Циркуляция внеклеточной плодной дезоксирибонуклеиновой кислоты в плазме крови беременных и формирование у них клинико-патогенетических особенностей артериальной гипертензии

Преэклампсия - одна из ведущих причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности во всем мире, поэтому крайнюю необходимость представляет разработка тестов для прогнозирования и ранней диагностики этого осложнения беременности еще до появления клинических симптомов заболевания [1, 9]. Циркулирующая внеклеточная общая и плодная дезоксирибонуклеиновая кислота (воДНК, впДНК) в плазме крови беременных является новым биомаркером для пренатальной диагностики. Уровень впДНК в настоящее время определяется путем анализа локусов SRY и DYS14, связанных с Y-хромосомой, в этом случае анализируются образцы только при беременности плодом мужского пола [2, 10]. Однако предложены альтернативные подходы с использованием независимых от пола таких эмбриональных эпигенетических маркеров, как гиперметилированная ДНК или внеклеточная плацентарная РНК [6, 11]. Для раннего распознавания преэклампсии увеличение уровня впДНК в плазме крови матери может быть отмечено уже в I триместре беременности [13]. Причинами роста концентрации впДНК считают нарушение инвазии ворсин хориона и патологические процессы в маточно-плацентарном локусе [15]. Однако уровень этого биомаркера не ассоциирован с проявлениями системного воспалительного ответа, оцениваемого по количеству C-реактивного белка, антифосфолипидных или анти-ДНК антител, сопровождающих аномальную плацентацию [7, 10]. В то же время концентрация впДНК связана с уровнем активина А, ингибирующего рост сосудистого эндотелия при инвазии трофобласта, так как уровень обоих факторов сочетанно увеличивается до появления клинических проявлений преэклампсии [5]. Выраженность симптомов преэклампсии может быть связана с количеством циркулирующей впДНК, что, однако, остается предметом дискуссий [3, 13]. Таким образом, клинико-патогенетическое значение внеклеточной ДНК в плазме крови матери при артериальной гипертензии остается мало изученным, как и роль нового биомаркера в сравнительном анализе преэклампсии и хронической артериальной гипертензии (ХАГ), осложняющей процесс гестации.

Цель данного исследования - изучение ассоциации уровней воДНК и впДНК в плазме крови матери с клинико-патогенетическими особенностями преэклампсии и ХАГ, а также с другими факторами, патогенетически значимыми для формирования этих заболеваний.

Проведено наблюдение за 102 беременными в III триместре гестации, из которых у 35 была преэклампсия (1-я группа), 37 пациенток страдали ХАГ (2-я группа) и 30 были здоровыми с физиологическим течением беременности (контрольная группа). Средний возраст в группах составил 28,7±7,6, 29,3±6,5 и 26,4±4,3 года соответственно. Все женщины вынашивали плод мужского пола при одноплодной беременности. В качестве дополнительных контрольных групп были обследованы по 10 беременных указанных выше нозологических групп с плодами женского пола.

Проводилось суточное мониторирование артериального давления (АД), в анализ включены данные среднесуточного систолического и диастолического АД (ССАД и СДАД). Оценен кровоток в системе мать-плацента- плод при допплерометрии маточных и пуповинных артерий.

Выделение внеклеточной ДНК проводили из 1000 мкл плазмы крови методом сорбции на магнитных частицах с использованием набора РеалБест экстракция 1000. Элюцию осуществляли в объеме 40 мкл. Для определения концентрации внеклеточной ДНК использовали тест-системы Quantifiler и Quantifiler Y. С помощью данных тест-систем оценивали кинетику накопления продуктов амплификации локусов 5p15.33 (ген теломеразной обратной транскриптазы) для воДНК и Yp11.3 (ген детерминирующего пол региона Y-хромосомы - SRY) для впДНК. В качестве детектирующего амплификатора использовали систему регистрации полимеразной цепной реакции ABI Prism 7500.

Концентрацию интерлейкинов (IL) 2, 6 и 10 в крови матери и пуповинной крови, собранной для исследования после вагинальных родов, определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов реактивов ИФА-IL-2, ИФА-IL-6 и ИФА-IL-10.

Проверку на нормальность распределения данных проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me, Q₁-Q₂), значений среднего и стандартного отклонений (M±SD). Оценка связи количественных признаков в зависимости от их распределения проведена с помощью t-теста Стьюдента, U-теста Манна-Уитни, дисперсионного анализа (ANOVA), критерия Краскела-Уоллиса. Связь между переменными определена тестом ранговой корреляции Спирмена. Статистическая значимость различий установлена при p<0,05.

