Иммуноморфологические аспекты патогенеза хронических фарингитов

Хронический гипертрофический фарингит занимает одно из ведущих мест в структуре ЛОР-патологии и характеризуется длительным и упорным течением, значительно влияющим на качество жизни пациентов, что определяет актуальность изучения пато- и морфогенеза данного заболевания для разработки патогенетически оправданной терапии. По современным представлеиям, появление лимфоидных гранул на задней стенке глотки трактуется как компенсаторная гиперплазия местной лимфоидной ткани после адено-тонзиллэктомии или рассматривается как компенсаторно-приспособительная реакции при вторичном иммунодефиците лимфоэпителиальных органов глотки в уловиях дисбиоза [1, 2, 3]. Развитие гипертрофического фарингита в детском возрасте зачастую оказывается составной частью лимфопролиферативного синдрома, при этом особая роль отводится герпес-вирусной инфекции и острым респираторным заболеваниям верхних дыхательных путей [4, 5]. Гипертрофический фарингит взрослых остается менее изученным, хотя не исключено, что он попадает в сферу действия тех же факторов, что и в детском возрасте, и что на него распространяются те же этиопатогенетические представления. Сочетанность воспалительных и иммунологических (лимфоидная гиперплазия) реакций при гипертрофическом фарингите может найти объяснение в современной иммунологической концепции о единстве и взаимодействии механизмов и структур врожденного и адаптивного иммунитета [8]. Цель исследования - морфофункциональная оценка лимфоидных гранул на основе иммуногистохимического фенотипирования их клеточных структур и выявления рецепторов врожденного иммунитета.

Исследован биопсийный и операционный материал 35 взрослых больных в возрасте от 20 до 70 лет с клиническим диагнозом «гипертрофический фарингит». Длительность заболевания составила от 8 месяцев до 20 лет.

Объектом исследования служили гранулы задней стенки глотки, боковые валики и небные миндалины. Пациенты были разбиты на две группы; первую группу составили пациенты, у которых в анамнезе была выполнена тонзиллэктомия или аденотонзиллэктомия - 12 человек; во вторую группу вошли пациенты без предшествующих операций на органах лимфоглоточного кольца - 23 человека (у 16 пациентов второй группы хронический фарингит сочетался с хроническим тонзиллитом и в семи случаях наряду с биопсией гранулярных образований была выполнена тонзилэктомия). Операционный и биопийный материал фиксировали в нейтральном забуференном формалине, заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 микрон окрашивали гематоксилином и эозином, покрофуксином по ван Гизону, метилгрюн-пиронином по Браше, толуидиновым синим и реактивом Шиффа. Иммуногистохимическое исследование выполняли на серийных парафиновых срезах в соответствии с протоколами фирм-производителей моно- и поликлональных антител, при необходимости проводили высокотемпературное восстановление антигенных детерминант. Панель испольуемых антител включала основные дифференцировочные маркеры T и B лимфоцитов (CD3, CD5 и CD20, соответственно), макрофагов (CD68), маркер пролиферации (Ki67), маркер молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR), антитела к толл-подобным рецепторам врожденного иммунитета (TLR2, TLR4, TLR9), ко-рецептору врожденного иммунитета (CD80), высокомолекулярному цитокератину. Для визуализации реакций использовали готовые тест-системы с универсальными вторичными антителами мечеными хромогеном (HRP-polymer Detection system, BioGenex: хромоген - 3,3-диаминобензидин). Позитивные результаты иммуногистохимических реакций учитывали при наличии двух негативных контролей на специфичность и отсутстве активности эндогенной перексидазы.

Клиническая характеристика гипертрофического фарингита у больных обеих групп не имела существенных различий, хотя в клиническом течении имели место некоторые особенности.

Все пациенты первой группы отмечали боль в ротоглотке, которая обычно носила непостоянный характер; была как односторонней так и двусторонней, усиливалась в периоды обострений. Фарингоскопия позволяла визуализировать беспорядочно разбросанные в виде гранул участки гиперплазированной лимфоидной ткани и увеличенные тубофарингеальные валики, расположенные за задними небными дужками. В момент обострения указанные изменения сопровождались гиперемией и отеком слизистой оболочки.

Ведущей жалобой пациентов второй группы являлось першение и чувство комка в горле. Некоторые больные отмечали также сухость и поверхностный кашель. У двух пациентов с гипертрофией лимфоидной ткани боковых валиков боль иррадиировала в уши. Отмечалось или упорное рецидивирующее течение заболевания (обострения от 3 до 7 раз в год), или непрерывно-рецидивирующее течение даже без кратковременного улучшения.

