Иммуногистохимический (ИГХ) анализ в настоящее время стал неотъемлемой частью патолого-анатомического исследования как для решения задач дифференциальной диагностики, так и для определения маркеров сопроводительной диагностики для таргетной и иммунотерапии в соответствии с действующими клиническими рекомендациями Минздрава России. Для поддержания постоянного высокого качества ИГХ-исследований во всех медицинских организациях России, проводящих прижизненную диагностику биопсийного (операционного) материала (далее медицинские организации), продолжает оставаться актуальным использование внутреннего и внешнего контроля качества этих исследований. ИГХ-исследования в Российской Федерации имеют 25-летнюю историю практического применения в медицинских учреждениях. Однако внедрение новых маркеров, систем визуализации, инструментальных платформ и расходных материалов, изменения в составе персонала патолого-анатомических отделений вызывают возникновение проблем, приводящих к получению результатов, непригодных для использования в клинической практике. Совершенно очевидно, что не все проблемы могут быть выявлены и устранены только с использованием обязательной внутрилабораторной системы контроля качества ИГХ-исследований.

Для поддержания необходимого уровня качества ИГХ-исследований в 2018 г. при поддержке Минздрава России на базе ФГБОУ ДПО «РМАНПО» Минздрава России был создан Центр контроля качества иммуногистохимических исследований (ЦКК ИГХИ), который в том же году провел первый регулярный раунд по маркерам рака молочной железы (РМЖ) для 24 медицинских учреждений. Начиная с 2019 г. ЦКК ИГХИ регулярно проводит раунды по различным нозологиям и маркерам, при этом количество медицинских организаций, сотрудничающих с центром, ежегодно увеличивается [1—5].

У ЦКК ИГХИ активно работает сайт (https://ihccqc.rmapo.ru/) и Telegram-канал (htt//t/me/iccqc), где представлена вся актуальная информация о центре: принципы работы, члены совета экспертов, график раундов, образец типового договора, принципы оценки образцов, «Реестр свидетельств, выданных медицинским организациям по итогам успешного прохождения раундов контроля качества ИГХ-исследований». В 2023 г. к совету экспертов присоединились наши коллеги ведущие патологоанатомы из Казахстана и Беларуси.

Совет экспертов под руководством академика РАН Г.А. Франка коллегиально разработал и принял критерии оценки, которыми в своей работе руководствуются эксперты центра.

Результаты, пригодные для использования в клинической практике:

Оптимально — отсутствие недостатков и соответствие принятым в мире стандартам идеального окрашивания.

Хорошо — имеется ряд небольших недостатков, не мешающих правильной постановке диагноза.

Результаты, непригодные для использования в клинической практике:

Погранично — имеются недостатки, не позволяющие отличить истинный сигнал от сильного фона, отмечены перекрестные реакции, значительные артефакты.

Плохо — наблюдаются ложноположительные или ложноотрицательные реакции хотя бы в одном образце.

Важнейшая часть работы экспертов — индивидуальная анонимная оценка препаратов, предоставленных участниками с дальнейшим коллегиальным обсуждением полученных результатов для формирования итоговой оценки и индивидуальных рекомендаций каждому участнику, внедрение которых поможет достижению оптимальных данных ИГХ-исследования. Пятилетний опыт работы центра наглядно показал, что медицинские организации, внедрившие в практическую работу рекомендации совета экспертов, сумели существенно улучшить свои результаты при повторном прохождении раундов. Анализ результатов медицинских организаций, регулярно участвующих в раундах контроля качества, демонстрирует стабильное воспроизведение данных, пригодных для использования в клинической практике. В качестве примера можно отметить, что патолого-анатомические отделения многопрофильных онкологических центров Департамента здравоохранения города Москвы, регулярно участвующие в различных раундах контроля качества, в раунде 2023 г. по маркерам РМЖ (рецепторы эстрогенов, белок Ki-67, рецептор HER2/neu) показали пригодные для клинического использования результаты в 100% случаев, причем 60—80% из них имели оптимальное качество (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Результаты многопрофильных онкологических центров Департамента здравоохранения города Москвы. Раунд РМЖ №230832 2023 г.

Примечание. Здесь и далее: МО — медицинская организация.

