Сравнительный анализ диагностической значимости определения антимикробного и цитокинового профиля в ротовой и десневой жидкости у беременных женщин при хроническом генерализованном пародонтите

Введение

Антимикробные пептиды (АМП) благодаря своим уникальным свойствам селективно действовать на бактерии способствуют защите тканей пародонта от бактериальной агрессии. Механизм действия АМП на бактерии основан на простых электрических, осмотических и диффузионных процессах: положительно заряженные АМП вследствие электростатического притяжения взаимодействуют с отрицательно заряженными липополисахаридами бак-терий, обеспечивая дальнейшее повышение проницаемости бактерий и осмотический лизис микроорганизмов [1]. Среди АМП биологических сред ротовой полости интерес исследователей вызывают α-дефензины и кателицидин LL-37 ввиду их высокой значимости для обеспечения мощного зашитного барьера для ограничения действия пародонтопатогенных бактерий в ротовой полости [1]. АМП могут выступать как иммуномодуляторы, изменяя секрецию цитокинов иммунокомпетентными клетками [2]. В организме беременной женщины происходит изменение активности гуморального и клеточного иммунитета ввиду приоритета обеспечения иммунологической толерантности к антигенам плода [2]. Как изменяется в такой ситуации кооперация антимикробных и цитокиновых механизмов при хроническом генерализованном пародонтите (ХГП), неизвестно.

Ротовая и десневая жидкости содержат различное количество иммунокомпетентных клеток, секретирующих АМП и цитокины [3]. Десневая жидкость является транссудатом сыворотки крови в десневой желобок и служит главным поставщиком лейкоцитов в ротовую жидкость. Содержание лейкоцитов в ротовой жидкости ниже, чем в десневой, поскольку смешанная слюна содержит продукты секреции слюнных желез и слизистой оболочки полости рта, большее число слущенных эпителиальных клеток, компоненты пищи [2]. Различный клеточный и химический состав биологических сред ротовой полости сопровождается различным содержанием биологически активных веществ, что может определять их разную диагностическую информативность и клиническую значимость.

В ранее проведенных фундаментальных исследованиях антимикробного и цитокинового профиля в ротовой полости у беременных женщин изучали ротовую жидкость [4—6]. Одновременное исследование концентрации АМП и цитокинов в двух средах ротовой полости может помочь в выявлении особенностей врожденного и адаптивного иммунитета у беременных женщин при хроническом пародонтальном очаге инфекции.

Цель работы — сравнительный анализ антимикробного и цитокинового профиля ротовой и десневой жидкостей у беременных женщин с ХГП различной степени тяжести.

Материал и методы

Обследованы 63 беременные пациентки, страдающие ХГП. Из них легкая степень ХГП была диагностирована у 29 (46%), а средняя степень тяжести ХГП — у 34 (54%) женщин. Контрольную группу составила 31 здоровая беременная пациентка с отсутствием стоматологической и соматической патологии, осложнений гестационного периода. Беременные пациентки обследованы во II триместре беременности (13—27-я неделя гестационного периода).

Критерии включения пациенток в основную группу: беременность, ХГП легкой и средней степени тяжести, возраст 18—40 лет, информированное согласие взятия биологических сред для исследования.

Проведение данной работы одобрено локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Средний возраст пациенток в контрольной группе составил 26,4±1,7 года, а в основной группе — 28,1±1,7 года. В основную группу вошли 25 (40%) первобеременных и 38 (60%) повторнобеременных, в контрольную — 14 (45%) первобеременных и 17 (55%) повторнобеременных.

Ротовую жидкость собирали натощак утром с 8 до 9 ч путем сплевывания в стерильную стеклянную пробирку в течение 5 мин. Предварительная стимуляция отсутствовала. Десневую жидкость из десневого желобка собирали по методу Н.А. Чукаевой (1990).

Для оценки пародонтологического статуса определяли индекс гигиены (ИГ) полости рта по Грину—Вермильону, папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (ПMA) и пародонтальный индекс (ПИ).