Общепринятая терапия, включающая в себя местное применение противовоспалительных средств, местное и системное применение современных антибиотиков, не давала стойкого положительного результата у пациентов обеих групп.

При гистологическом исследовании биопсированного материала больных первой группы установлено, что в большинстве случаев гранулы представляли собой очаговые скопления неинкапсулированной лимфоидной ткани, располагающейся непосредственно под эпителием. Лимфоидная ткань имела строение диффузной лимфоидной ткани с наличием посткапиллярных венул с высоким эндотелием, среди которых встречались фолликулярные структуры. Отмечалось полнокровие лимфоидной ткани, отечность и проникновение единичных лимфоцитов в покровный эпителий, который имел характер многослойного плоского эпителия. Лимфоциты имели тенденцию концентрироваться в субэпителиальной зоне, при этом отмечалось увеличение числа интраэпителиальных лимфоцитов. (рис. 1).

Рисунок 1. Лимфоидная гранула в составе слизистой оболочки глотки: полнокровие, отек собственной пластинки, наличие интраэпителиальных лимфоцитов в покровном эпителии. Гематоксилин-эозин, ув. 50.

В ряде случаев среди диффузной лимфоидной ткани отмечалось образование вторичных фолликулов со светлыми реактивными центрами (рис. 2), которые принято называть герминативными центрами (центрами размножения по Fleming' у).

Рисунок 2. Вторичный лимфатический фолликул с герминативным центром в составе гранулы. Деталь предыдущего. Гематоксилин-эозин, ув.200.

Герминативные центры были представлены в основном лимфобластами и плазмоцитоидными клетками со слабой пиронинофильной реакцией (реакция Браше). Имели место митозы и единичные макрофаги - крупные клетки со светлой цитоплазмой и наличием внутриклеточных включений. При ИГХ исследовании лимфоциты диффузной лимфоидной ткани экспрессировали CD3 и CD5 T-клеточные маркеры, среди них встречались CD20-позитивные B лимфоциты главным образом в субэпителиальной локализации. Основным местом скопления B клеток (по экспрессии CD20) оказались герминативные центры вторичных лимфатических фолликулов. Макрофаги в составе герминативных центров экспрессировали молекулу CD68 - маркер моноцитарно-макрофагальной линии, а лимфоциты герминативных центров проявляли высокую пролиферативную активность, судя по экспрессии Ki67 (рис. 3).

Рисунок 3. Экспрессия молекулы Ki67 клетками герминативного центра вторичного фолликула лимфоидной гранулы. Иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 400.

За пределами первичных и вторичных фолликулов скопление лимфоцитов носило диффузный характер с наличием большого количества сосудов. Эти сосуды были представлены как венулами с высоким эндотелием так и лимфатическими коллекторами.

Гистологическое исследование биоптатов от больных второй группы выявило признаки текущего воспаления собственной пластинки слизистой оболочки в виде полнокровия, отека, инфильтрации клетками воспаления, на поверхности слизистой оболочки определялся слизистый экссудат с наличием сепгментоядерных лейкоцитов и лимфоцитов. Следует отметить, что в 10% случаев удаленные гранулы при гистологическом исследовании оказались гиперплазированными малыми слюнными железами (рис. 4).

Рисунок 4. Сиалоаденит малой слюнной жлезы при хроническом гипертрофическом фарингите. Гематоксилин-эозин, ув. 100.

Слюнные железы были найдены и в первой группе у трех пациентов при наличии лимфоидных гранул. Лимфоидные гранулы располагались в отечной полнокровной слизистой оболочке, рыхло инфильтрированной клетками воспаления. Следует отметить, что отек захватывал не только собственную пластинку, но и покровный плоский эпителий. При этом межклеточные пространства становились хорошо заметными, что отчетливо видно на полутонких срезах. Обращало внимание проникновение в пласт единичных лимфоцитов, которое однако не носило характер лимфоэпителиального симбиоза. Кроме того в структуре покровного эпителия обнаруживались койлоциты- эпителиальные клетки с перинуклеарным пустым пространством, которые считаются морфологическим маркером вирусной инфекции. По гистологическому строению лимфоидные гранулы задней стенки глотки как и в первой группе имели признаки органоидных образований, то есть состояли из диффузной и фолликулярной лимфоидной ткани с аналогичным распределением T и B клеточных популяций при иммуногистохимическом фенотипировании и соответствовали вторичным лимфоэпителиальным органам. Покровный эпителий над некоторыми лимфоидными гранулами имел тенденцию к ороговению верхних отделов пласта, а в субэпителиальной ткани отмечались явления склероза, что указывало на хронический характер процесса. В одном наблюдении очаговое скопление диффузной лимфоидной ткани имело в своем составе ретенционную кисту, выстланную плоским эпителием и выполненную роговым детритом.