Таблица 2. Результаты многопрофильных онкологических центров Департамента здравоохранения города Москвы. Раунд РМЖ №230832 2023г. Маркеры ER, HER2/neu, Ki-67

Центр ведет общедоступный «Реестр свидетельств, выданных медицинским организациям по итогам успешного прохождения раундов контроля качества иммуногистохимических исследований», ознакомиться с ним можно как на сайте ЦКК ИГХИ ФГБОУ ДПО «РМАНПО» Минздрава России https://ihccqc.rmapo.ru/poleznye-materialy/reestr-sertifikatov/, так и на официальном сайте программы RUSSCO https://www.cancergenome.ru/. Это позволяет получить доступ к этой информации и клиническим специалистам.

В 2023 г. было проведено 11 раундов контроля качества, в которых участвовали 104 медицинские организации. В 9 раундах контроля качества аналитического этапа был проконтролирован широкий спектр иммуногистохимических маркеров: 40 маркеров, применяющихся в диагностике рака молочной железы, легкого, желудочно-кишечного тракта, яичников, меланомы, опухолей мягких тканей, нейроэндокринных опухолей. В этих раундах участвовали 89 медицинских организаций. В 2 цифровых раундах по оценке постаналитического этапа ИГХ-исследования приняли участие 15 медицинских организаций. В этих раундах были проконтролированы результаты интерпретации участниками сканированных образцов препаратов с различной экспрессией PD-L1 в трех локализациях (рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легкого) и сканированных образцов препаратов стандартной панели РМЖ. Для цифровых раундов центр в 2023 г. ввел новый формат проведения раундов: медицинская организация могла заключить договор в течение всего года и получить доступ к сканированным изображениям ИГХ-реакций. Участники отметили удобство такого формата, в связи с этим Центром в 2024 г. планируется расширить спектр раундов, проводимых в цифровом формате.

Анализ результатов, непригодных для использования в клинической практике, позволил выявить наиболее типичные недочеты в работе медицинских организаций. Ключевым недостатком является отсутствие или некорректная работа внутрилабораторной системы контроля качества, в том числе отсутствие или неполный набор собственных позитивных и негативных контрольных образцов для каждого применяющегося маркера. Это приводит к нарушению процедуры валидации новых реагентов и протоколов и отсутствию должного контроля использующихся протоколов. В ряде медицинских организаций используются не рекомендованные ведущими экспертными сообществами клоны антител, например, MM1 для Ki-67. Много проблем возникает при использовании концентрированных антител даже для маркеров, которые рутинно применяются в практике патолого-анатомических отделений. Отмечены проблемы в использовании антител к S100, CD68, PanCK, что наглядно демонстрирует недостаточное внимание к подбору и выполнению процедуры разведения антител, метода демаскировки и протоколу постановки реакции с использованием позитивных и негативных контролей. В раунде, касающемся рака яичников, были отмечены сложности с подбором протокола для антител к белку p53 с целью правильного выявления мутантного типа экспрессии, характерного для миссенс-мутации. Еще одной причиной получения неудовлетворительных результатов является недостаточный опыт использования персоналом иммуногистостейнеров открытого типа, требующих подбора и отработки собственного протокола лаборатории для каждого антитела. В 2023 г. возникла проблема корректного применения нестандартизованного гематоксилина на стейнерах закрытого типа, поскольку избыточное окрашивание гематоксилином маскирует специфическую ядерную и мембранную реакции слабой интенсивности и приводит к потере количества окрашенных клеток при их подсчете. Для решения вышеназванной проблемы необходима обязательная валидация докрашивания гематоксилином в каждой конкретной медицинской организации. Участие в раундах контроля качества в 2023 г. выявило проблемы, связанные с использованием предметных высокоадгезивных стекол от разных производителей. Качество стекол в некоторых партиях оказалось нестабильным, что существенно повлияло на проведение исследований.

