Введение
Проблема преждевременных родов является одной из наиболее актуальных в акушерстве в связи с высоким риском перинатальных потерь, а также значительной заболеваемостью новорожденных. Частота данной патологии до настоящего времени остается достаточно высокой [1—4], что обусловливает необходимость дальнейшего изучения функционально-молекулярных механизмов преждевременного развития родовой деятельности. Особенно информативным является исследование белков, выполняющих многочисленные клеточные функции. Важные сведения о течении беременности и состоянии плода дает изучение белков околоплодных вод — гестационной биосферы, занимающей центральное место в фетоплацентарной системе [5—7].
Цель исследования — изучить состав и модификации белков околоплодных вод, их значение в прогнозировании преждевременного развития родовой деятельности.
Материал и методы
Дизайн исследования
В проспективное исследование включены 60 беременных, из них 28 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родами в срок (39—40 нед), составившие контрольную группу, и 32 женщины, у которых на сроке 34—37 нед произошли преждевременные роды (основная группа).
Критерии включения в контрольную группу: физиологическое течение беременности; доношенная беременность; возраст женщин от 23 до 32 лет. Критерии включения в основную группу: преждевременная родовая деятельность. Критерии исключения: инфекционные заболевания; декомпенсированные формы соматических болезней; признаки преэклампсии и задержки роста плода; отсутствие информированного добровольного согласия на расширенный протокол исследования.
Условия проведения
Исследование выполнено на базе клинических и научных подразделений НИИ акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Продолжительность исследования
Исследование проведено в период с 2019 по 2021 г.
Описание медицинского вмешательства
Выполнены все необходимые клинические, клинико-лабораторные и функциональные исследования, регламентированные Приказом Минздрава России №572 от 01.11.12 «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология» (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)» (в ред. Приказа Минздрава России от 11.06.15 №333н, от 12.01.16 №5н, от 21.02.20 №114н).
Основной исход исследования
Конечной точкой исследования явилась оценка изменения спектра белков околоплодных вод при преждевременных родах по сравнению с соответствующими показателями при физиологической беременности.
Дополнительные исходы исследования
Дополнительные исходы исследования отсутствуют, поскольку отклонения изученных параметров отражены в основном исходе.
Методы регистрации исходов
Материалом для исследования служили околоплодные воды, взятые в срок 16—18 нед беременности путем трансабдоминального амниоцентеза. Проведение этой процедуры осуществлялось для исключения хромосомной патологии плода (Приказ Минздрава России от 01.11.12 №572). Все плоды у женщин, включенных в исследование, имели нормальный хромосомный набор.
Белки фракционировали методом электрофореза в полиакриламидном геле, используя прибор Protein II xi Multi-Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Количественную оценку электрофореграмм после окрашивания кумасси бриллиантовым голубым R-250 проводили на денситометре Camag TLC Scannes II (Швейцария) с интегратором фирмы Hewlett Packard (США). Для выявления природы и свойств белков использовали классические специфические красители [5, 6].
Статистический анализ
Размер выборки предварительно не рассчитывали. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica v. 6.0 (StatSoft Inc., США). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро—Уилка свидетельствует об их нормальном распределении. Исследованные показатели представлены в виде среднего значения (M), среднего квадратичного отклонения (SD) и средней квадратичной ошибки (m). Статистическую значимость различий между сравниваемыми данными определяли по критерию Стьюдента (t-критерию) для независимых выборок, а также по критерию c2 для сравнения категориальных переменных. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.
Этическая экспертиза
Информированное добровольное согласие на использование биоматериала для научных исследований получено от всех обследованных пациенток. Исследование проведено в соответствии с принципами, обозначенными в Хельсинкской декларации (2000 г.) и протоколе конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине (1999 г.) и одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол №13/19 от 12.09.19).
Результаты и обсуждение
Сравниваемые группы (основная и контрольная) пациенток статистически значимо не различались по акушерскому и соматическому анамнезу (табл. 1). Полученные молекулярно-биохимические данные свидетельствуют о высокой гетерогенности белков околоплодных вод. У женщин контрольной группы они представлены 20—22 фракциями, в их числе фракции по электрофоретической подвижности (Rm), подобные сывороточным преальбуминам, альбуминам, α1-глобулинам, трансферринам, посттрансферринам, α2-глобулинам, β-глобулинам, гаптоглобинам и макроглобулинам.
