Способ адресной доставки антибиотика в полости носа при раневых и воспалительных процессах (экспериментальное исследование)

Лечение раневых процессов и послеоперационных осложнений относится к актуальным проблемам ринохирургии. В последние годы внимание исследователей все больше концентрируется на проблемах стимуляции заживления ран и профилактики их нагноений при хирургии полости носа и околоносовых пазух [1—3].

Известно, что одним из факторов, отягощающих течение гнойно-воспалительных ран, является нарушение микроциркуляции, которое особенно выражено в очаге воспаления [4]. В развитии этого нарушения большое значение имеет диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. Возникновение инфекционно-септического синдрома тесно связано с бактериемией и токсемией, адгезией и агрегацией тромбоцитов, тяжелым эндотелиозом, выделением тканевого тромбопластина из поврежденных тканей. Развитие микроциркуляторных нарушений приводит к расстройству трофики тканей и гипоксии, а также способствует депонированию и размножению микроорганизмов в выключенных из кровоснабжения микрососудах. Это препятствует проникновению в очаг воспаления антибактериальных препаратов, что обусловливает недостаточную эффективность традиционной антибиотикотерапии.

Повысить активность антибиотиков в очагах микробного воспаления может целенаправленная доставка лекарственных средств. При этом следует рассчитывать на увеличение концентрации препарата в очаге и, соответственно, на уменьшение проникновения его в другие ткани и органы, что является одной из причин возникновения побочных эффектов [5].

Идея создания лекарственных форм, обеспечивающих направленную доставку необходимых веществ к месту действия, является одной из наиболее привлекательных и прогрессивных в современной медицине. Весьма интенсивно ведутся исследования по изучению возможности использования носителей лекарственных веществ в виде наночастиц [6, 7].

Под наночастицами принято понимать коллоидные частицы размером от 10 до 1000 нм, состоящие из макромолекулярного биодеградирующего и биосовместимого материала, в который активно внедрено лекарственное вещество [8]. Ассоциированное с наночастицами лекарственное вещество может попадать во внутритканевую и внутриклеточную среды. Фармакологическая активность лекарственного препарата восстанавливается при разрушении полимерной основы наночастиц. Таким образом, наночастицы могут осуществлять направленный транспорт лекарств в пораженные ткани. Это наиболее целесообразно для антибактериальных препаратов, применяемых при лечении гнойно-воспалительных заболеваний.

Одной из важнейших особенностей наночастиц ферригидрита является их абсолютная биосовместимость, поскольку данный минерал составляет ядро белкового комплекса — ферритина — основного носителя железа во всех высших живых организмах. Разработан способ получения стабильных золей наночастиц ферригидрита биогенного происхождения (наночастицы ферригидрита образуются на поверхности клеток в процессе культивирования бактерий Klebsiella oxytoca). Устойчивость полученных золей обеспечивается наличием естественной органической оболочки. Размеры наночастиц ферригидрита составляют 2—3 нм. Температура магнитного упорядочения превышает комнатную [9].

Ранее нами была изучена проникающая способность магнитных наночастиц ферригидрита в ткани носа in vitro. В результате исследования установлено, что воздействие внешнего магнитного поля в течение 20 мин приводит к диффузному распространению наночастиц в слизистую оболочку, хрящевую и костную ткани носа [10].

Цель исследования — повысить эффективность лечения раневых и воспалительных процессов в полости носа за счет адресной доставки антибиотика с помощью магнитных наночастиц ферригидрита и внешнего магнитного поля.

Экспериментальные исследования выполнены на 30 крысах с массой тела 220—250 г. На депилированной коже поясничного отдела крыс под эфирным наркозом производили дозированные ожоги металлической пластинкой площадью 100 мм², нагретой до температуры 135—137 °С, с экспозицией 3 с. Лечение начинали на 2-й день после термического воздействия и инфицирования ожоговой раневой поверхности и продолжали в течение 7 сут. В зависимости от способа лечения животные были разделены на 2 группы: основную и группу сравнения.