Принимая во внимание высокую социальную значимость заболеваемости РМЖ, центр ежегодно проводит раунды по контролю качества ИГХ-исследований данной нозологии. Учитывая появление новых лекарственных препаратов и критериев оценки экспрессии маркеров РМЖ, Центр контроля качества в 2023 г. провел масштабный раунд-исследование по контролю аналитического этапа ИГХ-исследования экспрессии рецепторов эстрогенов (ER), рецептора HER2/neu и Ki-67. В раунде-исследовании приняли участие 50 медицинских организаций из всех федеральных округов Российской Федерации. Востребованность такого раунда связана с появлением новых подходов к определению ER- и HER2-статуса. В Клинических рекомендациях Минздрава России подчеркнута необходимость обязательного указания группы опухолей молочной железы с низкой экспрессией ER (1—10%), что требует высокого качества ИГХ-определения рецепторов эстрогенов для исключения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов. Для лечения РМЖ в 2023 г. появился новый лекарственный препарат трастузумаб-дерукстекан, который может быть назначен пациенткам при низкой экспрессии HER2/neu, а значит возникла необходимость особого внимания к определению уровня экспрессии 1+ в HER2-слабоположительных опухолях. Статус HER2 1+ определяется при наличии более чем 10% клеток опухоли со слабой и частичной позитивной реакцией на мембранах клеток инвазивного рака. Это сложное для определения пороговое значение уровня экспрессии HER2/neu требует высокого качества аналитического этапа ИГХ-исследования.

Анализ итогов этого раунда-исследования выявил, что из 50 медицинских организаций (участников) 32 (64%) продемонстрировали результаты, пригодные для использования в клинической практике, все оптимальные результаты показали лишь 10 (20%) участников, 18 (36%) имели по одному результату, непригодному для использования в клинической практике, и 4 (8%) показали отрицательные результаты по всем исследованным маркерам этого раунда (табл. 3 и рис. 1).

Таблица 3. Результаты раунда по маркерам РМЖ №230833 2023 г.

Рис. 1. Раунд по маркерам РМЖ №230833 2023 г. Количество медицинских организаций, получивших соответствующую оценку (плохо, погранично, хорошо, оптимально).

Наибольшие проблемы у участников этого раунда вызвало исследование экспрессии рецепторов эстрогенов (ER). Результаты, пригодные для использования в клинической практике, показали 36 (72%) участников, при этом оптимальные результаты — только 26 (52%). Результаты 14 (28%) медицинских организаций были признаны экспертами непригодными для использования в клинической практике (табл. 4).

Таблица 4. Результаты по маркерам ER, HER2/neu, Ki-67. Раунд РМЖ №230833 2023 г.

Основные проблемы при исследовании экспрессии ER были повторно отмечены при использовании антител клона 6F11 [6]. При использовании данного клона требуются тщательный подход к отработке условий демаскировки на контрольных образцах, подбор разведения при использовании концентрированного антитела. Избыточное окрашивание гематоксилином маскировало ядра опухолевых клеток с низкой экспрессией ER, что приводило к потере части ядер при подсчете и, в свою очередь, к неправильному определению суррогатного молекулярно-генетического подтипа РМЖ. Хотелось бы подчеркнуть, что подобные ошибки могут приводить к назначению пациенткам неадекватной лекарственной терапии (рис. 2).

Рис. 2. Варианты иммуногистохимического окрашивания антителами к ER, представленные медицинскими организациями в раунде РМЖ №230833 2023 г.

№1 — образцы шейки матки, №2—4 — образцы РМЖ с различным уровнем экспрессии ER.

а — оптимально; б — плохо (ложнонегативная реакция) — неотработанное разведение концентрированных антител; в — погранично (выраженное снижение интенсивности специфической реакции и избыточное окрашивание гематоксилином); г — погранично (выраженное снижение интенсивности специфической реакции) — неотработанные условия демаскировки, неправильно выбранный pH раствора буфера.

Результаты окрашивания срезов мультиблоков антителами к HER2/neu показали, что 41 (82%) медицинская организация продемонстрировала результаты, пригодные для использования в клинической практике, 23 (46%) — оптимальные результаты, а 9 (18%) участников показали результаты, непригодные для использования в клинической практике (табл. 4 и рис. 3).

Рис. 3. Варианты иммуногистохимического окрашивания антителами к HER2/neu, представленные МО в раунде РМЖ №230833 2023 г.

№1 — РМЖ HER2/neu 3+; №2 — РМЖ HER2/neu 2+; №3—4 — образцы РМЖ HER2/neu 1+.

