микроскопе Leica DMLB с использованием цифровой камеры Leica DFC 420.

Оценку иммуногистохимической реакции производили полуколичественным методом с использованием стандартного подхода: осуществляли подсчет числа клеток с положительной ядерной экспрессией на 100 клеток в 10 полях зрения при увеличении в 200 раз. Для каждого исследования подсчитывали процент ядер, окрашенных с различной степенью интенсивности.

Для анализа результатов иммуногистохимических реакций для ERα и PR использовали метод гистологической оценки по HSCORE по формуле: HSCORE = Σ (Pi×i), где Pi — процент окрашенных эпителиальных клеток для каждой интенсивности, варьирующий от 0 до 100%; i — интенсивность окрашивания со значением 1, 2 или 3 (слабая, умеренная или сильная соответственно). В заключении указывали степень экспрессии и баллы (таблица), оценивали соответствие уровня экспрессии в железах и строме фазе цикла. За положительную окраску Ki-67 принимали интенсивное окрашивание ядерных структур темно-коричневым цветом. Оценку экспрессии Ki-67 проводили методом подсчета количества окрашенных ядер на 100 клеток в трех полях зрения, результат выражали в процентах и оценивали по принятой шкале: 1) низкая пролиферативная активность — 0—20%; 2) умеренная пролиферативная активность — 21—50%; 3) высокая пролиферативная активность — 51—100%. Все исследования проводил один специалист-патолог.

Шкала оценки экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов (HSCORE)

Статистика. Статистическую обработку полученных данных выполняли с применением пакета статистических программ GraphPad Prism 9.3.0. Данные представлены с использованием стандартной описательной статистики χ-квадрат, а для сравнения категориальных и непрерывных переменных использовали двухвыборочные t-тесты; различия при p<0,05 считали достоверными. Обработку данных выполняли с использованием критерия Фишера и критерия U Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

Все обследованные пациентки (n=78), получавшие лечение норэтистерона ацетатом, отмечали хорошую переносимость препарата. Из нежелательных эффектов отмечались жалобы на прибавку массы тела (на 2—3 кг) у 35 (44,87%) пациенток, среди которых 18 (23,08%) связывали это с повышенным аппетитом, 27 (35,29%) — с отечностью, которая беспокоила пациенток в течение первых 1—2 циклов приема и самостоятельно нивелировалась к 3-му циклу приема. Средняя прибавка массы тела к 3-му месяцу терапии составила 2,32±0,4 кг, в связи с чем всем пациенткам была рекомендована модификация образа жизни, ограничение калорийности рациона, контроль массы тела. К окончанию терапии пациентки вернулись к исходной массе тела. У 7 (8,97%) пациенток в течение первого месяца приема отмечалась умеренная тошнота, которая купировалась самостоятельно и не требовала дополнительного лечения. Побочные эффекты не снижали приверженность к лечению, гормональная терапия была проведена в полном объеме у всех обследованных больных.

На фоне терапии все пациентки 1-й группы и 15 (93,75%) из 2-й группы отмечали уменьшение длительности и интенсивности менструальных выделений после 1—2 циклов терапии. В течение всего срока наблюдения после отмены препарата у них сохранялся регулярный менструальный цикл; 1 пациентка из 2-й группы отмечала нормализацию менструации к 4-му месяцу терапии. У пациенток из 2-й группы, отмечавших нормализацию менструальной функции на фоне терапии, цикл был регулярным в течение 2 мес после отмены лечения, однако в 3-м цикле вновь появились признаки аномального маточного кровотечения (обильные и длительные менструации).

При исходной сравнительной оценке гормонального профиля (эстрадиол, прогестерон, ФСГ, ЛГ, пролактин) и индекса массы тела различий между группами пациенток не выявлено (p≤0,05).

УЗИ органов малого таза проводили через 3 и 6 мес от начала лечения, а также через 3 мес по окончании терапии на 5—7-й день менструального цикла. У пациенток 1-й группы толщина и структура эндометрия при всех измерениях соответствовала дню менструального цикла, после 6 мес терапии составляла 5,0±0,4 мм, а через 3 мес по окончании терапии — 5,1±0,5 мм.