В основной группе (n=15) лечение проводили магнитными наночастицами, ассоциированными с ампициллином в дозе 500 мг, в сочетании с воздействием магнитным полем с использованием аппарата «Полюс-101». На курс 7 ежедневных процедур.

В группе сравнения (n=15) лечение проводили с помощью аппликаций растворенного в физиологическом растворе ампициллина в дозе 500 мг и магнитотерапии с использованием аппарата «Полюс-101». На курс 7 ежедневных процедур.

Препарат равномерно распределяли по всей обожженной поверхности кожи с помощью стерильных ватных тампонов.

Аппарат «Полюс-101» (ЗАО «Завод ЭМА», Екатеринбург, Россия) использовали с градиентом 4—6 мТл/мм и величиной магнитной индукции 10,14—19,56 мТл.

Критериями оценки проводимого лечения являлись состояние, скорость заживления и результаты бактериологического и гистологического исследований раневой поверхности.

Для исследования образцы микрофлоры с ожоговой поверхности животных забирали на 2-й и 7-й дни эксперимента с помощью стерильных тупферов с транспортной средой Эймса. Образцы микрофлоры высевали на питательные дифференциально-диагностические среды (кровяной и желточно-солевой агары, агар Эндо, энтерококкагар). Посевы проводили методом секторов, инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 24 ч. При микроскопировании нативного материала использовали окраску по Граму. Из выросших колоний выделяли чистую культуру для дальнейшей идентификации. Видовую дифференциацию стрептококков осуществляли с помощью тест-системы Slidex Strepto-Kit (компания «БиоМерье», Франция). Для видовой идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae применяли агар Эндо с последующим использованием тест-системы ПБДЭ (НПО «Диагностические системы», Россия). Идентификацию стафилококков проводили с помощью тест-системы STAPHYtest («Lachema», Чехия).

Через 10 дней после начала исследования животных выводили из эксперимента с соблюдением принципов эвтаназии (применение эфирного наркоза). Для определения степени заживления ран было проведено гистологическое исследование пораженных тканей. Для этого полученный образец ткани фиксировали в 10% растворе формалина. Срезы толщиной 5—7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином с последующим микроскопическим изучением материала при увеличении в 40 и 100 раз.

Для адресной доставки антибиотика в рану использовали изученные ранее магнитные наночастицы ферригидрита, которые характеризуются отсутствием токсичности и хорошим проникновением в мягкие ткани.

В качестве антибактериального препарата применяли амоксициллин с клавулановой кислотой в дозировке 1,2 г, который относится к группе ингибиторозащищенных полусинтетических пенициллинов. Амоксициллин обладает антибактериальными и бактерицидными свойствами за счет блокирования синтеза пептидогликана оболочки микробных клеток, а клавулановая кислота ингибирует группу бактериальных ферментов — бета-лактамазы.

Порошок антибиотика для парентерального введения в дозе 1,2 г растворяли в 5 мл приготовленного раствора магнитных наночастиц. Полученным раствором смачивали марлевую салфетку и прикладывали к ране, после чего к повязке подносили индуктор аппарата «Полюс-101» (ГОСТ Р 50267.0−92) с градиентом магнитного поля 4—6 мТл/мм и величиной магнитной индукции 10,14—19,56 мТл. Продолжительность магнитного воздействия составляла 20 мин, на курс 5 ежедневных процедур.

Предложенная методика использования магнитных наночастиц в качестве проводника антибиотика в пораженные ткани достаточно проста и не требует дополнительного обучения персонала.

Методика введения антибиотика в рану с помощью магнитных наночастиц позволяет пролонгировать антибактериальное действие препарата, что особенно актуально при лечении раневых и воспалительных заболеваний. Эффективная элиминация возбудителя из очага поражения способствует снижению интенсивности воспалительной реакции и сроков заживления раны. Поэтому мы сочли целесообразным использование методики адресной доставки антибиотика в рану с помощью магнитных наночастиц у лабораторных животных.

Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями и положениями, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000).

Лечение лабораторных животных обеих групп начинали через 1 сут после термического воздействия, когда рана инфицировалась и соответствовала гнойно-воспалительному процессу.

