Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Красильникова А.К.

ФГБУ "Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова" Минздрава России

Малышкина А.И.

ФГБУ "Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова" Минздрава России

Сотникова Н.Ю.

ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России

Анциферова Ю.С.

ФГБУ "Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова" Минздрава России

Особенности функционального состояния фагоцитов крови у пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием

Авторы:

Красильникова А.К., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С.

Подробнее об авторах

Журнал: Российский вестник акушера-гинеколога. 2017;17(3): 9‑14

Просмотров: 276

Загрузок: 2

Как цитировать:

Красильникова А.К., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С. Особенности функционального состояния фагоцитов крови у пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием. Российский вестник акушера-гинеколога. 2017;17(3):9‑14.
Krasil'nikova AK, Malyshkina AI, Sotnikova NYu, Antsiferova IuS. The functional state of phagocytes in patients with Stage I-II endometriosis and infertility. Russian Bulletin of Obstetrician-Gynecologist. 2017;17(3):9‑14. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/rosakush20171739-14

?>

В последние годы эндометриоз рассматривают как одну из ведущих причин развития бесплодия у женщин. Распространенность эндометриоза в популяции фертильных женщин составляет 0,5—10%, тогда как у женщин с бесплодием эндометриоз диагностируют, по данным разных авторов, в 25—50% наблюдений [1, 2]. Особого внимания заслуживает вопрос о механизмах развития бесплодия у пациенток с так называемыми малыми формами эндометриоза, поскольку при I—II стадии заболевания отсутствуют выраженные анатомические изменения, которые могут негативно влиять на фертильность женщин. В то же время при проведении диагностической лапароскопии у пациенток с бесплодием чаще выявляются именно малые формы эндометриоза [2]. До сих пор остается открытым вопрос о тактике ведения пациенток с бесплодием при малых формах эндометриоза. Доказано, что гормональное лечение не дает положительного эффекта в отношении фертильности пациенток с эндометриозом [1]. Хирургическое удаление очагов эндометриоза по-прежнему считается «золотым стандартом» при лечении всех стадий эндометриоза и связанного с ним бесплодия. При этом частота спонтанного наступления беременности после проведения лапароскопии у пациенток с малыми формами эндометриоза до сих пор остается невысокой и составляет, по данным разных авторов [3], 20—36%. В связи с этим некоторые авторы рекомендуют после лапароскопии проводить пациенткам с эндометриозом I—II стадии контролируемую стимуляцию яичников с последующей внутриматочной инсеминацией, а в отсутствие эффекта от лечения ориентировать женщин на проведение экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [1]. Однако многие исследователи [2] отмечают сравнительно невысокую эффективность процедуры ЭКО у пациенток с эндометриозом (30—38%). В последнее время появились сообщения о высоком риске повторного развития эндометриоза после проведения ЭКО, что связывают с высокими дозами эстрадиола, которые женщина получает при проведении стимуляции суперовуляции [2]. Таким образом, мы вынуждены констатировать, что до сих пор отсутствуют эффективные методы лечения пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием. Во многом это связано с отсутствием полного понимания механизмов, определяющих нарушение фертильности у этих пациенток.

Предполагают, что развитие бесплодия при эндометриозе может быть обусловлено рядом причин: 1) нарушением процесса фолликулогенеза, что обусловливает низкое качество яйцеклеток и эмбрионов; 2) нарушением транспорта яйцеклетки; 3) угнетением рецептивности эндометрия, что негативно влияет на имплантацию эмбриона; 4) изменением перитонеального микроокружения [4]. Кроме того, важную роль в развитии как самих эндометриоидных очагов, так и в нарушении фертильности у пациенток с эндометриозом отводят иммунным нарушениям [5]. Установлено, что при эндометриозе в перитонеальной полости повышено содержание макрофагов, активно продуцирующих многочисленные провоспалительные цитокины (IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IL-33, TNFα, MCP-1, MIF) и факторы роста (EGF, FGF, IGF, PDGF) [5], а это ведет к развитию локального воспаления и формированию условий, способствующих эктопическому росту эндометрия. В экспериментах in vitro было продемонстрировано прямое эмбриотоксическое действие цитокинов перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом, что свидетельствует о взаимосвязи между локальным воспалением и развитием бесплодия при эндометриозе [6, 7]. В то же время у пациенток с эндометриозом было отмечено наличие маркеров не только локального, но и системного воспаления [8]. Но до сих пор при эндометриозе остается мало изученным функциональное состояние фагоцитов периферической крови, которые являются основными эффекторными клетками воспалительной реакции.

