Введение

Одним из приоритетов современной медицины является снижение биологического возраста и продление периода здоровой жизни [1]. Исследования когорт долгожителей способствовали фокусировке на биологическом и фенотипическом возрасте как интегративных показателях состояния здоровья и скорости старения. Эти параметры отражают совокупное влияние генетических, метаболических и экологических факторов, а их расчет доступен клиницистам с использованием стандартизированных моделей [2].

Микробиота играет ключевую роль в поддержании клеточного гомеостаза и молодости. Ее дисбаланс включен в число 12 фундаментальных механизмов старения наряду с геномной нестабильностью, укорочением теломер, эпигенетическими сдвигами, митохондриальной дисфункцией и воспалением [3]. Экспериментальные и клинические данные показывают, что коррекция дисбиоза замедляет прогрессирование данных процессов; это указывает на причинно-следственную связь между «старением» микробиоты и ускорением возраст-ассоциированной патологии [4].

Таким образом, стратегии, направленные на поддержание здорового состава микробиоты, характеризуются значительным потенциалом для продления активного долголетия и профилактики хронических заболеваний [5]. В связи с этим представляется актуальным изучение взаимосвязи представителей кишечного микробиома и фенотипического возраста у пациентов среднего и пожилого возраста.

Цель исследования — изучить взаимосвязь состава кишечной микробиоты с фенотипическим возрастом (PhenoAge) и кардиометаболическим здоровьем.

Материалы и методы

Проведен ретроспективный анализ данных 29 участников (15 женщин, 14 мужчин) в возрасте 27—68 лет (медиана возраста 50,5 [42,0—53,2] года), прошедших комплексное обследование в курорте превентивной медицины «Первая Линия» (Санкт-Петербург).

Критерии включения: удовлетворительное состояние, отсутствие острых заболеваний и обострений хронической патологии, соблюдение средиземноморской диеты, наличие информированного добровольного согласия на участие в исследовании.

Обследование включало:

— клинический осмотр с расчетом индекса массы тела (ИМТ), измерением уровня артериального давления (АД), оценкой вредных привычек и семейного анамнеза;

— лабораторные анализы: глюкоза, инсулин, гликированный гемоглобин, липидограмма, витамины (D, B9, B12, B6), гомоцистеин, С-реактивный белок, печеночные пробы, электролиты, гормоны (тиреотропный гормон, кортизол, адренокортикотропный гормон, тестостерон, пролактин), фибриноген, липаза, клинические анализы крови и мочи;

— расчет индекса инсулинорезистентности (HOMA-IR) и скорости клубочковой фильтрации по формуле CKD-EPI;

— ультразвуковое исследование органов брюшной полости, почек, щитовидной железы, брахиоцефальных артерий с оценкой толщины интима-медиа, а также проведение эхокардиографии.

На основании данных клинического и биохимического анализов крови с помощью системы PhenoAge [2] по стандартной методике рассчитывали фенотипический возраст.

Исследование микробиома проведено с использованием интегративной оценки микробно-тканевого комплекса кишечника, которая включала:

— триметиламин (ТМА), триметиламин-N-оксид (ТМАО), соотношение TMA/TMAO в моче;

— исследование зонулина в кале;

— определение содержания кальпротектина в кале;

— профилирование микробного сообщества в кале на уровне родов оценивали с использованием метода анализа 16S рРНК.

Статистическая обработка полученных данных проведена с применением пакета программ R 4.4.0. При описании исходных данных количественные показатели представляли в виде медианы и интерквартильного размаха, Me (Q₁; Q₃). В случае качественных данных указывали количество пациентов для данного значения и процент данного значения от общего количества пациентов в виде n (m%).

Различия между двумя выборками с количественными значениями определяли с помощью критерия Манна—Уитни. Для поиска различий в выборках по качественным переменным применяли точный критерий Фишера. Критический уровень значимости при проверке гипотез принимали равным 0,05. При множественных сравнениях значимость определяли методом Холма—Бонферрони.