В группе сравнения в 1-е сутки крысы были вялыми. На раневой поверхности определялись эрозии, отек мягких тканей, гиперемия кожи, раны умеренно кровоточили. На 3-и сутки раны покрывались струпом, из-под которого выделялся гной. Воспалительный процесс был ограничен перифокальным отеком.

На фоне местного лечения ампициллином на 5-й день общее состояние крыс нормализовалось, гноетечение уменьшилось, интенсивность воспалительных изменений снизилась. У 7 (46%) лабораторных животных ожоговая поверхность сократилась на 1/3, у большинства крыс (n=13, что составило 86%) эрозии начали эпителизироваться.

На 7-й день наблюдения активность крыс полностью восстановилась, гнойные выделения отсутствовали, явления воспаления значительно уменьшились, раны эпителизировались. Однако у 4 (26,6%) животных воспалительные изменения сохранялись. Это проявлялось отеком и гиперемией кожи в области ожога (рис. 1).

При микробиологическом исследовании животных группы сравнения на 2-е сутки после ожога была выявлена высокая обсемененность ран грамположительными бактериями. Доминирующими были микрококки (5,5±4,8∙10⁶ КОЕ/мл) и стафилококки (6,0±0,8∙10⁶ КОЕ/мл). Причем в популяции стафилококков большинство было представлено микроорганизмами вида S. aureus (1,0±0,5∙10⁷ КОЕ/мл). На фоне проводимой терапии ампициллином титр бактерий на 7-е сутки достоверно снизился. Однако, несмотря на применение антибиотика, в ране появились бактерии E. coli (1,0±0,5∙10⁵ КОЕ/мл), чего не было до лечения. Кроме этого, на 7-е сутки после ожога количество стафилококков в очаге поражения сохранялось на высоком уровне — 2,8±0,4∙10⁶ КОЕ/мл (табл. 1).

Несмотря на относительно благоприятную визуальную картину ран, при гистологическом исследовании на 10-е сутки после ожога у всех животных группы сравнения определялась картина фибринозно-гнойного воспаления с очагами деструкции и обильной инфильтрацией полиморфно-ядерными лейкоцитами. Раневая поверхность была покрыта слоем фибрина и тканевым детритом. Раневой процесс сохранял воспалительную направленность, а признаки регенерации в виде незрелой грануляционной ткани проявлялись только в единичных случаях (рис. 2).

Таким образом, терапевтический эффект местного лечения гнойно-воспалительных процессов у лабораторных животных ограничивался только поверхностным слоем эпидермиса, что приводило к персистенции микроорганизмов в глубине раны и удлинению сроков эпителизации. Поэтому для адресной доставки антибиотика в толщу пораженных тканей мы использовали магнитные наночастицы и внешнее магнитное поле.

Также как и в группе сравнения, в основной группе животные в 1-е сутки были пассивны, ткани в ране — отечны, контактно кровоточили. Лечение наночастицами с ампициллином сопровождалось уменьшением выраженности воспаления. Так, на 5-е сутки у 11 (73%) животных раневая поверхность уменьшилась на 1/3, что на 27% больше, чем в группе сравнения (р<0,05). Гнойное отделяемое в этот период имело место только у 5 (30%) животных в отличие от группы сравнения, где гноетечение сохранялось у всех особей.

На 7-е сутки у всех животных явления воспаления были полностью купированы, площадь раневого процесса сократилась на 50%, тогда как у животных группы сравнения — лишь на 1/3. Струп был более тонкий, при его отхождении ткань не кровоточила. Таким образом, визуальная картина ран лабораторных животных основной группы на 7-е сутки соответствовала регенеративному периоду раневого процесса (рис. 3).

При изучении микробного пейзажа ран животных основной группы на 2-е сутки показатели были схожи с группой сравнения. Применение магнитных наночастиц с антибиотиком способствовало значительному уменьшению числа бактерий на 7-е сутки. Кроме этого, количественные показатели высеянных микроорганизмов в ране были достоверно ниже, чем в группе сравнения. Так, количество микрококков было меньше в 4 раза (р<0,05), энтерококков — в 3 раза (р<0,05), а стафилококков — более чем в 2000 раз (р<0,01). Также в отличие от группы сравнения в основной группе не высеивались бактерии E. coli, что способствовало ускорению процессов заживления (табл. 2).

