Преждевременные роды остаются одной из важных проблем современного акушерства, так как связаны с высокими показателями перинатальной заболеваемости и смертности [1, 2]. Они являются следствием развития комплекса нарушений как у матери, так и плода, в возникновении которых играют роль многие известные факторы [3, 4]. Однако точные причины, приводящие к преждевременным родам, остаются до конца не выясненными. В определенной мере это связано с тем, что, несмотря на весьма большое количество исследований, посвященных преждевременным родам, вопросы метаболических и особенно молекулярных нарушений, возможно, являющихся пусковыми механизмами формирования данной патологии, недостаточно изучены. Это затрудняет своевременное прогнозирование преждевременного прерывания беременности и обусловливает необходимость поиска новых маркеров его угрозы.

Значительные успехи молекулярной медицины, достигнутые в последнее время с использованием современных методов постгеномных технологий, позволили по-новому взглянуть на проблему возникновения осложнений беременности и обеспечить возможность их ранней диагностики. К числу таких технологий относятся протеомные исследования, представляющие собой качественно новый этап в развитии системного анализа белковых молекул [5]. Применение протеомного анализа инициирует существенный прогресс в выяснении ранее неизвестных механизмов нарушения молекулярно-клеточных процессов, обеспечивающих развитие беременности, и позволяет научно обосновать представления о значении конкретных белковых субстанций в качестве биомаркеров как физиологического, так и патологического течения беременности.

С учетом ведущей роли белков во всех клеточных реакциях организма, а также новизны и высокоинформативного характера протеомных технологий, было проведено изучение протеомного профиля сыворотки крови беременных женщин с целью выявления белков-маркеров угрожающих преждевременных родов и уточнения молекулярных механизмов этой акушерской патологии.

В исследование вошли женщины в возрасте от 24 до 32 лет (в среднем 27,5 года), у 13 из которых (контрольная группа) беременность протекала без осложнений и закончилась своевременными родами (38—40 нед), у 14 женщин в 34—37 нед наступили поздние преждевременные роды (основная группа).

Пациентки наблюдались в женской консультации по месту жительства и в консультативной поликлинике Ростовского научно-исследовательского института акушерства и педиатрии. Все они дали информированное согласие на проведение расширенного алгоритма обследования, одобренного локальным этическим комитетом института. По возрасту, индексу массы тела, паритету беременности и родов, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу обследуемые группы беременных были сопоставимы. В обеих группах преобладали первородящие женщины: в основной группе они составили 64,2%, в контрольной — 61,5%. В анамнезе прерывание беременности по желанию женщин было в 21,4 и 23,0% случаев соответственно в основной и контрольной группах. Самопроизвольные выкидыши у женщин обследованных групп отсутствовали. Из исследования исключались пациентки с хроническими инфекциями, декомпенсированными формами соматических заболеваний, истмико-цервикальной недостаточностью функционального и травматического характера, признаками плацентарной недостаточности и преэклампсии.

Пациентки основной группы в 16—17 нед беременности были госпитализированы в отделение патологии беременных. Показанием к госпитализации явились кровянистые выделения из половых путей, подтвержденные наличием отслойки плаценты или ретрохориальной гематомы по данным УЗИ. В условиях отделения патологии беременных всем женщинам проводились комплексное клинико-лабораторное обследование, включающее оценку гормонального и иммунного статуса, ультразвуковые, допплерометрические исследования, а также терапия угрозы прерывания беременности на основании Федеральных стандартов и Порядка оказания медицинской помощи по профилю «Акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)» (Приказ № 572Н от 12.11.12). Комплекс терапии включал антифибринолитические препараты, гестагены, после остановки кровотечения — токолитические средства (селективные β2-адреномиметики, магния сульфат), глюкокортикоиды, предупреждающие развитие респираторного дистресс-синдрома новорожденного, и другие индивидуально подобранные медикаментозные препараты в зависимости от причины недонашивания беременности. Все пациентки из стационара выписаны с прогрессирующей беременностью в удовлетворительном состоянии под наблюдение врача женской консультации по месту жительства.

При начале родовой деятельности пациентки обеих групп поступали в родильное отделение института.

Материалом для настоящего исследования служила сыворотка крови. В контрольной группе женщин кровь во II триместре (16—17 нед беременности) брали при плановом обращении в консультативную поликлинику института, в основной группе — в аналогичные сроки в отделении патологии беременных. Образцы сыворотки крови предварительно фракционировали, используя наборы специальных магнитных микрочастиц по методике производителя. Профилирование протеома (совокупности белков) сыворотки крови проводили на времяпролетном тандемном MALDI — масс-спектрометре. Масс-спектрометрические данные анализировали с помощью программ FlexАnalysis 3.0 и ClinPro Tools 2.1, идентификацию достоверно отличающихся пиков осуществляли с использованием программ BioTools и Mascot Search. Поиск проводили в базе данных UniProt, допуская возможность модификации цистеина акриламидом и окисление метионина. Достоверность идентификации рассчитывали по покрытию аминокислотной последовательности белка совпадающими пептидами. Спектры для каждой пробы были сняты в трех повторностях для получения воспроизводимых результатов. Для калибровки использовали внешние стандарты, содержащие смесь белков и пептидов в диапазоне масс 1—17 кДа.

