Изучение микрофлоры полости носа пациентов с хроническим полипозным риносинуситом методом масс-спектрометрии микробных маркеров

Несмотря на возрастающее количество фундаментальных исследований и результаты клинических наблюдений, патогенез полипозного риносинусита (ПРС) до настоящего времени окончательно не выяснен.

Начиная с 60—70-х годов прошлого столетия, внимание исследователей привлечено к изучению значения бактериальной, вирусной и микотической сенсибилизации в развитии хронических риносинуситов и полипов носа [1, 2].

В силу ряда причин исследование микробиоты полости носа классическими методами в условиях клинической бактериологической лаборатории сильно затруднено или полностью невозможно. Для реализации этих задач необходимы возможности специализированных лабораторий, обладающих арсеналом культуральных и некультуральных методов, позволяющих обеспечить количественный анализ полимикробной инфекции одного больного. Как правило, это требует значительных материальных и временны́х затрат, несовместимых со стоимостью и временем пребывания больного в стационаре. В связи с этим возникает необходимость внедрения новых экспресс-методов диагностики инфекционного статуса пациента. Таковым можно считать метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), позволяющий в ускоренном режиме, минуя стадию культивирования и тестовых ферментаций, определить спектр доминирующих микроорганизмов (более 10⁴ клеток в пробе) по молекулярным маркерам — клеточным высшим жирным кислотам, альдегидам и стеринам (табл. 1) [3—5].

Суть исследования состоит в прямом извлечении с помощью химической реакции высших жирных кислот из подлежащего исследованию образца, их разделении на газовом хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализе состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Хроматограф соединен с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных. При этом сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени подготовки проб и расчета данных — не более 2,5 ч.

Внедрение МСММ позволяет сократить время и стоимость исследования, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. В этом методе применен математический аппарат количественного реконструирования состава микроорганизмов в очаге воспаления по составу их маркеров в биопробе, что позволяет контролировать инфекцию в динамике заболевания, а также эффективность лечения [6, 7].

Цель исследования—изучить состав микрофлоры полости носа у пациентов с ПРС методом газохроматографического масс-спектрометрического (ГХ-МС) детектирования молекулярных маркеров бактерий.

Во время предоперационной подготовки у пациентов с хроническим ПРС проводили забор материала из полости носа бактериологическими тампонами, которые хранили в замороженном состоянии (при температуре –5 °С). Для ГХ-МС-анализа вату с тампона переносили в реакционный сосуд (виал) и подвергали кислому метанолизу в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение 45 мин при температуре 80 °C. Полученные в результате реакции метанолиза микробных липидов жирные кислоты в виде метиловых эфиров двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N, О-бис(триметилсилил)трифторацетамида в течение 15 мин при температуре 80 °C для получения триметилсилильных эфиров гидроксикислот и стеролов. В реакционный сосуд добавляли 40 мкл гексана, затем 2 мкл смеси вводили в инжектор ГХ-МС-системы 5850/5973 Agilent Technologies (США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Agilent.

Анализ и обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам осуществляли по технологии «Оценка микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» (разрешение Росздравнадзора Ф.С. 2010/038 от 24.02.2010). Таким способом определяли эффективную (т.е. соответствующую измеренной в данный момент концентрации маркера) численность микроорганизмов разных таксонов, в том числе анаэробов, актинобактерий, дрожжей, грибов и вирусов — всего 170 таксонов, введенных в программу скриннига маркеров. В число определяемых по маркерам микроорганизмов входят не только те, что присутствуют в момент отбора пробы на поверхности очага воспаления, но и находящиеся внутри слоя ткани, из которого химические вещества отмирающих микроорганизмов могут поступать с экссудатом.

Нерациональное употребление антибиотиков, назначаемых по данным культурального теста на чувствительность, приводит к увеличению антибиотикорезистентных микробных штаммов, а также губительно действует на нормальную микробиоту организма. Более того, многочисленные данные показывают, что колонизация слизистых оболочек в норме является полимикробной [8, 9], а любая инфекция — полиэтиологичной [3]. В этой ситуации тактика антибиотикотерапии должна учитывать качественную и количественную приоритетность отдельных видов в совокупном инфекционном сообществе. Для реализации такого подхода необходимо применение некультуральных молекулярных методов, которые получили развитие в конце прошлого века.

Используя метод МСММ, оказалось возможным установить по мазкам из полости носа наличие микроорганизмов, принадлежащих к 57 таксонам.