Для выявления взаимосвязи профилей микробиоты и фенотипического возраста использовали корреляционный анализ с оценкой коэффициента корреляции Спирмена. Классическое равновесие Харди—Вайнберга неприменимо для оценки состава микробиоты по данным 16S-секвенирования.

Результаты

Средний показатель фенотипического возраста включенных пациентов (оцененный по системе PhenoAge) составил 43,1 (38,7—47,2) года. В среднем пациенты были моложе своего паспортного возраста по показателю фенотипического возраста (PhenoAge) возраста на 8,50 (4,70—12,00) года, и разница в возрасте была статистически значимой (p<0,001). Вредные привычки (курение сигарет) имели 6 (20,7%) участников исследования.

Клинико-лабораторные параметры вошедших в исследование пациентов представлены в таблице.

Клинико-лабораторные параметры у пациентов исследуемой группы

Примечание. ИМТ — индекс массы тела; АД — артериальное давление; ЛПНП — холестерин липопротеинов низкой плотности; ЛПВП — холестерин липопротеинов высокой плотности.

При проведении анализа выявлены следующие ассоциации.

Фенотипический возраст отрицательно коррелировал с распространенностью:

—Erysipelatoclostridium genus (r=–0,64, p<0,01, рис. 1);

—Lachnospiraceae ND3007 (r=–0,67, p<0,01);

—Actinobacteria class (r=–0,55, p<0,01);

—Blautia faecis spp. (r=–0,68, p<0,01).

Рис. 1. Взаимосвязь распространенности Erysipelatoclostridium с фенотипическим возрастом.

При этом распространенность Erysipelatoclostridium положительно коррелировала с уровнем зонулина в кале (r=0,86, p<0,01). Обнаружено, что фенотипический возраст положительно коррелировал с распространенностью бактерий рода Ruminococcaceae NK4A214 (r=0,69, p<0,01) и Family XIII AD3011 (r=0,7, p<0,05).

Далее выявлены значимые отрицательные корреляционные связи распространенности бактерий рода Granulicatella adiacens (r=–0, 93, p<0,01), Bacteroides massiliensis (r= –0,80, p=0,02) и Rothia mucilaginosa spp. (r= –0,64, p<0,01) с паспортным возрастом.

Уровень липазы сыворотки крови отрицательно коррелировал с распространенностью бактерий рода Rothia mucilaginosa spp. (r= –0,78, p<0,01) и положительно — с уровнем лейкоцитов (r=0,78, p=0,02) и нейтрофилов (r=0,73, p<0,01) соответственно.

Наибольший интерес представляли «бактерии-геропротекторы», ассоциированные с потенциальной возможностью предотвращать акселерацию фенотипического возраста. Наибольшей разницей между фенотипическим и паспортным возрастом обладали Barnesiella (Genus) (r=0,83, p=0,05) и Bacteroides eggerthii sp (r=0,94, p=0,01, рис. 2).

Рис. 2. Взаимосвязь распространенности Barnesiella spp. и Bacteroides eggerthii с максимальной разницей между фенотипическим и паспортным возрастом.

В нашем исследовании показатель ТМАО имел прямые корреляционные взаимосвязи исключительно с уровнем распространенности бактерий класса Vampirivibrionia (r=0,95, p<0,01).

Уровень кишечного зонулина положительно коррелировал с распространенностью:

—Erysipelatoclostridium genus (r=0,85, p<0,01);

—Colidextribacter genus (r=0,6, p<0,01);

—Fusicatenibacter genus (r=0,62, p<0,01);

—Senegalimassilia genus (r=0,85, p<0,01)

и отрицательно с:

—Alistipes putredinis spp. (r=–0,85, p<0,01);

—Odoribacter splanchnicus spp. (r=–0,79, p<0,01).