Как известно, триггерами воспаления чаще всего являются бактериальные эндотоксины, взаимодействие которых с паттерн-распознающими рецепторами (PRR) фагоцитов запускает в клетке синтез и секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов, индуцируя таким образом развитие воспалительной реакции [9]. В настоящее время нет единого мнения о роли инфекционного фактора в развитии эндометриоза. Были получены экспериментальные данные о том, что у макак с эндометриозом изменен состав кишечной микрофлоры, при этом значительно снижена концентрация лактобактерий, но повышено количество грамотрицательных бактерий [10]. При культивировании менструальной крови пациенток с эндометриозом выявлено усиленное образование колоний Escherichia coli, а в самой менструальной крови и в перитонеальной жидкости обнаружено повышенное содержание бактериального эндотоксина [11]. В содержимом овариальных эндометриоидных кист были выявлены признаки субклинического инфицирования и установлено присутствие стрептококков, стафилококков и энтеробактерий [12]. Проспективное национальное когортное исследование на Тайване [13], в котором участвовали 79 512 пациенток, показало, что среди пациенток с воспалительными заболеваниями цервикса, вагины или вульвы число женщин с эндометриозом было достоверно больше, чем в контрольной группе, при этом наличие инфекций генитального тракта в 2 раза повышало риск развития эндометриоза. Однако прямых доказательств участия инфекционных агентов в активации клеток фагоцитарного ряда при эндометриозе и связанном с ним бесплодии в проведенных исследованиях получено не было.

Цель настоящего исследования — выявление особенностей экспрессии специфических паттерн-распознающих рецепторов, а также костимулирующих молекул​*​ фагоцитарными клетками периферической крови у пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием, а также оценка взаимосвязи активности системных реакций врожденного иммунитета и наличия маркеров бактериально-вирусной инфекции при эндометриозе и связанном с ним бесплодии.

Материал и методы

Исследование проводилось на базе эндоскопического отделения ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова». Всего были обследованы 178 пациенток, поступивших на оперативное лечение по поводу бесплодия. Всем пациенткам была произведена лапароскопия с деструкцией очагов эндометриоза. В ходе лапароскопии у 115 женщин был диагностирован эндометриоз I—II стадии (основная группа), у 63 женщин — эндометриоз III—IV стадии по классификации ASF (группа сравнения). Контрольную группу составили 33 практически здоровые фертильные женщины, которые не имели гинекологической патологии на момент обследования и поступили на хирургическую стерилизацию по социальным показаниям.

Обследование проводилось однократно при поступлении в стационар. Материалом для исследования служила гепаринизированная периферическая венозная кровь. Выделение популяций мононуклеарных клеток (МНК) и нейтрофилов из крови проводили с использованием стандартной процедуры центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078 и d=1,114). Экспрессию паттерн-распознающих рецепторов TLR2, CD36, CD204 и костимуляторных молекул CD86 на мембранах моноцитов и нейтрофилов оценивали с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScanto II. В исследовании использовали следующие мАТ: конъюгированные с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) анти-TLR2- и анти-CD36-антитела, конъюгированные с фикоэритрином (РЕ) анти-CD204-, анти-CD86- и анти-CD14-антитела. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Анализ результатов проводили в программе FACSDiva. Анализировали клетки в моноцитарном и нейтрофильном гейтах, которые устанавливали на точечных графиках распределения событий в координатах FSC/SSC. Кроме того, в сыворотке крови определяли наличие антител (IgM, IgA, IgG) к возбудителям бактериально-вирусных инфекций (ВПГ, ЦМВ, вирусу Эпштейна—Барр (ВЭБ), Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Toxoplasma gondii) методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем производства «Вектор-Бест».

Полученные результаты представлены в виде среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Проверка рядов на нормальность распределения выявила, что распределение полученных значений подчинялось нормальному, поэтому статистический анализ данных осуществлялся по общепринятым методам вариационной статистики с оценкой достоверности различий между показателями независимых выборок по t-критерию Стъюдента.