У пациенток 2-й группы после 6 мес лечения размеры М-эхо составляли 7,8±0,6 мм, после прекращения лечения при контрольном УЗИ через 3 мес на момент аспирации эндометрия толщина М-эхо составляла 9,5±0,6 мм. По данным УЗИ, эндометрий был утолщен на всем протяжении, неравномерной эхоструктуры с фокусами кровотока. Представленная динамика ультразвуковых критериев позволяла предположить патологию эндометрия, что подтверждает значение динамического ультразвукового наблюдения при проведении терапии у пациенток с ГЭ и после ее окончания [17].

По прошествии 3 мес после отмены гормонального лечения была выполнена аспирационная биопсия эндометрия с патоморфологической верификацией у всех 100% пациенток вне зависимости от клинических и ультразвуковых данных. У 62 (79,49%) пациенток аспират гистологически соответствовал календарной фазе менструального цикла (1-я группа больных), что мы интерпретировали как эффективность лечения. У 16 (20,51%) пациенток 2-й группы была вновь диагностирована ГЭ, по данным аспирата эндометрия, что было расценено как отсутствие эффекта терапии. Пациенткам 2-й группы повторно была выполнена гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание слизистой оболочки матки, гистологически диагноз гиперплазии без атипии был подтвержден. В последующем пациенткам было рекомендовано возобновить терапию норэтистерона ацетатом по 5 мг 2 раза в сутки в циклическом режиме длительно в течение года или применить внутриматочную систему с левоноргестрелом по выбору пациентки в зависимости от репродуктивных желаний женщины.

При ИГХИ биоптатов эндометрия экспрессия рецепторов ERα, PR-A, PR-B и индекса клеточной пролиферации Ki-67 различалась у пациенток 1-й и 2-й групп до лечения и после него в железистом и стромальном структурных компонентах эндометрия.

С целью сравнения и верной трактовки полученных результатов исследовали уровень экспрессии ERα, PR-A, PR-B и индекса клеточной пролиферации Ki-67 в контрольной группе (здоровые женщины).

При ИГХИ аспиратов эндометрия у пациенток 1-й и 2-й групп мы выявили положительную экспрессию ERα, PR-A, PR-B и индекса пролиферации Ki-67 в 100% исследуемых материалах. Однако выявлены различия в количестве положительно окрашенных клеток и интенсивности окрашивания, описанные ниже.

На рисунке (а) представлены данные экспрессии ERα в железистом и стромальном структурных компонентах эндометрия у пациенток с аномальным маточным кровотечением и гиперплазией эндометрия без атипии, ответивших на лечение и оставшихся без эффекта от терапии до лечения и после него, а также в контрольной группе.

Экспрессия ERα (а), ядерных рецепторов к прогестерону (б) и Ki-67 (в) в стромальном и железистом структурных компонентах эндометрия у пациенток репродуктивного возраста с аномальным маточным кровотечением и гиперплазией эндометрия без атипии.

Как видно из данных рисунка (а), в стромальном компоненте эндометрия мы выявили снижение экспрессии ERα у пациенток 1-й группы до лечения и 2-й группы до лечения и после него по сравнению с результатами контрольной группы. После лечения экспрессия данного рецептора была выше у пациенток 1-й группы по сравнению с показателями пациенток 2-й группы и не отличалась от показателей контрольной группы. В тканях желез эндометрия у пациенток 2-й группы отмечено стойкое снижение экспрессии ERα как по сравнению с таковым у здоровых женщин, так и у пациенток 1-й группы, которое не изменялось после прекращения лечения.

У пациенток 1-й группы, ответивших на лечение, в железистом компоненте эндометрия, исходно уровень экспрессии ERα был ниже показателей контрольной группы, после лечения возрастал до значений здоровых женщин.

Результаты анализа экспрессии ядерных рецепторов к прогестерону в стромальных и железистых структурных компонентах эндометрия у обследуемых пациенток отражены на рисунке (б). Согласно представленным данным в стромальном компоненте эндометрия до лечения экспрессия рецепторов к прогестерону в 1-й группе не отличалась, а во 2-й была ниже показателей здоровых женщин (см. рисунок б). При этом показатели экспрессии в 1-й группе были достоверно выше показателей 2-й группы. После лечения указанные различия сохранялись. Аналогичную картину мы наблюдаем и в железистом компоненте эндометрия.