Статистический анализ проводили с помощью непараметрического критерия χ2 (программа Statistica 6.0) и четырехпольных таблиц сопряженности качественных признаков. Межгрупповые различия оценивали как статистически значимые при р<0,05.

Сопоставление масс-спектрометрических профилей сыворотки крови (полученных после фракционирования на магнитных частицах MB-WCX) пациенток контрольной и основной групп выявило значительные качественные различия между ними (см. таблицу).

Среди белков отличия со сниженной или повышенной экспрессией у пациенток основной группы по сравнению с контрольной идентифицированы шапероны (белки, участвующие в восстановлении правильной структуры полипептидной цепи), антиоксиданты, молекулы клеточной адгезии, компоненты цитоскелета, а также белки, связанные с процессами транскрипции, ангиогенеза, протеолиза, воспаления. В числе белков, продукция которых в тканях и секреция в кровь у женщин основной группы снижена, важную роль в регуляторных процессах играют пероксиредоксины (2 и 3), гельзолин, трансгелин-2, Е-кадгерин, эндоплазмин, белок теплового шока 8 (Hsp8), сосудисто-эндотелиальный фактор роста, А (СЭФР-А), супероксиддисмутаза 1, Янус-киназа 2, плацентарный транспортер фолатов.

Возможный вклад динамики указанных протеинов в развитие преждевременного развязывания родовой деятельности определяется их основными функциями. Так, цитоскелетные кальций-регулируемые актин-связывающие белки гельзолин и трансгелин-2 участвуют в регуляции мышечного сокращения [6, 7] и подавление их продукции способно опосредованно повышать контрактильную активность матки. Уменьшение содержания Е-кадгерина, участвующего в Са2±зависимой межклеточной адгезии и играющего важную роль в формировании цитоскелета, по-видимому, может сопровождаться модификацией структуры и, следовательно, функций различных тканей, в том числе миометрия.

Антиоксидантные ферменты пероксиредоксины 2 и 3 эффективно нейтрализуют перекись водорода, органические гидропероксиды, пероксинитрит, тем самым поддерживая физиологический баланс в про- и антиоксидантной системах. Снижение их экспрессии нарушает этот баланс, что приводит к усилению свободнорадикальных процессов, окислительному стрессу и развитию внутриутробной гипоксии. Аналогичное влияние оказывает также уменьшение продукции супероксиддисмутазы. В свою очередь усиление свободнорадикальных реакций, процессов перекисного окисления липидов повышает активность фосфолипазы А2, катализирующей каскад арахидоновой кислоты и, в конечном итоге, ускоряет синтез простагландинов, принимающих непосредственное участие в регуляции родовой деятельности [8].

В нарушении различных звеньев метаболических процессов у женщин основной группы определенное значение имеет снижение экспрессии шаперонов — эндоплазмина и белка теплового шока 8 (Hsp8), приводящее к накоплению неправильно свернутых белков. Многофункциональную роль играет идентифицированный белок отличия Янус-киназа 2, относящийся к семейству цитоплазматических тирозинкиназ. Он является компонентом различных сигнальных путей, которые регулируют пролиферацию, дифференцировку клеток, апоптоз, фосфорилирование рецепторов цитокинов и факторов роста [9]. Кроме того, Янус-киназа 2 способна фосфорилировать молекулы белков, известных под общим названием «белки STAT», индуцирующих транскрипцию тех или иных генов. Исследование гена V617 °F Янус-киназы 2 показало, что его соматическая мутация в значительной степени ассоциирована с потерей плода [10]. Перечисленные функции этого белка свидетельствуют о выраженном негативном влиянии снижения его содержания.

Обнаруженное нами падение экспрессии плацентарного транспортера фолатов не обеспечивает возрастающих потребностей плода в фолиевой кислоте по мере развития беременности, что нарушает его «безопасное» внутриутробное существование и может ускорить подачу плодом сигнала к инициации родов [11]. Еще один белок с гипоэкспрессией — аполипопротеин А-IV служит основным структурным компонентом липопротеинов высокой плотности и активатором ферментов, участвующих в метаболизме этих соединений. Кроме того, он обладает антиоксидaнтной активностью, ингибирует перекисное окисление липидов, поэтому уменьшение его продукции также нарушает необходимый для нормального течения беременности баланс про- и антиоксидантов [12]. Уменьшение у женщин основной группы сывороточного содержания СЭФР-А, играющего активную роль в процессах ангиогенеза, плацентации, регуляции сосудистой проницаемости, в числе многих последствий такого изменения модифицирует плацентарную гемодинамику и может быть одной из причин преждевременного прерывания беременности.