Результаты и обсуждение

Возраст обследованных пациенток колебался от 24 до 36 лет и не различался в группах. Репродуктивная функция была реализована у 100% женщин контрольной группы. Роды в анамнезе были у 18% женщин с эндометриозом I—II стадии и у 15% пациенток с эндометриозом III—IV стадии (р>0,05). У всех пациенток с эндометриозом на момент обследования было диагностировано бесплодие, при этом первичное бесплодие отмечалось у 55,5% женщин с эндометриозом I—II стадии и у 69% женщин с эндометриозом III—IV стадии (р>0,05). Вторичное бесплодие было отмечено в 44,5 и 31% наблюдений соответственно в группах (р>0,05). Оценка инфекционного статуса пациенток показала, что распространенность маркеров острой и хронической вирусной и бактериальной инфекции у женщин с эндометриозом III—IV стадии не отличалась от соответствующих показателей в контрольной группе. Только у пациенток с эндометриозом I—II стадии нами был выявлен ряд отличий. Так, в этой группе, по нашим данным, достоверно чаще, чем в контрольной группе, отмечалось наличие EA-IgG-антител к ВЭБ (65 и 28,5% соответственно; p<0,02) и IgA-антител к хламидии трахоматис (11% и 0 соответственно; p<0,01). Кроме того, у пациенток с эндометриозом I—II стадии чаще, чем при эндометриозе III—IV стадии, встречались IgA-антитела к Ureaplasma urealyticum (21,5% и 0 соответственно; p<0,001). Таким образом, у пациенток с малыми формами эндометриоза обнаруживалась повышенная частота выявления маркеров острого вирусного и бактериального инфицирования, что отличало их как от контрольной группы, так и от группы пациенток с распространенными формами эндометриоза.

Для оценки уровня активации фагоцитов периферической крови при эндометриозе определяли экспрессию моноцитами и нейтрофилами PRR, относящимися к классу Toll-подобных рецепторов (TLR2-молекулы) и к классу «рецепторов-мусорщиков» — (SR-A (CD204) молекулы и SR-B (CD36) молекулы. Кроме того, оценивали экспрессию фагоцитами молекул CD86, относящихся к семейству B7-молекул и выполняющих костимуляторные функции, участвуя в проведении активирующего сигнала от фагоцитов к лимфоцитам и способствуя, таким образом, активации реакций адаптивного иммунитета [14]. Анализ данных показал, что у женщин с эндометриозом как I—II, так и III—IV стадий было достоверно снижено по сравнению с показателями в контрольной группе содержание моноцитов CD36+ и CD204+ (p=0,000 во всех случаях) и нейтрофилов CD204+ (р=0,05 и р=0,025 соответственно) (см. таблицу). Достоверных различий между группами пациенток с эндометриозом различной степени тяжести при этом мы не выявили. Отличительной характеристикой пациенток с малыми формами эндометриоза было высокое содержание моноцитов TLR2+ и нейтрофилов CD86+, которое превышало аналогичные показатели как в контрольной группе (p=0,040 и р=0,001 соответственно), так и в группе с эндометриозом III—IV стадии (р=0,005; р=0,046, соответственно).

Характеристика экспрессии на мембранах PRR и молекул CD86 моноцитами и нейтрофилами периферической крови (в %) у пациенток с эндометриозом Примечание. р1 — по сравнению с показателями контрольной группы; р2 — по сравнению с показателями группы с эндометриозом III—IV стадии.