Результаты гистологического исследования животных основной группы на 10-е сутки после ожога свидетельствовали о полной эпителизации раневого дефекта. В этот период определялась отчетливая картина регенеративной стадии раневого процесса — доминирование на поверхности раны грануляционной ткани различной степени зрелости со слабо выраженной воспалительной инфильтрацией. Толщина струпа во всех образцах была в 1,5—2 раза меньше, чем в группе сравнения. Таким образом, можно сделать вывод о целесообразности использования наночастиц в качестве средства доставки антибиотика в пораженные ткани при гнойно-воспалительных процессах (рис. 4).

Таким образом, экспериментальные исследования подтвердили высокую эффективность предложенного метода использования магнитных наночастиц ферригидрита. Адресное введение лекарственного препарата приводило к выраженному обеднению микробного пейзажа, что способствовало более быстрой эпителизации раны, чем в группе сравнения. Бактериологический контроль ран подтвердил высокую антибактериальную активность комплекса наночастица—ампициллин в отношении микроорганизмов рода Staphylococcus и сохранения нормальной микрофлоры эпидермиса животных. Данные гистологического исследования животных, леченных с помощью наночастиц, и крыс группы сравнения значительно отличались. В материалах основной группы определялось преобладание грануляционной ткани, тогда как в группе сравнения доминирующей была воспалительная инфильтрация.

Положительные результаты экспериментальных исследований по проникающей способности магнитных наночастиц в ткани носа, а также эффективность адресной доставки антибиотика при раневом и воспалительном процессах свидетельствуют о целесообразности дальнейших исследований и практическом применении их результатов в ринохирургии.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ, Правительства Красноярского края в рамках научного проекта № 17−43−240527 р_а и специальной программы Министерства образования и науки Российской Федерации для ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования, написание текста: К.Д., С.С.

Сбор и обработка материала: И.Ч., Е.И.

Статистическая обработка данных: О.К.

Редактирование: К.Д.

Сведения об авторах

Добрецов Константин Григорьевич [Konstantin G.Dobretsov]; адрес: Россия, 660037, Красноярск, ул. Коломенская, 26 [address: 26 Kolomenskaya str., 660037 Krasnoyarsk, Russia]; elibrary-SPIN: 1017-7664; e-mail: ekdobretsov@rambler.ru; Столяр Сергей Викторович, старший научный сотрудник [Sergey V. Stolyar]; адрес: Россия, 660036, Красноярск, ул. Академгородок, 50, стр. 38 [address: 50, bldg. 38 Akademgorodok str., 660037 Krasnoyarsk, Russia]; elibrary-SPIN: 8057-8004; e-mail: stol@iph.krasn.ru; Коленчукова Оксана Александровна, д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник [Oksana A. Kolenchukova, MD, PhD, Professor]; адрес: Россия, 660041, Красноярск, Просп. Свободный, 79 [address: 79 Prosp. Svobodnyi, 660037 Krasnoyarsk, Russia]; elibrary-SPIN: 8008-5580; e-mail: kalina-chyikova@mail.ru; Чижова Ирина Андреевна, лаборант-исследователь [Irina A. Chizhova]; адрес: Россия, 660041, Красноярск, Просп. Свободный, 79 [address: 79 Prosp. Svobodnyi, 660037 Krasnoyarsk, Russia]; e-mail: irina301193@yandex.ru; Инжеваткин Евгений Владимирович, старший научный сотрудник [Evgeny V. Inzhevatkin]; адрес: Россия, 660036, Красноярск, ул. Академгородок, 50, стр. 38 [address: 50, bldg. 38 Akademgorodok str., 660037 Krasnoyarsk, Russia]; elibrary-SPIN: 3077-8550; e-mail: inscience@mail.ru