Угроза преждевременных родов сопровождается также усиленной экспрессией ряда белков. К их числу относится представитель семейства ингибиторов сериновых протеиназ — фактор дифференцировки пигментного эпителия (в международной базе данных обозначается как РЕDF). Это одно из антипролиферативных и ангиогенных соединений, реализующих свое действие через индукцию Fas-опосредованного апоптоза клеток развивающихся сосудов, а также путем ингибирования эффекта ангиогенных факторов, в том числе СЭФР-А [13]. Причем в ряде случаев его воздействия связаны с активацией транскрипционного фактора NF-κB.

Повышенная продукция характерна и для транскрипционного фактора S-II, который стимулирует РНК-полимеразу II и играет важную роль в процессах элонгации (2-й этап синтеза мРНК и белков). Нарушение адекватной продукции этого белка модулирует экспрессию генов рибосомальных белков [14, 15]. Рибосомальный белок S6-киназа альфа-3 (РСК), увеличение экспрессии которого обнаружено у женщин основной группы, является серинтирозиновой киназой, регулирующей такие различные клеточные процессы, как рост клеток, пролиферация, апоптоз, цитокинез и участвующей в осуществлении сигнального каскада митогенактивированных протеинкиназ (МАПК) [16]. В свою очередь передача сигнала с участием МАПК играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Изменение экспрессии РСК, вызывающее дисбаланс указанных процессов, также нарушает течение молекулярно-клеточных реакций в системе мать—плацента—плод и, следовательно, развитие нормальной беременности.

В настоящее время не вызывает сомнения участие в регуляции родовой деятельности интерлейкинов, среди которых наиболее изучены эффекты провоспалительных ИЛ-1 и ИЛ-6. Установленное нами увеличение экспрессии ИЛ-6, усиливающего синтез простагландинов в плаценте и плодных оболочках [17], может быть еще одной причиной, приводящей к развитию преждевременных родов.

Росту уровня простагландинов способствует и гиперэкспрессия белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 1-го типа (ИПФРСБ-1). Это объясняется тем, что указанный белок уменьшает фонд свободного ИПФР-1, который стимулирует выработку простагландинов F2α [18], и его снижение будет оказывать противоположное действие на продукцию простагландинов.

Что касается бикунина — трансмембранного гликопротеина, члена семейства сериновых протеиназ [19], то он, как и ряд других ранее описанных белков, модулирует пролиферацию и инвазию, т. е. процессы, интенсивно протекающие в фетоплацентарном комплексе. Помимо этого, ему принадлежит важная роль в ингибировании продукции системных цитокинов и простагландинов амниотическими клетками, а также в подавлении сокращения матки за счет снижения притока кальция в клетки миометрия [20]. Поэтому повышение экспрессии бикунина у женщин основной группы явилось несколько неожиданным и, очевидно, может рассматриваться как эндогенный компенсаторный механизм, направленный на пролонгирование беременности, не достигнувший, однако, своей цели.

Как видно из представленного материала, идентифицированные белки отличия выполняют функции, во многом связанные с регуляцией биохимических путей инициации спонтанной родовой деятельности в результате усиления синтеза простагландинов, а также изменений плацентарной гемодинамики, контрактильной активности матки, нарушения структуры тканей, в том числе соединительной. Последнее может сопровождаться изменением структуры шейки матки.

Анализируя возможные причины развития выявленных нарушений, следует отметить, что, поскольку содержание половых стероидов (прогестерона, эстриола), а также показателей иммуноглобулиновой продукции (иммуноглобулинов G, А, М) и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови данного контингента женщин во II триместре беременности статистически значимо не отличается от такового в аналогичные сроки гестации у женщин контрольной группы, то эти показатели не могут вызывать модификацию протеомного профиля. Выяснение пусковых механизмов изменений белкового спектра требует дальнейших исследований разных этапов синтеза mPHK и белка, а также посттрансляционных процессов.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что модификация в составе структурных и регуляторных белков уже во II триместре беременности создает предпосылки для развития молекулярно-клеточных нарушений в системе мать—плацента—плод и в дальнейшем способствует преждевременному развязыванию родовой деятельности. Выявленные и идентифицированные в сыворотке крови белки отличия могут быть потенциальными маркерами прогнозирования преждевременных родов.

1. Протеомный спектр сыворотки крови у женщин, беременность которых завершилась преждевременными родами, отличается от такового у беременных, родивших в срок. Идентифицированы белки как со сниженной, так и с повышенной экспрессией.

2. К числу белков, экспрессия которых снижена при угрозе преждевременных родов, относятся регуляторные молекулы — Е-кадгерин, Янус-киназа 2, эндоплазмин, белок теплового шока 8, гельзолин, трансгелин-2, антиоксидантные ферменты — пероксиредоксины 2 и 3 и супероксиддисмутаза, а также сосудисто-эндотелиальный фактор роста А.

3. Повышение экспрессии выявлено для фактора дифференцировки пигментного эпителия, транскрипционного фактора S-II, рибосомального белка S6-киназы альфа-3, интерлейкина-6, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста-1-го типа, и бикунина.