Таблица 1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток
| Показатель | Контрольная группа (n=28) | Основная группа (n=32) | p |
| Возраст, годы* | 26,9 (11,2) | 28,2 (12,4) | 0,0514 |
| Исходный ИМТ, кг/м2* | 27,6 (7,67) | 29,1 (7,94) | 0,329 |
| Первородящие, n (%)** | 13 (46,7) | 14 (44,1) | 0,896 |
| Повторнородящие, n (%)** | 15 (53,3) | 18 (55,9) | 0,892 |
| Аборты, n (%)** | 7 (25,0) | 9 (25,0) | 0,814 |
| Длина шейки матки, мм* | 36,0 (10,9) | 34,5 (9,5) | 0,791 |
| Наличие хронических заболеваний, n (%)** | 11 (39,0) | 12 (37,5) | 0,765 |
Примечание. Данные представлены в виде: * — M±SD, t-тест; ** — в виде абсолютных чисел и относительных частот n (%), c2-тест; ИМТ — индекс массы тела. В табл. 1, 2: p — статистическая значимость различий между показателями у женщин контрольной и основной групп.
Сопоставление спектра белков околоплодных вод женщин контрольной и основной групп выявило значительные качественные и особенно количественные различия (табл. 2). Общее содержание белков при угрозе прерывания беременности на 27% ниже, чем у женщин контрольной группы. Число фракций в g-глобулиновой и гаптоглобиновой зонах снизилось с 4 до 2, а в α1-глобулиновой и преальбуминовой зонах, напротив, повысилось с 2 до 4. Модификация касается и электрофоретической подвижности отдельных фракций в зонах альбуминов и гаптоглобинов. Это может свидетельствовать об их структурных изменениях, в частности соотношения функциональных групп и состава концевых аминокислот [8]. Кроме того, у женщин основной группы по сравнению с женщинами контрольной группы снижается уровень белков во фракции, аналогичной альбумину (на 34,0%, p=0,01), а также в β-глобулиновой, трансферриновой и гаптоглобиновой зонах (на 37,1%, 38,2% и 43,3% соответственно, p=0,001).
Таблица 2. Содержание белков околоплодных вод в зонах с электрофоретической подвижностью (Rm) при физиологической беременности и при угрозе преждевременных родов (мг/100 мл)
| Rm | Контрольная группа (n=28) | Основная группа (n=32) | p |
| 0,60—1,0 | 0,74±0,04 | 0,79±0,05 | 0,85 |
| 0,48—0,51 | 4,62±0,27 | 1,57±0,10 | 0,010 |
| 0,37—0,41 | 2,71±0,21 | 3,81±0,25 | 0,001 |
| 0,30—0,34 | 2,50±0,17 | 1,55±0,11 | 0,001 |
| 0,23—0,27 | 3,28±0,23 | 3,39±0,24 | 0,79 |
| 0,20—0,24 | 5,23±0,34 | 5,01±0,35 | 0,65 |
| 0,15—0,18 | 4,37±0,30 | 2,75±0,21 | 0,001 |
| 0,07—0,11 | 5,82±0,41 | 3,32±0,24 | 0,001 |
| 0,04—0,05 | 6,81±0,45 | 6,67±0,52 | 0,91 |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и средней квадратичной ошибки (M±m).
Уменьшение концентрации гаптоглобинов и трансферринов, обладающих выраженными антиоксидантными свойствами, может приводить к усилению процессов перекисного окисления липидов, влияющих на синтез простагландинов при преждевременных родах [6].
В области β-глобулинов находится медьсодержащий белок — церулоплазмин [9], также оказывающий сильное антиоксидантное действие и влияющий на стабилизацию клеточных мембран. В связи с этим снижение его количества усугубляет свободнорадикальные процессы. Ранее полученные данные свидетельствуют о том, что уровень церулоплазмина в околоплодных водах снижается и при плацентарной недостаточности, зачастую регистрируемой при преждевременной инициации процессов родовозбуждения [10]. В свою очередь, уменьшение количества белка в альбуминовой зоне околоплодных вод отрицательно сказывается на развитии плода.