Уровень систолического АД положительно коррелировал с распространенностью следующих бактерий:

—Roseburia hominis spp. (r=0,76, p<0,05);

—Lachnospiraceae NK4A136 (r=0,6, p<0,05);

—Slackia isoflavoniconvertens spp. (r=0,73, p<0,05)

и отрицательно с:

—Negativibacillus genus (r= –0,7, p<0,05).

Уровень диастолического АД положительно коррелировал с распространенностью следующих микробов:

—Streptococcus lutetiensis, salivarius, thermophilus (r=0,66, p<0,05);

—Vampirivibrionia class (r=0,79, p<0,01);

отрицательно с:

—Hungatella genus (r= –0,92, p<0,01).

Величина ИМТ положительно коррелировала с распространенностью следующих бактерий:

—Lachnospiraceae UCG 001 (r=0,78, p<0,05);

—Negativibacillus genus (r=0,9, p<0,01).

Обсуждение

В исследовании выявлен широкий спектр бактерий, коррелирующих с фенотипическим возрастом. Средний фенотипический возраст был на 8,50 (4,70—12,00) года моложе паспортного (p<0,001), что может отражать благоприятный образ жизни участников. Снижение содержания Erysipelatoclostridium ассоциировано с молодостью, что противоречит данным о его возраст-зависимом росте и связи с проницаемостью кишечника и воспалением [6]. Продуценты бутирата Lachnospiraceae ND3007 и Blautia faecis поддерживают барьерную функцию кишечника, их содержание снижается с возрастом [7, 8]. Их низкая распространенность связана с ожирением, диабетом и метавоспалением [9, 10]. Отмечено, что Actinobacteria, участвующие в метаболизме сложных углеводов и синтезе антимикробных веществ, также ассоциированы с молодостью и представляют интерес для разработки терапевтических средств [11].

Данные о положительной корреляции фенотипического возраста с Ruminococcaceae NK4A214 и Family XIII AD3011 необходимо уточнять: первый ассоциирован с благоприятным прогнозом при инсульте [12], но его уровень снижается при диарее, обусловленной синдромом раздраженного кишечника [13], второй — с колоректальным раком и воспалением [6]. В нашем исследовании уровень Family XIII AD3011 положительно коррелировал с триглицеридами, что указывает на возможную роль в метаболических нарушениях.

Наибольшую разницу между связью с возрастом показали Barnesiella и Bacteroides eggerthii (r=0,83 и 0,94, p< 0,05). Показано, что Barnesiella укрепляет кишечный барьер, снижая риск хронического вялотекущего воспаления (inflammaging) и ассоциированных с ним заболеваний [14], поддерживая популяции продуцентов короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) [15]. Bacteroides eggerthii, продуцирующие КЦЖК, могут замедлять иммунное старение [8], но их роль в долголетии ранее не изучалась.

Повышенный зонулин, маркер проницаемости кишечника, положительно коррелировал с содержанием Erysipelatoclostridium [6] и Senegalimassilia — малоизученным родом, потенциально связанным с нарушением эректильной функции [16]. Отрицательная корреляция с содержанием Alistipes putredinis и Odoribacter splanchnicus (r=–0,85 и −0,79, p<0,01) указывает на их защитную роль. Показано, что Odoribacter splanchnicus чувствителен к хроническому стрессу [17], что подчеркивает его значение в оси «кишечник — мозг — микробиом».

Уровень систолического АД положительно коррелировал с Roseburia hominis, что противоречит раннему сообщению об отрицательной связи (ρ=−0,15, p<0,001) [18]. Положительные связи выявлены с Lachnospiraceae NK4A136, Slackia isoflavoniconvertens и Streptococcus spp. — последний ассоциирован с повышением уровня глюкозы и HOMA-IR [19], что указывает на неблагоприятные кардиометаболические эффекты. Уровень диастолического АД положительно коррелировал с Vampirivibrionia и Streptococcus, отрицательно — с Hungatella (r= −0,92, p<0,01). Кроме того, содержание Hungatella также отрицательно коррелировало с ТКИМ (r= –0,97, p<0,05), что согласуется с предполагаемым ангиопротективным эффектом, который реализуется посредством метаболизма таурина [20].