Содержание АМП и цитокинов в биологических средах с обработкой результатов определяли на автоматическом ридере EL 808 (США). При измерении концентрации кателицидина LL-37 использовали набор реактивов Нycult Biotech human LL-37 ELISA (Нидерланды), α-дефензинов 1−3 — набор реагентов для определения α-дефензинов 1−3 (Нидерланды), интерлейкинов (ИЛ) — диагностический набор ИЛ-4-ИФА-Бест, ИЛ-8-ИФА-Бест, ИЛ-10-ИФА-Бест, ФНО-ИФА-Бест (Россия).

Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 10.0 (США).

Результаты

В табл. 1 представлены

Таблица 1. Концентрация АМП и цитокинов (M±m) в биологических средах ротовой полости у беременных женщин контрольной группы без стоматологической патологии (n=31) Примечание. РЖ — ротовая жидкость, ДЖ — десневая жидкость; * — достоверные отличия концентрации веществ в десневой жидкости по сравнению со смешанной слюной.

средние значения концентрации АМП и цитокинов в биологических средах ротовой полости у беременных женщин контрольной группы. По сравнению с ротовой жидкостью содержание α-дефензинов 1−3 в десневой жидкости было на три порядка меньше, а кателицидина LL-37 — на шесть порядков меньше. АМП в ротовой жидкости в большей мере секретируются эпителиальными клетками слизистой оболочки полости рта, а в десневой жидкости имеют лейкоцитарное происхождение [7]. Поскольку у пациенток без стоматологической патологии миграция лейкоцитов через десневой эпителий не выражена, то секреция АМП нейтрофилами низкая и их содержание в десневой жидкости ограничено по сравнению с ротовой жидкостью.

У больных с ХГП легкой и средней степенью тяжести концентрация изучаемых АМП и цитокинов в биологических средах ротовой полости по сравнению с контрольной группой достоверно повысилась (табл. 2).

Таблица 2. Концентрация АМП и цитокинов (M±m) в биологических средах ротовой полости у беременных женщин с ХГП легкой (ХГП ЛСТ) и средней степени тяжести (ХГП ССТ) Примечание. РЖ — ротовая жидкость, ДЖ — десневая жидкость; * — достоверные отличия у пациенток с ХГП ССТ по сравнению с ХГП ЛСТ.

По сравнению с контрольной группой в основной группе наиболее выраженный прирост содержания α-дефензинов 1−3 наблюдали при ХГП средней степени тяжести в десневой жидкости (на 54%, p<0,05) (рис. 1).

Рис. 1. Процентное отличие концентрации АМП и цитокинов в ротовой (РЖ) и десневой жидкости (ДЖ) у беременных женщин с ХГП легкой и средней степени тяжести по сравнению с показателями контрольной группы. * — достоверные отличия по сравнению с показателями в контрольной группе.

Объяснить прирост содержания α-дефензинов 1−3 в ротовой и десневой жидкостях у пациенток с ХГП средней степени тяжести можно тем, что с повышением площади и интенсивности воспаления за счет усиленного хемотаксиса нейтрофилов к воспалительному очагу и высвобождения из лейкоцитов провоспалительных факторов происходит все увеличивающееся высвобождение и иммунозащитных α-дефензинов.

Содержание кателицидина LL-37 при воспалительном поражении пародонта возрастало с высокой амплитудой во всех жидких средах полости рта, но особенно выраженным было повышение содержания изучаемого АМП в ротовой жидкости (на 233%, p<0,001) (рис. 2).

Рис. 2. Процентное отличие концентрации АМП и цитокинов в ротовой (РЖ) и десневой жидкости (ДЖ) у беременных женщин с ХГП средней и легкой степени тяжести. * — достоверные отличия у пациенток с ХГП ССТ и ХГП ЛСТ.

Кателицидин отвечает за хемотаксис полиморфно-ядерных нейтрофилов, которые уничтожают микроорганизмы, подключая окислительный и не-окислительный механизмы [8]. Свое антимикробное воздействие α-дефензины 1−3 осуществляют за счет окислительных механизмов [9]. По-видимому, не-окислительные механизмы кателицидина LL-37 при беременности являются более предпочтительными, чем окислительный механизм уничтожения микроорганизмов α-дефензинов 1−3 вследствие более щадящего действия на эпителий слизистой оболочки полости рта.