а — оптимально; б — погранично (фоновое окрашивание) — неотработанное разведение концентрированных антител; в — погранично (выраженное снижение интенсивности специфической реакции и избыточное окрашивание гематоксилином); г — плохо (ложнонегативная реакция, крайне выраженная интенсивность окрашивания гематоксилином).

Неудовлетворительные результаты были выявлены при использовании клона СВ11 и концентрированных антител. Большинство участников для маркера HER2/neu использовали готовые закрытые наборы, например, HercepTest, или антитело клона 4В5 Roche-Ventana с рекомендованным протоколом постановки реакции, что, безусловно, повлияло на большое количество положительных оценок. Неудовлетворительные результаты часто были связаны с избыточным докрашиванием гематоксилином, которое не позволяло видеть слабо и частично окрашенные мембраны опухолевых клеток, т.е. возникали ложнонегативные образцы в случаях со слабоположительным уровнем экспрессии 1+. Поэтому отработка всех этапов ИГХ-реакции должна проводиться с использованием мультиблока с образцами экспрессии 0, 1+, 2+ и 3+ и рекомендуется повторное участие этих медицинских организаций в раундах контроля качества по маркеру HER2/neu.

При оценке препаратов, окрашенных антителами к Ki-67, экспертами оценивалось количество окрашенных ядер опухолевых клеток в образцах опухолей и в нормальной ткани кишки, оценивали процент окрашенных ядер и по сравнению с контрольными образцами. Так, 42 (84%) медицинские организации показали результаты, пригодные для клинической практики, при этом более чем в половине этих организаций были получены оптимальные результаты — у 24 (48%) участников, у 8 (16%) отмечены неудовлетворительные результаты (табл. 4 и рис. 4).

Рис. 4. Варианты иммуногистохимического окрашивания антителами к Ki-67, представленные МО в раунде РМЖ №230833 2023 г.

№1 — аппендикс; №2 — РМЖ Ki-67 более 60%; №3— РМЖ Ki-67 20%; №4 — РМЖ Ki-67 менее 20%.

а — оптимально; б — плохо (ложнонегативная реакция, снижение количества окрашенных ядер, фоновое окрашивание) — использованы антитела клона MM1 в готовом разведении; в — погранично (снижение интенсивности окрашивания и количества окрашенных ядер) — применены концентрированные антитела клона MM1; г — плохо (ложнонегативная реакция) — не отработано разведение концентрированных антител клона MIB1.

Ошибочное определение уровня экспрессии Ki-67 может приводить также к неправильному определению суррогатного молекулярно-генетического подтипа и назначению неадекватной схемы терапии. Поскольку этот маркер может использоваться для оценки ответа опухоли на терапию, ошибки в применении Ki-67 приведут к неправильной оценке эффективности схемы лечения. Как и ранее, наибольшие проблемы возникали у участников при использовании антитела клона ММ1 [6]. Совет экспертов повторно рекомендовал участникам замену этого клона на клон, зарегистрированный в Российской Федерации, с соответствующей отработкой протокола на внутрилабораторных контролях.

Также следует отметить получение отрицательных результатов при использовании концентрированных антител. Нередко применялось слишком большое разведение антител, что приводило к потере части ядер с положительной экспрессией, а избыточное докрашивание гематоксилином дополнительно маскировало ядра со слабоположительной реакцией и вело к неправильному подсчету процента окрашенных ядер. Часто возникали проблемы в лабораториях, использующих антитела и системы визуализации от разных производителей в иммуностейнерах открытого типа, что подтверждает отсутствие систематической валидации протоколов при замене хотя бы одного из реагентов. В образцах ряда участников совет экспертов отметил наличие артефактов, связанных с нерегулярной промывкой и техническим обслуживанием линейки оборудования, в связи с этим все медицинские организации в индивидуальных рекомендациях получили напоминание о строгой необходимости соблюдения сроков регламентного обслуживания приборов.

При сравнении результатов раундов РМЖ, проведенных в 2022 и 2023 г. отмечено [6], что для рецепторов эстрогенов в 2022 г. оптимальные и хорошие результаты продемонстрировал 61% участников, а в 2023 г. таких результатов стало больше на 11%. Для HER2/neu по сравнению с результатами прошлого года увеличилось количество медицинских организаций с оптимальными и хорошими результатами до 82% против 79% в 2022 г. Для Ki-67 в 2022 г. результаты, пригодные для клинического использования, были получены в 64% лабораторий, в 2023 г. этот показатель улучшился на 20% (табл. 5).