Таким образом, у всех пациенток с эндометриозом вне зависимости от степени его тяжести было выявлено угнетение экспрессии «рецепторов-мусорщиков» фагоцитами крови. Причем снижение экспрессии молекул CD36 было выявлено только в популяции моноцитов, тогда как угнетение экспрессии молекул CD204 отмечалось как в популяции моноцитов, так и в популяции нейтрофилов. Изначально этот класс рецепторов фагоцитов был идентифицирован на основании их способности связывать модифицированные липопротеины низкой плотности, что свидетельствовало об участии этих молекул в развитии атеросклероза [15]. Дальнейшие исследования показали, что «рецепторы-мусорщики» вовлекаются также в развитие воспалительных реакций, в регуляцию иммунного ответа при различных хронических заболеваниях, сахарном диабете и канцерогенезе [15]. По данным литературы [15], лигандами​*​ молекул CD36, относящихся к классу В «рецепторов-мусорщиков», являются тромбоспондин-1, жирные кислоты, модифицированные липидные частицы, апоптотические клетки, бактериальные и грибковые агенты. Молекулы CD204, относящиеся к A классу «рецепторов-мусорщиков», участвуют в распознавании фагоцитами липопротеинов низкой плотности, апоптотических клеток, β-амилоидного пептида, фосфолипидов [15]. Эти рецепторы вовлекаются также в развитие как адаптивного, так и врожденного иммунного ответа вследствие распознавания различных грамотрицательных и грамположительных патогенных агентов [18]. Основной функцией «рецепторов-мусорщиков» является удаление клеточных остатков и погибающих клеток. Ранее мы выявили сниженную экспрессию молекул CD36 и CD204 перитонеальными макрофагами пациенток с эндометриозом [16]. При этом в эксперименте in vitro было установлено, что сниженная экспрессия «рецепторов-мусорщиков» приводит к нарушению ответа перитонеальных макрофагов пациенток с эндометриозом на стимуляцию клетками эутопического эндометрия [16]. Эти данные позволили предположить, что низкий уровень экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами может приводить к угнетению своевременного клиренса макрофагами эндометриальных клеток из перитонеальной полости, способствуя, таким образом, формированию и росту очагов эндометриоза [16]. Поскольку перитонеальные макрофаги формируются из пула моноцитов крови, то, по-видимому, низкий уровень экспрессии «рецепторов-мусорщиков» макрофагами определяется изначально нарушенной экспрессией этих рецепторов моноцитами. Таким образом, выявленное нами угнетение экспрессии молекул CD36 и CD204 моноцитами пациенток с эндометриозом различной степени тяжести можно рассматривать в качестве одного из факторов, ассоциированных с иммунными механизмами развития эндометриоидных гетеротопий.

Ряд иммунологических изменений был отмечен нами только у пациенток с бесплодием и эндометриозом I—II стадии. Для них было характерно высокое содержание моноцитов TLR2+ и нейтрофилов CD86+, что свидетельствует о более выраженном проявлении системного воспаления в этой клинической группе. Высокий уровень TLR2-позитивных моноцитов можно связать c выявленной нами повышенной распространенностью маркеров острого вирусного и бактериального инфицирования у пациенток данной клинической группы. Как известно, TLRs вовлекаются в ответ на различные экзогенные патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (РАМР), а также отвечают на широкий спектр эндогенных молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMP) [9]. Рядом исследователей было высказано предположение, что инфекционный фактор можно рассматривать в качестве триггера эндометриоза, поскольку первоначальная активация PRR различными микробными агентами приводит к активации врожденного иммунитета и развитию воспаления. DAMP-опосредованные сигналы, такие, например, как усиленное поступление железа при ретроградной менструации, лежат, по мнению этих авторов [9], в основе развития второй волны стерильного воспаления, способствующего прогрессии эндометриоза. Выявленное нами высокое содержание моноцитов TLR2+ при эндометриозе I—II стадии и повышение распространенности в этой группе маркеров острого вирусного и бактериального инфицирования хорошо согласуется с гипотезой о роли инфекционного фактора как триггера эндометриоза. В то же время усиление экспрессии молекул TLR2 в ответ на инфекционный стимул может быть связано с развитием бесплодия у пациенток с эндометриозом I—II стадии. Известно, что инфекционный фактор является одной из важных причин нарушения фертильности, а активированные фагоциты продуцируют различные провоспалительные цитокины, способные оказывать негативное влияние на репродуктивную функцию женщин.