Среди цитокинов у беременных пациенток с ХГП легкой и средней степени тяжести по сравнению с контрольной группой повышение ИЛ-4 и ИЛ-10 в ротовой и десневой жидкости можно расценивать как активацию фактора гуморального иммунитета в биологических жидкостях при воспалительных заболеваниях пародонта. Такая благоприятная динамика цитокинов обеспечивала противовоспалительный эффект, но не стимулировала клеточно-опосредованный иммунитет. Однако у пациенток основной группы произошел резкий прирост концентрации ФНО-α в биологических средах полости рта, особенно в десневой жидкости (на 232%, p<0,001). Данное изменение в содержании провоспалительного цитокина ФНО-α имело неблагоприятное патогенетическое значение, поскольку для ФНО-α характерно цитотоксическое действие на плод.

При ХГП средней степени тяжести по сравнению с легкой степенью уровень α-дефензинов 1−3 повышался только в десневой жидкости. Таким образом, оценка содержания α-дефензинов 1−3 в десневой жидкости в большей мере, чем в ротовой жидкости, отражала тяжесть ХГП. Концентрация кателицидина LL-37 в ротовой жидкости при средней по сравнению с легкой степенью тяжести ХГП была выше на 83% (p<0,05), а в десневой жидкости — на 63% (p<0,05). Следовательно, кателицидин LL-37 как в ротовой, так и в десневой жидкостях с высокой диагностической значимостью сопряжен с тяжестью воспалительных изменений тканей пародонта. У беременных с ХГП средней степени по сравнению с легкой степенью тяжести статистически значимое повышение ИЛ-4, ИЛ-8 и ИЛ-10 в ротовой и десневой жидкостях было выражено умеренно. Выраженное повышение ФНО-α (на 41%, p<0,05) при утяжелении заболевания имело место только в десневой жидкости.

Корреляционный анализ взаимосвязи пародонтальных индексов и содержания антимикробных пептидов, а также цитокинов в ротовой и десневой жидкостях, результаты которого отражены в табл. 3, позволил

Таблица 3. Коэффициенты корреляции между концентрациями АМП и цитокинов в биологических средах ротовой полости и ПИ

выявить следующее. Статистически значимая умеренная прямая связь имела место между содержанием α-дефензинов 1−3 и пародонтальным индексом как в ротовой (R=0,34; p<0,05), так и в десневой жидкости (R=0,36; p<0,05). Содержание кателицидина LL-37 в десневой жидкости находилось в прямой корреляционной зависимости от изменений всех изучаемых ИГ и П.И. Среди цитокинов ротовой жидкости со всеми тремя изучаемыми ПИ достоверно коррелировал уровень ИЛ-8. Наиболее тесная корреляционная связь между ПИ была установлена для ИЛ-8, кателицидина LL-37 и ФНО-α. Таким образом, для ФНО-α и ИЛ-8 установлена важная роль в развитии деструкции тканей пародонта у беременных женщин, а для кателицидина LL-37 — функция обеспечения антимикробной защиты полости рта.

Выводы

1. У беременных пациенток без стоматологической патологии накопление АМП преимущественно происходит в ротовой жидкости. При наличии ХГП концентрация АМП возрастает с большей выраженностью и с более тесной зависимостью от тяжести заболевания в десневой жидкости.

2. В биологических средах полости рта у беременных женщин при развитии ХГП легкой и средней степени тяжести происходит повышение цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10, способствующих активации гуморальных защитных реакций. При ХГП с утяжелением от легкой к средней степени тяжести активируются цитотоксические клеточно-опосредованные иммунные реакции, преимущественно за счет выраженного прироста ФНО-α в десневой жидкости.

3. Наибольшей информативностью при ХГП легкой и средней степени тяжести у беременных женщин обладает измерение концентрации кателицидина LL-37 в ротовой и десневой жидкостях, а также ФНО-α в десневой жидкости.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

e-mail: alald@inbox.ru; https://orcid.org/0000-0001-7695-2479