Таблица 5. Сравнение результатов раундов РМЖ, проведенных в 2022 и 2023 гг.

В 2023 г. в раундах контроля качества регулярно принимали участие 5 Централизованных патоморфологических отделений онкологических стационаров Москвы, сформировавших эффективную базу для оказания высокотехнологичной медицинской помощи пациентам с онкологическими заболеваниями в Москве и показывающих воспроизводимость и наличие результатов, пригодных для использования в клинической практике значительно чаще по сравнению с другими медицинскими организациями. И это еще раз демонстрирует важность и позитивные результаты регулярного прохождения внешнего контроля качества.

Необходимо отметить, что неудовлетворительные результаты, такие как отсутствие окрашивания в образцах опухолей с низким уровнем экспрессии маркеров, чаще были выявлены в медицинских организациях, впервые принимавших участие в контроле качества, а оптимальные результаты отмечаются чаще у регулярно проходящих внешний контроль качества, что еще раз показывает эффективность участия в системе внешнего контроля качества, актуальность и положительный результат от внедрения рекомендаций совета экспертов.

Раунды контроля качества 2023 г. позволили выявить наиболее типичные проблемы проведения ИГХ-исследований: ложнонегативные или ложнопозитивные реакции; низкую интенсивность реакции; избыточное окрашивание гематоксилином, маскирующие реакции слабой интенсивности; неправильное разведение концентрированных антител; использование неоптимального буфера для демаскировки; недостаточную отработку протоколов; нарушения в регламентном обслуживании инструментальных платформ. Основными причинами появления результатов ИГХ-исследования, непригодных для использования в клинической практике, являются отсутствие системы внутреннего контроля качества и специалиста, ответственного за методические аспекты проведения ИГХ-исследования, а также формально проводимая внутрилабораторная валидация протоколов окрашивания для новых реагентов. Любой новый реагент ИГХ-исследования может быть введен в рутинное практическое исследование только после получения конкордантности результатов с ранее применявшимся протоколом более чем в 95% случаев. Это требует обязательного проведения валидационных исследований по соответствующим стандартам [7, 8].

Совет экспертов отмечает, что при выполнении ИГХ-исследований нужно обращать особое внимание на работу с открытыми иммуногистостейнерами, поскольку вариабельность данных в таких системах значительно выше, чем в закрытых, что подтверждают результаты участников, использующих закрытые системы.

С глубоким сожалением Центр контроля качества вынужден отметить, что, несмотря на одобрение программы внешнего контроля качества со стороны Минздрава России в письме Минздрава России №17-2/И/2-11241 от 23.06.23, значительная часть медицинских организаций, проводящих прижизненную диагностику биопсийного (операционного) материала, еще не принимает участие в системе внешнего контроля качества. Вместе с тем количество участников программы растет из года в год и в 2023 г. составило 104, при этом значительно увеличилось число медицинских организаций, принявших повторное участие в раундах.

В 2024 г. центр планирует расширение линейки и формата проведения цифровых раундов, возможность участия в них на протяжении всего года. Также планируется раунд по контролю одного маркера по выбору участника из списка, предоставленного центром.

Отвечая на запросы и потребности медицинских организаций в 2024 г., будет проведен пилотный раунд по контролю преаналитического этапа ИГХ-исследования, поскольку от обработки биопсийного (операционного) материала напрямую зависит качество проведения всего ИГХ-исследования.

Таким образом, широкое вовлечение медицинских организаций в программу внешнего контроля качества иммуногистохимических исследований способствует:

— поддержанию системы патолого-анатомической диагностики на высоком уровне, воспроизводимости оптимальных результатов в медицинских учреждениях, проводящих патолого-анатомические исследования биопсийного (операционного) материала с применением иммуногистохимических методов;

— расширению профессиональных компетенций врачей и медицинских технологов для проведения качественной диагностики онкологических заболеваний в Российской Федерации;

— укреплению научно-практической базы патолого-анатомической диагностики для успешной реализации задач по борьбе с онкологическими заболеваниями и повышению выживаемости онкологических больных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.