По результатам анализа микробного сообщества пациентов (n=26) по сравнению со здоровыми донорами (n=10) обнаружено систематическое клинически значимое (более чем в 10 раз по сравнению с нормой) увеличение численности бактерий преимущественно 2 таксонов, а именно анаэробных видов Eubacterium/Clostridium, Propionibacterium freundenreihii/Cl. Subterminale, вирусов герпеса и некоторых других микроорганизмов (рис. 1). Увеличение представительства условно-патогенных бактерий семейства Enterobacteriacea на слизистой оболочке носа при ПРС свидетельствует о дисбиотических изменениях в полости носа при данной патологии и их несомненной роли в развитии воспалительного процесса. Одновременно установлено устойчивое угнетение роста лактобактерий.

Выявлено увеличение общей численности условно-патогенных микроорганизмов. Этиологически значимыми при ПРС являются стафилококки, стрептококки (Streptococcus pneumoniae), энтеробактерии и нейссерии.

Есть данные о сенсибилизирующем эффекте стафилококков, стрептококков, кишечной палочки, протея, нейссерии, а также вирусных инфекций и грибов. При этом ведущее значение в развитии полипов носа придается Staphylococcus aureus и «суперантигену» золотистого стафилококка [1, 8].

Концентрация маркеров другой группы микроорганизмов не превышала в среднем уровень колонизации слизистой зева у доноров. К ним относятся представители родов Staphylococcus,Lactobacillus,Streptococcus, Pseudonocardia,Stenothrophomonas, а также Corynebacterium и др. Микроскопические грибы (не кандида) — плесневые, дерматофиты и др. оказываются в дефиците у пациентов.

Метод МСММ дает возможность определить концентрацию липополисахарида (эндотоксина грамотрицательных бактерий) путем пересчета суммы гидроксикислот из состава его липида А, по которым детектируются конкретные бактерии этого типа — Pseudomonas, Moraxella, Bacteroides и др. Его концентрация составляет 0,1—3 нмоль в тампоне и превышает норму в 30 раз у пациентов по сравнению с группой доноров.

Неэффективность антибиотиков объясняется, с одной стороны, отсутствием чувствительности основного возбудителя к терапии, с другой — присутствием грибковой флоры.

Применение метода МСММ объясняет этот кажущийся парадокс. Как известно, выбор антибиотика осуществляется исходя из результатов посева материала на питательные среды, с помощью которых определяются стрептококки, стафилококки и непатогенные нейссерии. Количественные данные метода МСММ показывают, что эти микробы действительно присутствуют в клиническом материале (рис. 2), однако их количество в основной и контрольной группах одинаково. Это указывает на нормальную составляющую микробиоты, а истинными инфекционными агентами являются те, которые обнаруживают наибольшую кратность увеличения численности у больных по сравнению с контролем. Как видно из табл. 2, наибольшая кратность увеличения концентрации маркеров микроорганизмов отмечена у анаэробов (примерно в 30 раз увеличивалась численность бактерий группы Eubacterium/Clostridium). Из этого следует, что эффект антибиотикотерапии будет положительным, если она будет направлена против истинных возбудителей.

В колонке «проба» приведена расчетная численность микроорганизмов в клетках на 1 г мазка, ∙10⁵.

Применение метода МСММ у больных ПРС позволяет точно определить баланс микрофлоры с учетом разновидностей определяемых микроорганизмов из малого количества исследуемого материала, что значительно сокращает сроки их распознавания, расширяет возможности проведения адекватной терапии и контроля ее эффективности.

Учитывая данные МСММ, полученные в этом исследовании, можно предположить, что доминанты инфекции (Clostridium, Eubacterium, другие анаэробы) оказываются невосприимчивыми к назначаемым препаратам. Напротив, угнетение минорной составляющей инфекции ( Staphylococcus,Streptococcus, non-pathogenic Neisseria) стимулировало конкурентное развитие некультивируемой основной группы микробных агентов.

Проведенная оценка микрофлоры пациентов с ПРС показала широкий диапазон аэробных и анаэробных микроорганизмов, общее количество которых превышает норму, принятую для здоровых людей средней полосы России.

Полученные предварительные результаты исследования позволяют расширить наши представления об этиологии ПРС и свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований в данном направлении.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Д.

Сбор и обработка материала: А.М., А.В.

Статистическая обработка данных: В.И.

Написание текста: А.М., В.И.

Редактирование: В.Д., А.В.