При анализе клинической характеристики групп установлено, что индекс массы тела (ИМТ) до беременности у больных с преэклампсией (1-я группа) и ХАГ (2-я группа) имел тенденцию к повышению по сравнению с таковым у здоровых женщин, тогда как ИМТ перед родами был больше в обеих группах обследованных пациенток (табл. 1).

В плазме крови воДНК была обнаружена у всех беременных. Уровень этого биомаркера значительно преобладал при преэклампсии по сравнению с таковым во 2-й и контрольной группах (р=0,04 и р=0,03 соответственно), тогда как у больных с ХАГ и здоровых беременных различия в концентрации воДНК были незначимы (р=0,5) (табл. 2).

У 33 (94,3%) пациенток 1-й группы была обнаружена впДНК, последняя выявлена у 30 (81,1%) - 2-й группы и только у 23 (76,6%) - здоровых беременных. Вместе с тем уровень впДНК при преэклампсии был значительно выше, чем у пациенток с ХАГ и в группе здоровых беременных (р=0,013 и р=0,0006 соответственно). Рост концентрации впДНК до появления клинических симптомов преэклампсии происходит в связи с гипоксией/реоксигенацией в пределах межворсинчатого пространства, приводящей к оксидантному стрессу ткани, некрозу и увеличению плацентарного апоптоза [1, 2, 13]. Манифестация преэклампсии ассоциирована со вторым пиком повышения уровня впДНК в плазме крови матери (по данным других авторов [8, 9, 15], в 3-80 раз), зависящего от нарушения почечного клиренса плодового биомаркера.

Необходимо отметить, что концентрация впДНК у беременных всех групп не зависела от уровня воДНК, что, видимо, связано с различными механизмами повышения содержания биомаркеров в плазме.

Концентрация IL-6 материнской плазмы в 1-й группе беременных была значительно выше, чем у пациенток 2-й и контрольной групп (р=0,018 и р=0,027 соответственно), как и уровень IL-6 пуповинной крови при сравнительном анализе тех же групп (р=0,02 и р=0,035 соответственно) (см. табл. 2). Содержание IL-10 и IL-2 плазмы крови в группе с гестационным повышением АД (1-я группа) увеличивалось, достигая достоверных различий по сравнению с уровнем этих цитокинов в контрольной группе (р=0,038 и р=0,04 соответственно), но не с показателями 2-й группы. Уровень IL-10 в пуповинной крови при преэклампсии значительно превысил этот показатель во 2-й и контрольной группах беременных (р=0,024 и р=0,032 соответственно), а концентрация IL-2 во всех группах не различалась.

Связи клинико-функциональных показателей, уровней цитокинов с концентрацией воДНК не установлено во всех группах. Значимые результаты корреляционного анализа для впДНК и количественных признаков получены только в 1-й группе (табл. 3).

Значимый коэффициент корреляции получен только при анализе пары «IL-10 плазмы матери - впДНК», тогда как связь уровня провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-2 с концентрацией впДНК не установлена. Однако отсутствие взаимосвязи между этими показателями может не означать отсутствия их биологического взаимодействия; оно зависит от различного периода полураспада цитокинов и впДНК [9]. Кроме того, IL-6 и IL-2 - важные модуляторы дисфункции эндотелия и системного воспаления при преэклампсии, инициатором которых является мигрирующий в кровоток матери трофобласт, чьи клетки - основной источник впДНК [4, 12, 14].

Таким образом, из двух изучаемых форм гипертензии только преэклампсия связана с увеличением уровня внеклеточной ДНК в крови матери. Так, концентрация впДНК является значимым биомаркером клинико-патогенетических особенностей преэклампсии, связанных с морфофункциональными нарушениями в системе мать-плацента-плод, хотя ассоциации между провоспалительными IL-6 и IL-2 и уровнем генетического плодового материала в крови матери не установлено. Очевидно, что пренатальная диагностика, основанная на изучении циркулирующей впДНК, весьма перспективна, однако для внедрения в клиническую практику необходимо дальнейшее исследование роли этого фактора в патологии беременности.

1. Установлено повышение уровня внеклеточной общей и плодной ДНК у беременных с преэклампсией.

2. Уровень внеклеточной плодной ДНК у пациенток с преэклампсией ассоциирован с наличием синдрома задержки роста плода, индексом резистентности в маточных артериях и уровнем интерлейкина-10 в плазме крови беременных.

3. Концентрация внеклеточной плодной ДНК является значимым биомаркером клинико-патогенетических особенностей преэклампсии.