На современном этапе развития доказательной медицины к гистологическим исследованиям предъявляются повышенные требования. В арсенале исследователей уже стали рутиной иммуногистохимические, цитохимические, молекулярные методы. Однако в некоторых случаях необходимо не только определить характеристику ткани, стадию ее созревания и клеточный состав, но и понять одновременно цитологические, гистологические и биохимические процессы, протекающие при нормальной регенерации или при патологическом состоянии. Зачастую одновременно определить такой биохимический показатель как минеральный состав и морфологическую структуру ткани на гистологическом препарате невозможно. Однако с совершенствованием исследовательской базы открываются новые горизонты в традиционной и рутинной гистологии.

Сегодня спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) успешно применяется в гистологии для изучения не только минерализованных тканей, но и опухолей. Причем разработка методов ведется как для рутинных методов, так и для цитодиагностики операционного материала [3].

КР света — это неупругое рассеяние оптического излучения на молекулах или ионах, сопровождающееся изменением частоты возбуждающего излучения. Спектры КР специфичны для каждого молекулярного соединения и это может быть использовано для регистрации и идентификации молекул в различных смесях [1].

Спектроскопия КР имеет ряд преимуществ по сравнению с другими аналитическими методами:

— в отличие от инфракрасной спектроскопии, регистрация рассеянного излучения ведется в оптическом диапазоне, что обеспечивает высокую чувствительность и удобство в работе;

— КР является методом бесконтактного и неразрушающего контроля;

— этот метод пригоден для работы с веществами, находящимися в любых фазовых состояниях (твердом, жидком или газообразном);

— для проведения исследования не требуется специальной подготовки образцов;

— достаточно быстрый анализ (от секунд до минут);

— современные КР спектрометры имеют возможность картирования образцов (как правило, в этом случае КР спектрометр совмещается с оптическим микроскопом).

Свое место в морфологических исследованиях спектроскопия КР нашла в остеологии и регенеративной медицине. Так, с помощью спектроскопии КР исследовалась дифференцировка остеобластов [4]; изучалось распределение белков и липидов на разных стадиях деления ооцита [5]. Результаты работы [6] показали, что спектроскопия КР может применяться для мониторинга биохимии кости при исследовании такого заболевания, как остеопороз. При этом были проведены испытания препаратов, разработанных для борьбы с этим заболеванием.

Проведенные ранее отечественные исследования [2] показали, что метод спектроскопии КР может с успехом быть использован для определения характеристик образования, минерализации и созревания костной ткани, а также может выявить локусы с максимальной и минимальной минерализацией.

Развитый нами подход к использованию этого метода позволил сопоставить результаты спектроскопии КР с гистологическими и морфометрическими данными и характеристиками костных регенератов в зависимости от экспериментальных и клинических задач.

Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению возможностей использования метода спектроскопии КР для диагностики различных заболеваний и состояний твердых тканей лицевого скелета человека.

Для изучения структуры и минерализации костных тканей использовались зубы человека, удаленные по поводу осложненного кариеса и по ортодонтическим показаниям, а также образцы костной ткани (трепанобиоптаты) нижней челюсти, полученные во время планового установления дентальных имплантатов. Степень кариеса определяли по классификации ММСИ (1989).

Образцы фиксировали в 70% этаноле в течение 24—72 ч. Затем промывали, обезвоживали и заливали в метилметакрилат (Osteo-Bead, Sigma-Oldrich) по стандартной методике, рекомендованной производителем с последующей полимеризацией. Из полученных блоков готовились первичные срезы 200 мкм (Lowspeed sow Jet, Швейцария), из которых готовились вторичные срезы толщиной 40—50 мкм. Контроль толщины среза осуществлялся стандартным механическим микрометром барабанного типа.

Регистрация спектров КР проводилась на спектрометре Nicolet Almega XR (США) с использованием в качестве возбуждения линии 785 нм полупроводникового лазера. Использовался объектив MPlan N 10х/0.25 BD, область облучения для него составляет 3 мкм. Исследуемый частотный диапазон был 200—2000 см^–1, спектральное разрешение составляло 4,5 см^–1.

На рис. 1 приведены спектры КР исследуемого образца, полиметилметакрилата (ПММА) и синтетического гидроксиапатита (ГА).

Полоса ГА, связанная с симметричными колебаниями фосфатной группы, с максимумом около 960 см^–1, присутствует в спектре образца и обусловлена нахождением ГА в костной ткани. Эта полоса не маскируется линиями ПММА. Поэтому она и использовалась для построения карты пространственного распределения ГА по объему образца.

На рис. 3 слева показана фотография поверхности среза исследуемого образца и отмечена область, по которой проводилось картирование. Размер исследуемой области составлял 2,7×5,7 мм². Регистрация спектров проводилась с шагом 100 мкм. На рис. 3 справа приведена карта распределения гидроксиапатита в изучаемом образце, совмещенная с фотографией. Здесь и в дальнейшем на картах показана интенсивность выбранной полосы ГА, которая прямо пропорциональна его концентрации в области регистрации спектра. Синим цветом окрашена область, где полоса ГА отсутствует. По мере роста интенсивности полосы ГА цвет переходит в зеленый и далее в красный.

Гистологическая структура интактных зубов соответствовала типичным разграничениям слоев — эмаль, дентин (рис. 2).