Следует отметить, что тканевые биоптаты, присланные как лимфоидные гранулы, в этой группе наблюдений характеризовались более выраженными воспалительными изменениями в виде отека, полнокровия и лейкоцитарной инфильтрации. Их границы выглядели размытыми а в целом эти неинкапсулированные скопления лимфоидных клеток напоминали хронический воспалительный инфильтрат, особенно если гранула имела распластанную форму, приближаясь к бляшке.

Отмеченнная выше органоидность особенно ярко была выражена в гистологической архитектонике боковых валиков, которые состояли как из фолликулярной так и диффузной парафолликулярной лимфоидной ткани. В составе последней имелись посткапиллярные венулы с высоким эндотелием (HEV), что делало ее похожей на парафолликулярную зону небных миндалин или паракортикальную зону лимфатических узлов. В основании небных валиков отмечалось большое количество лимфатических сосудов, однако в отличие от лимфатических узлов, лимфоидная ткань боковых валиков не имела капсулы, а ее эпителиальное покрытие, организованное наподобие эпителия, покрывающего небные миндалины с наличием участков лимфоэпителиального симбиоза указывало на лимфоэпителиальную природу этих лимфоидных образований. ИГХ исследование выявило наличие T- и B-зависимых зон аналогично структуре удаленных небных миндалин.

Небные миндалины, удаленные у больных фаринготонзиллитом при гистологическом и ИГХ исследовании во всех случаях хронического гипертрофического фарингита (гранулярного фарингита) обнаруживали типичные изменения, характеризующие иммунный ответ по гуморальному типу, а именно гиперплазию вторичных фолликулов с появлением крупных герминативных центров, представленных центробластами и центроцитами с высокой экспрессией молекулы Ki67, документирующей пролиферативную активность B клеток. Обращало внимание наличие митозов и обилие крупных макрофагов, поглощающих клеточный детрит (картина «звездного неба»). Такие же крупные вторичные фолликулы с высокой пролиферативной активностью B клеток герминативных центров обнаруживались и в боковых валиках. По данным литературы, вторичные лимфоидные фолликулы документируют идущий лимфоцитопоэз, являясь местом клональной пролиферации В-клеток типа клеток памяти [7].

Покровный эпителий небных миндалин на люминальной поверхности сохранял характер многослойного плоского неороговевающего с признаками умеренного акантоза. На уровне устья крипт был инфильтрирован лимфоцитами и лейкоцитами, при этом значительное количество лимфоцитов находилось в просвете крипты. Смешиваясь с детритом, по мере углубления крипты в ткань небной миндалины, криптальный эпителий приобретал характерные черты ретикулярного эпителия с образованием сетчатой структуры, ячейки которой содержали лимфоидные клетки - картина лимфоэпителиального симбиоза. Аналогичную структуру имел и покровный эпителий боковых валиков, образующий зону лимфоэпителиального симбиоза на уровне крипт, что документировала экспрессия цитокератина.

По данным ИГХ исследования, картина ретикуляции эпителия над лимфоидной гранулой при гранулёзном фарингите наблюдалась в случае наличия в грануле вторичного лимфатического фолликула. Этот феномен чаще встречался в I группе больных и особенно был выражен в гипертрофированных боковых валиках. В остальных случаях гипертрофического фарингита эпителий, покрывающий гранулу, представленную диффузной лимфоидной тканью, содержал интраэпителиальные лимфоциты и сегментоядерные лейкоциты, а в субэпителиальной зоне отмечались признаки текущего воспаления (полнокровие, отек, лейкоцитарная инфильтрация). В 10% наблюдений лимфоидную гранулу клинически имитировали гиперплазированные малые слюнные железы с явлениями гиперсекреции и соответствующими признаками катарального воспаления (микросиалоаденит). Таким образом, морфологическую основу гипертрофического фарингита по данным морфологического и иммуногистохимического ислледования составили два явления: реактивные воспалительные изменения слизистой оболочки задней стенки глотки, включая микросиалоадениты, и гиперплазия местной лимфоидной ткани как проявление иммунологических процессов, отражающих иммунные ответы по гуморальному и клеточному типу. При этом иммунологические реакции были отчётливее выражены в I группе больных с аденотонзиллэктомией в анамнезе, что подтверждает компенсаторный характер гиперплазии лимфоидных фолликулов задней стенки глотки и боковых валиков. Можно допустить, что наличие гиперплазированных лимфоидных гранул при хроническом тонзиллите (II группа), служит, по-видимому, косвенным указанием на местный иммунодефицит, служащий побуждающим фактором для включения в иммунный ответ дополнительных (факультативных лимфоидных структур), или указывает на чрезмерную антигенную нагрузку на лимфоидные структуры носо- и ротоглотки.