Противоположная направленность изменения характерна для α1-глобулинов, содержание которых повышается на 40,5% (p=0,01). К фракции этих белков относится белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста — ИПФР (ИПФРСБ-1). Увеличение содержания данного белка, очевидно, снижает количество самого фактора, угнетая тем самым его ингибирующее действие на высвобождение плацентарных простагландинов [11].
Помимо этого, уменьшение уровня ИПФР, являющегося одним из ключевых регуляторов роста и развития плода, нарушает эти процессы. Следует отметить, что, согласно современным представлениям, плоду отводится определенная роль в инициации родов. Причем ухудшение условий его обитания в результате усиления гипоксии в комплексе «мать — плод» может ускорить процессы преждевременного развития родовой деятельности.
Гетерогенность белков околоплодных вод подтверждается также наличием сложных протеинов в виде комплексов с различными небелковыми соединениями. Наиболее высокое содержание обнаружено для гликопротеинов: у женщин контрольной группы выявлено 16 фракций углеродно-белковых комплексов, 10 фракций липопротеинов и 8 нуклеопротеинов. У пациенток основной группы количество гликопротеинов снижается на 35,6% (в норме данная величина составляет 45,31±2,72 мкмоль/мг белка, при угрозе преждевременных родов — 29,17±1,93 мкмоль/мг белка, p=0,01). Особенно негативное влияние такого уменьшения связано с тем фактом, что в их составе находится ряд специфических белков беременности, участвующих в осуществлении важнейших клеточных функций [12]. Аналогичная направленность изменений имеет место и для липопротеинов, содержание которых снижается на 38,5% (с 39,86±2,91 мкмоль/мг белка у женщин контрольной группы до 24,50±1,52 мкмоль/мг белка у женщин основной группы, p=0,01). Уменьшение количества липопротеинов в околоплодных водах, осуществляющих параплацентарный обмен, ухудшает снабжение организма плода этими важными белками, необходимыми для его трофики и обеспечения баланса оксидантных и антиоксидантных процессов.
Что касается нуклеопротеинов, особенно РНК-нуклеопротеинов, то их содержание снижено в меньшей степени, чем других сложных белков, — на 23,7% (у женщин контрольной группы их уровень составляет 25,32±1,55 мкмоль/мг белка, у женщин основной группы — 19,32±1,35 мкмоль/мг белка, p=0,01). Однако это не уменьшает значимости такого изменения, влияющего на трансляционный уровень регуляции протеосинтеза. Последнее может служить ведущим звеном в цепи молекулярных повреждений, приводящих к развитию осложненной гестации.
Проведенные нами исследования выявили также в околоплодных водах при преждевременных родах перераспределение белков в зонах с различными величинами молекулярных масс. Если у женщин контрольной группы при значениях молекулярных масс 290 кДа, 75 кДа и 20 кДа содержание белков составляет соответственно 52%, 36%, 12%, то у беременных основной группы содержание высокомолекулярных и среднемолекулярных белков снижается до 48% и 32%, а низкомолекулярных, напротив, повышается до 20%.
Такое перераспределение белков происходит за счет ограниченной деструкции макромолекул с освобождением более мелких фрагментов, переходящих в зоны белков с меньшими молекулярными массами.
Анализ приведенных данных позволяет полагать, что нарушение состава и свойств белков в околоплодных водах при преждевременных родах происходит в результате модификации различных уровней структуры белков. Совокупность этих изменений снижает функциональную активность белков и приводит к повреждению их многогранных регуляторных возможностей.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что преждевременные роды развиваются на фоне дисбаланса в составе белков околоплодных вод. Модификация спектра белков, играющих центральную роль во всех клеточных процессах, несомненно, влияет на нарушение общего гомеостаза в системе «мать — плацента — плод — околоплодные воды», приводящее в дальнейшем к преждевременному развитию родовой деятельности.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Погорелова Т.Н.
Сбор и обработка материала — Никашина А.А., Михельсон А.А.
Статистический анализ данных — Гунько В.О.
Написание текста — Погорелова Т.Н., Никашина А.А., Боташева Т.Л.
Редактирование — Погорелова Т.Н., Никашина А.А., Палиева Н.В.
Исследование выполнено в рамках плановой НИР госзадания «Проведение прикладных научных исследований» от 26.12.20.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.