Следовательно, исходно у пациенток, ответивших на терапию норэтистероном (больные 1-й группы), наблюдается снижение экспрессии рецепторов ERα в стромальном и железистом структурных компонентах эндометрия на фоне нормальных показателей экспрессии рецепторов к прогестерону. Это может свидетельствовать о том, что ведущей причиной развития гиперплазии без атипии у больных этой группы является не повышение чувствительности к эстрогенам, а недостаточность эндогенного гестагена, на фоне нормальных уровней прогестерона в крови у данных пациенток, что указали в своих работах и другие исследователи [13]. Полученные нами данные патогенетически объясняют эффективность терапии норэтистероном длительностью лечения 6 мес.

Эффективность подтверждена восстановлением менструального цикла, патоморфологической структуры здоровой ткани эндометрия и нормализацией рецепторного профиля как основной причины гиперплазии эндометрия без атипии у больных данной группы с ответом на лечение.

Пациентки, не ответившие на терапию, у которых была диагностирована гиперплазия эндометрия через 3 мес после отмены гормонального лечения, исходно имели более низкий уровень экспрессии рецепторов к эстрадиолу (ERα) и прогестерону (PRA, PRB) по сравнению с этим уровнем у здоровых женщин и с его показателями у пациенток 1-й группы. После окончания лечения эти изменения сохранялись, что свидетельствует о низкой чувствительности ткани к гормональным стимулам, в том числе гормональным препаратам. Для понимания других возможных причин развития гиперплазии эндометрия без атипии мы исследовали экспрессию индекса клеточной пролиферации Ki-67 в стромальном и железистом компонентах эндометрия. Данные представлены на рисунке (в).

Как видно из рисунка (в), уровень экспрессии индекса пролиферации Ki-67 у пациенток 1-й группы до лечения в стромальном компоненте эндометрия был ниже показателя пациенток 2-й группы (до лечения); в железистом — ниже показателя контрольной группы. Различия остальных параметров были недостоверны.

У больных 2-й группы, не ответивших на лечение, исходно более высокие показатели экспрессии Ki-67 в стромальном компоненте эндометрия и низкие показатели рецепторного профиля ткани эндометрия (рецепторы к эстрогенам и прогестерону) по сравнению с показателями 1-й группы пациенток косвенно могут указывать на другие механизмы развития гиперплазии эндометрия без атипии. Низкий уровень экспрессии рецепторов у больных этой группы может свидетельствовать о развитии независимости гиперплазированной ткани эндометрия без атипии от гормонального влияния. На этом фоне высокие показатели экспрессии Ki-67 могут свидетельствовать о бо́льшей роли в развитии гиперплазии без атипии у пациенток, не ответивших на лечение, нарушения соотношения внутриклеточных про- и антиапоптотических сигналов. Указанные изменения соответствуют нарушениям при атипической гиперплазии эндометрия [18—20]. У больных с исходно низким уровнем экспрессии рецепторов к эстрадиолу и прогестерону необходим дифференцированный подход к терапии — вероятно, более длительная гестагенная терапия с регулярным морфологическим контролем аспирата из полости матки.

Заключение

Таким образом, в удаленной ткани эндометрия помимо проведения гистологического исследования целесообразно определять иммуногистохимические маркеры, которые могут быть перспективными показателями для прогнозирования ответа на медикаментозное лечение ГЭ у пациенток репродуктивного возраста с АМК.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Л.М. Каппушева, Л.М. Михалева, В.Г. Бреусенко, Г.Н. Голухов

Сбор и обработка материала — К.В. Щербатюк, К.Ю. Мидибер, А.Е. Бирюков

Статистическая обработка — К.В. Щербатюк, А.В. Овчинникова

Написание текста — К.В. Щербатюк

Редактирование — Д.С. Гуторова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — L.M. Kappusheva, L.M. Mikhaleva, V.G. Breusenko, G.N. Golukhov

Data collection and processing — K.V. Shcherbatyuk, K.Yu. Midiber, A.E. Biryukov

Statistical processing of the data — K.V. Shcherbatyuk, A.V. Ovchinnikova

Text writing — K.V. Shcherbatyuk

Editing — D.S. Gutorova

Authors declare lack of the conflicts of interests.