Для уточнения взаимосвязи между иммунными нарушениями и инфицированием пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием был проведен дифференцированный анализ иммунологических показателей у женщин в зависимости от наличия или отсутствия у них маркеров острого вирусного инфицирования (IgM-антител к ВПГ, ЦМВ и ВЭБ), острого бактериального инфицирования (IgA антител к Ch. trachomatis, Ureaplasma urealyticum, M. hominis) и хронического бактериального инфицирования (IgG антител к вышеперечисленным бактериальным инфекциям). Проведенный анализ не выявил различий в экспрессии «рецепторов-мусорщиков» у пациенток в зависимости от наличия или отсутствия маркеров инфицирования. У пациенток этой группы отмечался стабильно низкий уровень экспрессии этих рецепторов, что еще раз подтверждает наше предположение о вовлечении рецепторов в механизмы развития эндометриоза, а не связанного с ним бесплодия. Однако ряд показателей различался в подгруппах с инфекцией и без нее. Так, содержание нейтрофилов TLR2+ у пациенток с эндометриозом I—II стадии, имеющих маркеры острой вирусной инфекции, было достоверно выше аналогичного показателя в подгруппе без маркеров вирусного инфицирования (78,70±1,61 и 72,58±1,72% соответственно; р=0,011). Таким образом, экспрессия молекул TLR2 при малых формах эндометриоза зависит от наличия инфекционного фактора, в частности, от наличия маркеров вирусной инфекции. По нашим данным, только у пациенток этой группы достоверно более часто выявлялись антитела IgG к раннему антигену вируса Эпштейна—Барр (EA-IgG). Как известно, наличие этих антител свидетельствует об активной фазе ВЭБ-инфекции, так как EA-IgG обнаруживаются в крови в сроки от нескольких недель до года после инфицирования; кроме того, концентрация этих антител быстро увеличивается при реактивации инфекции [17]. Поэтому ВЭБ-инфекция может быть одним из факторов, которые, с одной стороны, активируют фагоцитоз крови, а с другой, способствуют развитию бесплодия у пациенток с эндометриозом I—II стадии. Негативная роль вирусов герпетической группы, в которую входит ВЭБ, в нарушении различных этапов репродуктивных процессов в настоящее время считается полностью доказанной [18, 19].

Нами также была выявлена зависимость между экспрессией молекул CD86 моноцитами и наличием маркеров вирусного и бактериального инфицирования. Так, содержание моноцитов CD86+ у пациенток с эндометриозом I—II стадии, имеющих в крови маркеры острого вирусного инфицирования и хронической бактериальной инфекции, было достоверно повышено по сравнению с таковым у пациенток без этих маркеров (см. рисунок). При этом в подгруппах женщин с маркерами острой бактериальной инфекции и без нее достоверных различий в содержании CD86+ моноцитов мы не выявили. Как известно, костимулирующие молекулы CD86 взаимодействуют со своим лигандом CD28 на поверхности лимфоцитов, активируя, таким образом, реакции адаптивного иммунитета и индуцируя развитие преимущественно Th2-типа иммунного ответа [20]. Таким образом, вирусное и бактериальное инфицирование, по-видимому, не только вызывает усиленную активацию моноцитов у пациенток с эндометриозом I—II стадии, но и гуморальный иммунный ответ и усиленную выработку антител. Несбалансированная активация гуморальных реакций в свою очередь может быть причиной выработки аутоантител, которые выявляются у пациенток с эндометриозом I—II стадии и, предположительно, участвуют в развитии бесплодия [21].

Изменение относительного содержания моноцитов CD86+ у пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием в зависимости от наличия маркеров вирусного и бактериального инфицирования.

Выводы

1. Экспрессия паттерн-распознающих рецепторов TLR2, SR-А, SR-B и костимулирующих молекул фагоцитами крови изменяется при эндометриозе I—II стадии, и эти изменения могут быть связаны как с иммунными нарушениями, участвующими в развитии эндометриоидных очагов, так и с особенностями инфицирования пациенток.

2. Низкий уровень экспрессии «рецепторов-мусорщиков» SR-A (CD204) и SR-B (CD36), отмечаемый при эндометриозе различной степени тяжести, вероятно, в большей степени ассоциирован с иммунными механизмами развития эндометриоза. Так как «рецепторы-мусорщики» участвуют в удалении клеточных остатков, то низкий уровень их экспрессии на моноцитах может приводить к формированию неполноценного пула перитонеальных макрофагов, образующихся из циркулирующих моноцитов. В свою очередь неспособность перитонеальных макрофагов своевременно элиминировать из перитонеальной полости остатки клеток, в том числе фрагменты эндометрия во время менструации, является одним из важных факторов, способствующих формированию эндометриоидных очагов.

3. Особенности экспрессии ряда таких рецепторов, как молекулы CD86 и TLR2, по нашим данным, в большей степени связаны с инфекционным статусом пациенток и могут определяться повышенной частотой острого вирусного и хронического бактериального инфицирования при эндометриозе I—II стадии. Предположительно нарушения экспрессии CD86 и TLR2 ассоциированы с развитием бесплодия при малых формах эндометриоза.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*Кофакторы, молекулы, участвующие в передаче активных сигналов от фагоцитов к лимфоцитам.

*От лат. ligo — связываю; нейтральные молекулы, ионы или радикалы, связанные с центральным атомом комплексного соединения.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail