Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.
Морфологические особенности репаративной регенерации при воспалительной реакции слизистой оболочки полости носа после травмы: экспериментальное исследование
Журнал: Российская ринология. 2024;32(4): 254‑261
Прочитано: 1072 раза
Как цитировать:
Сокращения:
ИТС — индекс толщины субэпителиального слоя
ИТЭ — индекс толщины эпителия
СО — слизистая оболочка
Хирургические вмешательства на структурах носа даже при их малоинвазивности приводят к травматизации слизистой оболочки (СО). Воспаление, возникающее в СО полости носа в ответ на травму, является защитно-приспособительной реакцией организма, которая характеризуется развитием альтеративно-дистрофических, сосудисто-экссудативных и пролиферативных реакций [1]. Вследствие воспаления развивается дисфункция мерцательного эпителия, нарастает отек, изменяются реологические свойства носового секрета, что приводит к нарушению мукоцилиарного клиренса, снижению защитных, дренажных механизмов. Исходы воспалительной реакции зависят от многих факторов: объема хирургического вмешательства, дооперационного состояния мукоцилиарной системы, корректного патогенетического постоперационного лечения, ухода за носовой полостью. Пролиферация является завершающей фазой развития воспаления, обеспечивающей репаративную регенерацию тканей на месте очага альтерации. В случае извращения нормального процесса регенерации происходит патологическая регенерация, к проявлениям которой относят избыточное или недостаточное образование регенерирующей ткани (гипер- или гипорегенерация), а также превращение одного вида ткани в другой (метаплазия эпителия). Одним из наиболее частых проявлений патологической регенерации после операционных вмешательств в полости носа является замещение мерцательного эпителия соединительной тканью с формированием спаек, рубцов [2—4].
Изучение закономерностей процесса заживления раны перспективно для разработки патогенетически обоснованного лечения, целью которого является полноценное морфофункциональное восстановление эпителия в зоне раневого дефекта.
Цель исследования — оценить морфологические особенности регенерации СО полости носа после травмы в эксперименте.
Экспериментальное исследование проведено на 240 половозрелых беспородных крысах-самцах массой 250—300 г. Животных содержали в условиях вивария с обеспечением стандартных условий, свободным доступом к воде и пище. Содержание и проведение экспериментов осуществляли в соответствии с нормативными документами: Приказ Минздрава России от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (утвержден Приказом Федерального агентства по техрегулированию и метрологии от 20 ноября 2014 г. №1700-ст), Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, European Conventionforthe Protectionof Vertebrate Animals Usedfor Experimentalandother Scientific Purposes (ETS 123), Strasbourg, 1986.
Дизайн экспериментального исследования представлен на рис. 1.
Рис. 1. Дизайн исследования.
Всех животных (n=240) распределили на три равночисленные группы. Контрольную группу составили 80 интактных животных. Остальным животным под наркозом моделировали экспериментальный ринит путем нанесения механической травмы СО перегородки носа [5]. В 1-й экспериментальной группе (группа сравнения; 80 животных) после травмы не проводили медикаментозное лечение. Во 2-ю экспериментальную группу включили 80 лабораторных крыс, которым назначали лечение по схеме: амоксициллин внутрижелудочно в суточной дозе 20 мг/кг массы тела ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 сут, комбинированный секретолитический препарат растительного происхождения (внутрижелудочно 3 раза в сутки в течение 10 сут), орошение носовой полости изотоническим раствором морской соли 2—3 капли в каждую ноздрю 3 раза в сутки в течение 14 сут, закладывание в нос 0,5% гидрокортизоновой мази 1 раз в сутки на протяжении 10 сут.
Критерии включения: на момент включения в исследование животные в группах были сопоставимыми по возрасту, полу, массе тела, отсутствию видимой патологии развития и признаков заболеваний. Критерии исключения: развитие у животных осложнений после наркоза, дополнительной произвольной травмы и гнойных осложнений нижних дыхательных путей после травмы носа.
Для оценки регенерации определяли морфологические изменения и морфометрические показатели: индекс толщины эпителия (ИТЭ), индекс толщины субэпителиального слоя (ИТС), процентное соотношение реснитчатых, бокаловидных и недифференцированных клеток на 100 мкм длины эпителиального пласта, процент пролиферирующих клеток с выраженной экспрессией белка Ki-67. ИТЭ — соотношение среднего значения высоты эпителия после повреждения к среднему значению высоты неповрежденного эпителия в контрольной группе. ИТЭ =1,0 на неповрежденной СО в контрольной группе, >1,0 при гипертрофии эпителия. ИТС — соотношение среднего значения высоты субэпителиального слоя после повреждения к среднему значению высоты неповрежденного субэпителиального слоя в контрольной группе. ИТС =1,0 на неповрежденной СО в контрольной группе, >1,0 при отеке, утолщении.
Наблюдение за состоянием животных после нанесения травмы носовой перегородки производили в течение 60 сут. По 10 животных в каждой группе выводили из эксперимента на 2, 5, 10, 14, 21, 30, 42, 60-е сутки. В соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях (от 22 сентября 2010 г.), животных эвтаназировали помещением в CO2-камеру в условиях постепенного заполнения камеры диоксидом углерода. Данный вид эвтаназии животных сопровождается минимумом боли, страдания и дистресса. Забор СО носовой перегородки осуществляли согласно разработанной методике [6]. Полученные образцы фиксировали в 10% растворе формалина, осуществляли проводку в спиртах с возрастающей концентрацией и заливку в парафин. С каждого блока с тканью СО носовой полости животного изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического исследования были использованы мышиные моноклональные антитела к Ki-67 (клон GM0010, «ПраймБиоМед»). Для характеристики экспрессии Ki-67 долю пролиферирующих клеток вычисляли по окрашенным ядрам. Микроскопическое исследование выполняли при увеличении ×100, ×400 с помощью микроскопа Primo Star («Carl Zeiss», ФРГ).
Статистическую обработку результатов исследования выполняли с помощью программы Statistica 8.0 («StatSoft, Inc.», США). Гипотеза нормальности распределения в выборках проверялась с помощью W-критерия Шапиро—Уилка. Описание количественных данных отличного от нормального распределения проводили с помощью медианы (Me), интерквартильного размаха (25-й процентиль; 75-й процентиль). Различия между количественными параметрами независимых групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни, между зависимыми группами — критерия Вилкоксона. Различия во всех случаях считали статистически значимыми при p≤0,05.
На микропрепаратах обеих экспериментальных групп на 2—5-е сутки после травмы СО определялись десквамация и некроз эпителия, кровоизлияния, утолщение субэпителиального слоя за счет отека и нейтрофильной инфильтрации. Наблюдались очаги с обнажением базальной мембраны, расширение межклеточных пространств (рис. 2).
.jpg)
Рис. 2. Микропрепараты носовой перегородки у крыс 2-й экспериментальной группы после травмы на 5-е сутки.
1 — нейтрофильная инфильтрация; 2 — десквамация эпителия. Окраска гематоксилином и эозином, коронарная проекция (ув. 400).
Толщина эпителия в обеих экспериментальных группах статистически значимо (p≤0,05) уменьшилась в сравнении с контрольной группой за счет наличия участков десквамации (рис. 3). ИТС увеличился в обеих экспериментальных группах в сравнении с контрольной группой за счет отека и статистически значимо (p=0,002) на 5-е сутки был выше в 1-й группе.
Рис. 3. Динамика изменения ИТЭ и ИТС в группах.
Отмечалось статистически значимое (p≤0,05) снижение в экспериментальных группах в сравнении с контрольной группой количества реснитчатых клеток (см. таблицу).
Характеристика и количество клеток в эпителиальном пласте слизистой оболочки перегородки носа у крыс в группах
| Группа | Срок наблюдения (сут, Me [Q25; Q75]) | |||||||
| 2-е | 5-е | 10-е | 14-е | 21-е | 30-е | 42-е | 60-е | |
| Реснитчатые клетки | ||||||||
| Контроль (n=10) | 48,8 [47,6; 51,2] | 49,9 [47,6; 51,2] | 50,6 [47,6; 51,2] | 49,3 [48,3; 50,3] | 50,2 [48,8; 51,2] | 50,6 [49,7; 51,2] | 49,7 [48,4; 50,5] | 50,0 [48,5; 51,2] |
| 1-я группа (n=10) | 44,1 [41,6; 45,8]# | 38,9 [35,8; 42,4]*# | 37,4 [32,4; 38,6]# | 36,3 [35,8; 38,3]# | 38,0 [36,2; 41,3]# | 40,2 [38,3; 42,5]# | 42,0 [39,4; 44,2]*# | 43,6 [41,2; 45,1]# |
| 2-я группа (n=10) | 44,3 [42,8; 44,7]# | 40,4 [37,5; 43,3]*# | 37,2 [36,3; 38,4]# | 37,9 [36,8; 42,2]# | 40,4 [38,3; 42,3]*# | 40,9 [39,2; 43,4]# | 42,3 [39,9; 45,2]# | 44,7 [39,5; 48,2]# |
| Бокаловидные клетки | ||||||||
| Контроль (n=10) | 11,3 [10,1; 12,5] | 11,1 [10,2; 12,3] | 11,1 [10,2; 11,9] | 11,8 [11,2; 12,8] | 11,1 [10,4; 12,3] | 11,4 [10,4; 12,3] | 11,4 [10,4; 12,5] | 11,5 [10,4; 12,4] |
| 1-я группа (n=10) | 10,2 [9,5; 11,6] | 11,1 [10,2; 12,8] | 14,0 [12,8; 14,9]*# | 17,2 [15,2; 19,2]*# | 19,2 [18,5; 19,9]*# | 19,2 [18,5; 21,2]# | 17,5 [16,2; 19,9]*# | 15,8 [14,7; 16,4]# |
| 2-я группа (n=10) | 9,8 [9,1; 10,9] | 11,0 [9,3; 12,1] | 12,0 [10,9; 12,4]† | 13,9 [12,8; 14,2]*#† | 14,2 [13,3; 15,7]#☼ | 14,7 [12,3; 15,7]# ☼ | 14,6 [12,3; 15,4]#† | 12,3 [11,2; 13,8] |
| Недифференцированные клетки | ||||||||
| Контроль (n=10) | 4,1 [3,9; 4,6] | 4,1 [3,9; 4,3] | 4,2 [3,6; 4,4] | 4,2 [4,1; 5,1] | 4,2 [3,9; 4,4] | 4,1 [3,8; 4,3] | 4,2 [4,0; 5,0] | 4,7 [4,2; 5,1] |
| 1-я группа (n=10) | 3,6 [2,2; 4,2] | 4,2 [3,8; 4,7] | 4,5 [4,1; 5,1] | 6,8 [5,4; 7,1]*# | 7,2 [7,1; 8,4]# | 7,9 [6,8; 8,4]# | 8,6 [7,9; 9,8]*# | 8,8 [8,1; 9,1]# |
| 2-я группа (n=10) | 4,1 [3,3; 4,5] | 4,3 [3,9; 4,8] | 4,7 [4,2; 4,9] | 5,3 [4,5; 5,8]*# | 7,0 [5,8; 7,9]*# | 7,0 [6,2; 8,3]# | 8,7 [7,5; 10,3]*# | 9,0 [8,2; 10,3]*# |
| Пролиферирующие клетки | ||||||||
| Контроль (n=10) | 4,5 [4,2; 5,0] | 4,8 [4,2; 5,1] | 5,1 [4,2; 5,2] | 4,9 [4,3; 5,1] | 5,1 [4,9; 5,1] | 5,1 [4,9; 5,1] | 4,9 [4,8; 5,1] | 4,9 [4,6; 5,1] |
| 1-я группа (n=10) | 4,5 [3,7; 5,1] | 5,1 [4,3; 5,4]* | 5,6 [5,1; 6,2]# | 6,0 [5,2; 6,3]# | 6,2 [5,5; 7,6]# | 5,9 [5,8; 6,3]# | 5,6 [4,3; 5,8]* | 5,0 [4,3; 5,5] |
| 2-я группа (n=10) | 4,8 [4,2; 5,2] | 5,3 [4,7; 5,8] | 5,4 [5,2; 5,8]# | 6,4 [5,3; 6,9]# | 6,6 [5,4; 7,3]# | 5,3 [5,1; 6,3]* | 5,2 [4,3; 5,4] | 5,0 [4,3; 5,3] |
Примечание. Значками отмечены статистически значимые (p≤0,05) отличия: * — между исследуемым и предыдущим сроками наблюдения; # — между исследуемой и контрольной группами; † — между исследуемой и 1-й экспериментальной группами.
На микропрепаратах животных группы сравнения на 10—14-е сутки эпителий был неравномерно утолщен за счет очагов гиперплазии, с формированием единичных «псевдокрипт», очагов изъязвления и выраженной преимущественно лимфоцитарной воспалительной инфильтрацией всех слоев (рис. 4).
Рис. 4. Микропрепарат носовой перегородки у крыс 1-й экспериментальной группы после травмы на 10-е сутки.
1 — «псевдокрипты»; 2 — недифференцированный эпителий; 3 — воспалительная инфильтрация; 4 — разрушение базальной мембраны; 5 — гиперплазия подслизистых желез. окраска гематоксилином и эозином, коронарная проекция (ув. 400).
Базальная мембрана была частично нарушена и отсутствовала в зонах эрозирования эпителия. В подслизистом слое просветы желез были резко расширены, очагово отмечалась гиперплазия подслизистых желез. Сосуды полнокровны. Очагово поверхностный слой эпителия был представлен недифференцированными регенерирующими клетками.
В некоторых микропрепаратах 2-й группы уже на 10-е сутки собственная пластинка была представлена большим количеством фибробластов, что может являться показателем преобладания процессов склерозирования над эпителизацией.
В 1-й группе продолжал увеличиваться ИТС за счет инфильтрации воспалительными клетками, наблюдался рост бокаловидных клеток, что свидетельствовало об изменениях в направлении дифференцировки клеток в сторону бокаловидной трансформации эпителия. Отмечен статистически значимый (p≤0,05) рост количества недифференцированных и пролиферирующих клеток в обеих экспериментальных группах в сравнении с контрольной группой. Таким образом, воспалительно-деструктивные процессы на 10—14-е сутки регистрировались в обеих экспериментальных группах, но в группе сравнения отмечалась тенденция к увеличению дистрофических изменений в СО, что может приводить к неполной или патологической регенерации эпителия.
На 21-е сутки после травмы в микропрепаратах 1-й группы эпителий был неравномерной толщины с очагами изъязвления, в сохранившихся участках представлен столбчатыми реснитчатыми клетками. В собственной пластинке отмечалось наличие инвагинатов гиперпластического эпителия с формированием «псевдожелез» и кист. Сосуды щелевидные с краевым стоянием лейкоцитов. В единичных полях зрения стенки сосудов были утолщены за счет фиброза. Воспалительный инфильтрат был представлен клетками лимфоцитарного ряда с неравномерной локализацией в собственной пластинке и базальной пластинке (рис. 5).
Рис. 5. Микропрепараты носовой перегородки у крыс 1-й экспериментальной группы после травмы на 21-е сутки.
1 — очаг изъязвления; 2 — сосуды с краевым стоянием лейкоцитов. Окраска гематоксилином и эозином, коронарная проекция (ув. 400).
На 21-е сутки эксперимента во 2-й группе поверхностный слой эпителия был представлен чередованием участков, построенных из кубических и нереснитчатых столбчатых клеток. В одном из полей зрения наблюдалась эрозия эпителия с десквамацией поверхностного слоя.
ИТС сохранялся повышенным в 1-й группе, не получавшей противовоспалительного лечения. Во 2-й группе в сравнении с 14-ми сутками наблюдения отмечался рост (p=0,001) количества реснитчатых клеток. Сохранялась тенденция к росту (p=0,001) количества бокаловидных клеток в 1-й группе в сравнении с 14-ми сутками, что статистически значимо (p=0,001) выше, чем во 2-й группе.
На 30-е сутки на месте изъязвлений в микропрепаратах обеих экспериментальных групп появлялись очаги грануляционной ткани собственного слоя СО. Эпителий был неравномерной толщины, складчатый за счет очагов гиперплазии и очагов уплощения с наличием кубических клеток. Гистоархитектоника клеток была нарушена за счет пролиферации эпителия. Отмечались гиперхромия и увеличение ядер, в собственной пластинке наличие инвагинатов из гиперпластического эпителия. Выявлена гиперплазия субмукозных желез. Сохранялась диффузная воспалительная инфильтрация из лимфоцитарных, плазматических клеток. Строма была плотная, с очагами фиброза (рис. 6).
Рис. 6. Микропрепараты носовой перегородки у крыс 1-й экспериментальной группы после травмы на 30-е сутки.
1 — инвагинаты гиперпластического эпителия; 2 — воспалительная инфильтрация; 3 — плотная строма. Окраска гематоксилином и эозином, коронарная проекция (ув. 400).
ИТЭ в обеих экспериментальных группах был статистически значимо (p≤0,05) меньше, чем в контрольной группе. ИТС статистически значимо (p=0,002) уменьшился в сравнении с 21-ми сутками в 1-й группе, но оставался статистически значимо (p=0,004) выше, чем во 2-й группе. Количество недифференцированных клеток было увеличено в обеих экспериментальных группах в сравнении с контролем. Количество пролиферирующих клеток к 30-м суткам во 2-й группе не отличалось от группы контроля (p>0,05).
На 42-е сутки в микропрепаратах обеих экспериментальных групп эпителий был неравномерной толщины: участки гиперплазии клеток чередовались с очагами истончения. Очагово отмечалось скопление бокаловидных клеток с формированием внутриэпителиальных крипт и слизистых кист. Гистоархитектоника эпителия была нарушена. Подлежащая строма представлена коллагеновыми волокнами. Субэпителиальный склероз оказался более выраженным в микропрепаратах группы сравнения (рис. 7).
Рис. 7. Микропрепараты носовой перегородки у крыс 1-й экспериментальной группы после травмы на 42-е сутки.
1 — нарушение гистоархитектоники эпителия; 2 — грануляционная ткань; 3 — инфильтрация собственной пластинки; 4 — полнокровие сосудов. Окраска гематоксилином и эозином, коронарная проекция (ув. 400).
ИТС даже к 42-м суткам ни в одной экспериментальной группе не пришел в норму (p≤0,05), что говорит о незавершенной воспалительной реакции в зоне травмы. Метаплазия эпителия отмечалась в 1-й группе у 2 (20,0%) животных, во 2-й — у 1 (10,0%).
На 60-е сутки воспалительного процесса в 1-й группе клетки мерцательного эпителия уплощались, наблюдались лимфогистиоцитарная инфильтрация СО, гипертрофия бокаловидных желез, утолщение базальной мембраны за счет разрастания соединительной ткани, нарастали склеротические изменения собственного слоя СО. В некоторых препаратах отмечалось формирование кист, заполненных секретом.
Данные морфологические изменения расценивались как проявления патологической регенерации, хронизации процесса. В обеих экспериментальных группах ИТЭ не отличался от группы контроля, ИТС был выше, чем в группе контроля. Удельный вес реснитчатых клеток в обеих группах не достиг контрольных значений, количество бокаловидных клеток было выше, чем в контрольной группе, в обеих экспериментальных группах, но статистически значимо выше в 1-й группе (p=0,001). Оставалось повышенным в обеих экспериментальных группах в сравнении с контролем количество недифференцированных клеток.
В процессе альтерации высвобождается большое количество гуморальных и клеточных медиаторов, которые отвечают за возникновение и поддержание воспалительного процесса [7, 8]. Ключевым патогенетическим звеном в механизме нарушения функции мерцательного эпителия при воспалительном процессе является интерлейкин-13, способный изменять дифференцировку клеток в сторону увеличения секреторных клеток, а также подавлять двигательную активность мерцательных клеток [9]. Полученные при исследовании результаты согласуются с данными ряда авторов, которые также отмечали, что при катаральном воспалении СО в эпителиальном слое резко увеличивается количество бокаловидных клеток, вследствие чего изменяется нормальное соотношение мерцательных и бокаловидных клеток [10—12]. Длительность воспалительной реакции может поддерживаться, по данным А.Я. Желтова и соавт. (2018), за счет преобладания парасимпатической импульсации в очаге воспаления, что приводит к развитию «медиаторного воспаления» с последующей деградацией реснитчатого эпителия [13]. Появление продуктов тканевого распада активирует пролиферацию фибробластов, что может стимулировать преждевременный склероз [14]. Согласно данным настоящего исследования, даже на 60-е сутки после травмы процесс дифференцировки клеток продолжался, а уровень реснитчатых клеток не достигал контрольных значений. Кроме того, отмечались признаки перехода репаративной регенерации в патологическую. Как известно, при отсутствии патогенетического лечения на ранних этапах хронического воспаления ведущее место занимают продуктивные (гиперрегенерационные) процессы [11], а недостаточность регенерации, вызванная повреждением эпителия, лежит в основе многих хронических заболеваний носа и околоносовых пазух [15, 16].
При морфологическом исследовании СО полости носа после ее травмы признаки нарушения репаративной регенерации отмечались даже на фоне противовоспалительной терапии.
Наблюдалась реэпителизация дефекта, но гистоархитектоника эпителия была нарушена, не завершена его дифференцировка, тканевое ремоделирование происходило по пути преждевременного склерозирования грануляционной ткани и бокаловидной трансформации или метаплазии эпителия.
Отсутствие полноценного мерцательного эпителия в зоне раневого дефекта обусловливает появление функционально неактивных, так называемых застойных зон, в которых значительно снижен мукоцилиарный клиренс.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Литература / References:
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.