Величина ИМТ положительно коррелировала с содержанием Lachnospiraceae UCG 001 и Negativibacillus (r=0,78 и 0,90, p<0,05), ассоциированными с сердечно-сосудистым риском [21]. Рост содержания Negativibacillus наблюдался у мышей, получавших диету с переработанным мясом [22]. Содержание Dorea formicigenerans положительно коррелировало с ТКИМ и величиной HOMA-IR [20], а также с провоспалительной активностью и фибрилляцией предсердий [23].

Сообщается, что содержание Collinsella aerofaciens и Dielma ассоциировано с нарушением углеводного обмена и уровнем триглицеридов [24, 25], а Bacteroides thetaiotaomicron — с метаболическим здоровьем посредством ферментации, продукции КЦЖК и иммуномодуляции [26]. Рост содержания Prevotella при потреблении фолиевой кислоты [27] подтверждает влияние питания на микробиоту. Распространенность бифидобактерий и лактобактерий не коррелировала с показателями здоровья, возможно, из-за однородности диеты участников.

Ограничения исследования

К ограничениям исследования относятся небольшая выборка (n=29), ретроспективный дизайн, отсутствие данных о физической активности, стрессе и медикаментозной терапии. Метод анализа 16S рРНК не позволяет оценить функциональную активность микробиома. Модель PhenoAge основана на ограниченном наборе биомаркеров, а анализом охвачена только часть микробных метаболитов (триметиламин-N-оксид, зонулин), что ограничивает интерпретацию.

Несмотря на ограничения, результаты подтверждают ключевую роль микробиоты в регуляции старения и создают основу для дальнейших исследований в области персонализированной геропротекции.

Заключение

Состав кишечной микробиоты играет важную роль в регуляции фенотипического старения. Показано, что представители Bacteroidetes (Barnesiella spp. и Bacteroides eggerthii) ассоциированы с наиболее существенной разницей между биологическим и фенотипическим возрастом в сторону снижения последнего. Необходимо проведение дальнейших трансляционных микробиомных исследований на стыке клинической медицины, микробиологии и иммунологии, детально и комплексно изучающих вклад отдельных представителей микробиоты в развитие возраст-ассоциированных болезней и поддержание активного долголетия. Данный подход позволит в будущем разработать не только новые инструменты скрининга фенотипического возраста с использованием профилей микробиоты, но и персонализированные концепции модификации микробиоты с помощью диетотерапии, пробиотической терапии и, вероятно, трансплантации фекальной микробиоты, без которых не может быть реализована задача кардинального повышения продолжительности жизни человека.

Благодарности: коллектив авторов выражает благодарность идеологу курорта превентивной медицины «Первая Линия» Марии Олеговне Грудиной за создание благоприятной исследовательской атмосферы, сочетающей комфорт и профессиональный подход к поддержке научной деятельности.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Ратникова А.К.; сбор и обработка материала — Ратникова А.К., Ашихмин Я.И.; статистический анализ данных — Тишков А.В., Дикур О.Н..; написание текста — Ашихмин Я.И., Ратникова А.К.; научное редактирование — Ермоленко К.Д., Парцерняк А.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements: the authors express their gratitude to Maria Olegovna Grudina, the ideologist of the Health Care Resort “First Line,” for creating a friendly research environment that combines comfort with a professional approach to supporting scientific activities.

Authors contribution: study design and concept — Ratnikova A.K.; data collection and processing — Ratnikova A.K., Ashikhmin Ya.I.; statistical analysis —Tishkov A.V., Dikur O.N.; text writing —Ashikhmin Ya.I., Ratnikova A.K.; scientific editing —Ermolenko K.D., Parcernyak A.S.