В свою очередь, при спектроскопии КР клинически интактных зубов отмечалось неравномерное распределение минерального вещества (ГА) в эмали с образованием пятен низкой и повышенной минерализации, тогда как в дентине минерализация была более (или практически) равномерной (рис. 3).

Гистологически данная стадия кариеса проявлялась возникновением узурированных участков разрушения эмали с конденсацией в узурах зубного налета (рис. 4).

Повреждение дентина не обнаружено.

При проведении спектроскопии КР выявлено, что в проекции «желтого пятна» отмечается слабовыраженная деминерализация эмали с формированием «дорожки», уходящей по направлению вглубь, к дентину (рис. 5).

При сопоставлении гистологической картины и спектральной карты выявлено, что глубина повреждения на светооптическом уровне не соответствует спектроскопической картине, где выявленная глубина поражения значительно больше (см. рис. 5, красные стрелки).

Гистологически данная стадия кариеса проявлялась образованием полупрозрачной и темной зоны эмали (по Е.В. Боровскому, 2001 г.). Повреждения дентина не выявлено (рисунок не представлен).

Методом спектроскопии КР показано, что в проекции «коричневого пятна» отмечается умеренно выраженная деминерализация эмали на всем протяжении до дентина (рис. 6).

При сопоставлении гистологической картины и спектральной карты выявлено, что глубина повреждения на светооптическом уровне соответствует спектроскопической картине. Однако в пограничных к пятну зонах наблюдается одновременно и деминерализация и гиперминерализация, носящая очаговый, а возможно и валообразный характер.

Гистологически данная стадия кариеса проявлялась полным разрушением эмали. В дентине четко разделялись зоны прозрачного, полупрозрачного и мутного дентина (по Е.В. Боровскому, 2001 г.) (рис. 7).

Спектроскопическое исследование выявило, что в проекции «коричневого пятна» отмечается выраженная деминерализация эмали на всем протяжении до дентина (рис. 8).

При сопоставлении гистологической картины и спектральной карты выявлено, что глубина повреждения на светооптическом уровне соответствует спектроскопической картине. В пограничных зонах наблюдается формирование вала гиперминерализации. Граница деминерализации по спектрограмме превышает зону кариеса, выявленную гистологически.

Заживление костной раны — лунки удаленного зуба — в естественных условиях (под сгустком крови).

Через 180 дней после удаления зуба столбик костной ткани представлял собой созревающий костный регенерат. Кортикальная пластинка умеренно выражена, часто представлена утолщенными костными трабекулами. Костные балки губчатой кости были нормальной толщины или слегка утолщены. На поверхности кости в основном обнаруживались покоящиеся остеобласты, образующие подобие выстилки — покоящиеся клетки. Ретикулярная строма костного мозга состояла преимущественно из ретикулярной и жировой ткани, кроветворная ткань не наблюдалась (рис. 9).

При спектроскопии КР выявлено, что ГА, содержащийся в костной ткани, сконцентрирован в основном в формирующейся кортикальной пластинке (рис. 10). В губчатой же кости распределение минерального компонента равномерно (см. рис. 9).

Заживление костной раны — лунки удаленного зуба — в условиях имплантации минерального остеопластического материала.

Через 180 дней после удаления зуба и имплантации остеопластического материала объем столбика представлял собой созревающий костный регенерат. Среди костных трабекул обнаруживались различные по размеру гранулы остеопластического материала, часть которых контактировала с костью, а часть лежала свободно в костномозговом пространстве. Костные трабекулы были разной толщины, некоторые включали в себя гранулы остеопластического материала, другие интерегрировали материал не полностью, как бы опираясь на него. Ретикулярная строма костного мозга состояла как из ее обычных структурных элементов — ретикулярной и жировой ткани, так и из фиброзной ткани (рис. 11).

Методом спектроскопии КР выявлено, что концентрация ГА, содержащегося в костной ткани и гранулах остеопластического материала, была сравнимой. Выделить гранулы материала стало возможным только при сравнении гистологической и спектральной картинок. В области кортикальной пластинки наблюдались немногочисленные участки с увеличенной концентрацией ГА (рис. 12).

Сравнительное исследование минерализованных тканей челюсти человека с помощью традиционных рутинных гистологических методов и метода спектроскопии КР показало, что совместное использование указанных методов позволяет получить значительно большее количество информации о течении патологических процессов в минерализованных тканях (на примере кариеса), а так же определить особенности минерализации в условиях направленной костной регенерации.

В результате проведенного пилотного исследования установлено, что даже при начальных признаках кариеса (стадия 1а) зона деминерализации зуба затрагивает и эмаль и дентин, что может помочь более полному пониманию течения кариозного процесса, подходов к его лечению и профилактике осложнений лечения — рецидив кариеса после лечения.

В свою очередь, получены интересные данные о процессах минерализации костного регенерата в условиях направленной костной регенерации с использованием минерального (депротеинизированного) остеопластического материала животного происхождения. Показано, что отсутствует убыль минерального компонента материала при нахождении его в костном регенерате, а также сравнимая концентрация ГА в зрелом регенерате и гранулах минерала может пролить свет на вопрос об участии его в процессе минерализации вновь образованной кости.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант №14-25-00055) в части проведения спектроскопии КР и РФФИ (грант №12-02-01278-а) в части подготовки образцов для исследования и анализа полученных результатов.