Четко прослеживаемая взаимосвязь между воспалительными и иммунологическими процессами при гипертрофическом фарингите побудила нас к поиску Толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета, распознающих патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) и запускающие сигнальный путь активации клеточного генома на экспрессию провоспалительных и иммуномодулирующих цитокинов [6]. Искомые рецепторы взаимодействуют с PAMPs микрофлоры верхних дыхательных путей: TLR2 распознает и активируется глико- и липопротеинами стенок граммпозитивных бактерий, TLR4 - липополисахаридам (ЛПС) клеточных мембран граммотрицательных бактерий, TLR9 распознает ДНК микроорганизмов, содержащую неметилированные CpG-митивы. Экспрессия упомянутых Толл-подобных рецепторов обнаружена в обеих группах на эпителиальных клетках выстилки слизистой оболочки, покрывающей гранулы и боковые валики, при этом наиболее выражена экспрессия TLR4 и TLR9 клетками ретикулярного эпителия в участках лимфоэпителиального взаимодействия аналогично экспрессии данных рецепторов в зонах лимфоэпителиального симбиоза крипт небных миндалин при хроническом тонзиллите (рис. 5, 6).

Рисунок 5. Экспрессия TLR4 клетками эпителия и субэпителиальными лимфоцитами лимфоидной гранулы при гипертрофическом фарингите. Иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув.1000 (иммерсия).

Рисунок 6. Экспрессия TLR9 эпителиальными клетками зоны ЛЭС лимфоидной гранулы. Иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 1000 (иммерсия).

Кроме эпителия Толл-подобные рецепторы выявлялись на клетках эндотелия мелких сосудов, в том числе венул с высоким эндотелием, дендритных клетках герминативных центров вторичных фолликулов, сегментоядерных лейкоцитах (рис. 7).

Рисунок 7. Экспрессия TLR9 эндотелиальными клетками мелких сосудов и клетками эпителия. Иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин. Ув. 400.

Убедительных различий в экспрессии изученных Толл-подобных рецепторов по выделенным группам выявить не удалось. Наиболее выраженная экспрессия TLR9 выявлена в случаях с наличием в составе покровного эпителия койлоцитов, указывающих на вирусную инфекцию. Следует отметить, что клетки, экспрессирующие Толл-подобные рецепторы, обнаруживали также высокую экспрессию молекулы CD80, которая является ко-стимулирующим фактором, обеспечивающим взаимодействие с молекулами CD28 и CD40 T и B лимфоцитов, реализуя взаимодействие врожденного и адаптивного иммунитета.

Проведенное морфологическое и иммуногистохимическое исследование показало также, что лимфоидные гранулы и боковые валики слизистой оболочки глотки функционируют в физиологическом единстве с остальными лимфоидными образованиями (миндалинами) лимфаденоидного кольца Вальдейера и могут реагировать одновременно как эффекторная (рабочая) и как индуктивная область MALT-системы.

Заключение:

Морфологическую основу гипертрофического фарингита составляет гиперплазия лимфоидной ткани задне-боковых отделов глотки, возникающая как проявление сочетанного иммунного ответа, следующего за реактивными воспалительными изменениями местной слизистой оболочки. Экспрессия Толл-подобных рецепторов клетками покровного эпителия и другими нелимфоидными клетками указывает на участие данных рецепторов врожденного иммунитета в инициации воспалительной реакции слизистой оболочки глотки, а экспрессия этих рецепторов дендритными клетками герминативных центров может свидетельствовать об иммуномодулирующем влиянии клеток врожденного иммунитета на лимфоидные структуры адаптивного иммунитета.

В 10% случаев клинически документированного гипертрофического фарингита макроскопическую картину лимфоидных гранул имитирует сиалоаденит малых слюнных желёз задней стенки глотки.

Лимфоидные гранулы и боковые валики слизистой оболочки заднее-боковой стенки ротоглотки функционируют в физиологическом единстве с остальными лимфоидными образованиями кольца Вальдейера и могут реагировать одновременно и как эффекторная и как индуктивная область MALT-системы.