Введение

Для физиологического течения репродуктивных процессов и их успешного завершения необходимы нормальное функционирование биологической системы «мать—плацента—плод» и, прежде всего, ее метаболическая полноценность [1, 2]. Последняя в значительной степени обеспечивается сбалансированностью систем внутри- и межклеточной сигнализации и коммуникации. К числу важных компонентов этих систем относятся газотрансмиттеры, изучение которых интенсивно началось относительно недавно. Последним по времени открытия является эндогенный сероводород (H₂S) — активный вазодилататор, участвующий в реакциях ангиогенеза, апоптоза, окислительно-восстановительных процессах, генерации энергии, дифференциации и пролиферации клеток, определенный уровень которых особенно необходим в гестационных тканях [3].

Среди факторов, осложняющих беременность и нарушающих нормальное развитие плода, важная роль принадлежит дисфункции плаценты, с которой непосредственно связаны более 20% случаев перинатальной заболеваемости и смертности [4, 5] и которая включена в Международную классификацию болезней, травм и причин смерти (МКБ) как основной диагноз патологического состояния плода и новорожденного. Тяжелым осложнением беременности, возникающим как следствие патологических процессов, происходящих в системе «мать—плацента—плод» и, прежде всего, в плаценте, является задержка роста плода (ЗРП). Выяснение функционально-биохимических механизмов развития ЗРП до настоящего времени остается весьма актуальным [6, 7].

С учетом изложенного и малочисленности данных об обмене эндогенных газотрансмиттеров в фетоплацентарной системе целью работы явилось изучение показателей метаболизма H₂S в плаценте и околоплодных водах при ЗРП.

Материал и методы

В проспективное исследование были включены 56 беременных в возрасте от 24 до 30 лет, составивших две группы. В 1-ю (основную) группу вошло 30 пациенток, беременность которых осложнилась симметричной формой ЗРП в соответствии с МКБ-10 (шифр Р05.1). Во 2-ю (контрольную) группу были включены 26 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родов. По возрасту, индексу массы тела, наличию экстрагенитальных и гинекологических заболеваний обследуемые группы беременных были сопоставимы. Пациентки дали информированное согласие на расширенный алгоритм обследования, включающий клинические, лабораторные и функциональные методы.

Работа проведена в соответствии с нормами Хельсинкской декларации (2008 г.) и директивами Европейского сообщества (8/609 ЕС). Пациентки были обследованы согласно Приказу Минздрава России от 20.10.2020 г. №1130н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи по профилю акушерство и гинекология» и клиническим рекомендациям «Недостаточный рост плода, требующий предоставления медицинской помощи матери (задержка роста плода)», утвержденным 14.02.2022 г. МЗ РФ.

У пациенток обеих групп питание было полноценным и сбалансированным по основным ингредиентам. До наступления беременности их масса тела была нормальной, во время беременности наблюдались адекватные прибавки массы тела. Все женщины были первобеременными, первородящими и были родоразрешены после 38 нед беременности.

Критериями невключения в исследование служили инфекционные заболевания, декомпенсированные формы соматических заболеваний, многоплодная беременность, аутоиммунная патология. Критериями при постановке диагноза (и для включения в основную группу) служили нарушения кровотока в маточно-плацентарном или в плодово-плацентарном звене без признаков централизации кровотока по данным допплерометрии, признаки гипоксии при кардиотокографии, изменение содержания биохимического маркера тканевой гипоксии — гуанина. При выявлении нарушения кровотока осуществляли динамический контроль за состоянием плода до момента родоразрешения.

Измерение показателей кровотока проводили трехкратно в правой и левой маточных артериях, в обеих артериях пуповины, в правой и левой средней мозговой артериях. Для количественной оценки кривых скоростей кровотока использовали пульсационный индекс (ПИ). Нарушение кровотока в маточных артериях и артериях пуповины констатировали при ПИ больше 95-го перцентиля нормативных его значений в зависимости от срока беременности, а в средней мозговой артерии плода — при ПИ менее 5-го перцентиля его нормативных показателей. По данным ультразвуковой фетометрии определяли ЗРП.

Средняя масса тела и длина новорожденных, родившихся у матерей контрольной группы, составила 3425,28±272,25 г и 52,38±2,03 см, массо-ростовой коэффициент — 65,35±3,07. У матерей основной группы эти показатели новорожденных были ниже: 2707±206,30 г и 46,11±1,51 см, массо-ростовой коэффициент — 56,41±2,29 соответственно (p<0,05).

Гистологическое исследование ткани плаценты пациенток основной группы, проведенное на парафиновых препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, выявило патологические изменения, являющиеся морфологическими критериями плацентарной недостаточности: фиброз стромы ворсин, выпадение фибрина, вариант хаотичных склерозированных ворсин и эмбриональных ворсин, участки кальциноза, гиперваскуляризацию ворсин, кровоизлияние в строму ворсин. Средняя масса плацент в контрольной группе составила 554±49 г, в основной — 486±38 г (p>0,05).

Материалом для исследования служила ткань плаценты, взятая сразу после родов при соблюдении охлаждающего режима (температура 2—4◦C). Для исследования брали участки из плодовой части плаценты, которые промывали охлажденным изотоническим раствором хлорида натрия для удаления крови и амниотической жидкости, затем гомогенизировали при температуре 2—4◦C помощью гомогенизатора Ultra Turrax (IKA, Германия) в PPS-буфере.

Околоплодные воды получали при вскрытии плодного пузыря в первом периоде родов. В тканевых экстрактах и амниотической жидкости определяли содержание ферментов, ответственных за синтез газотрансмиттера H₂S: цистатионин-бета-синтазы (КФ¹ 4.2.1.22), цистатионин-гамма-лиазы (КФ 2.6.1.3), меркаптопируватсульфуртрансферазы (КФ 2.8.1.2), а также метаболита аденозилметионина с помощью иммуноферментного анализа — ИФА (тест-набором Cloud Clane Corp., США), выполненного в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Активность цистеинаминотрансферазы (КФ 2.6.1.3) определяли по приросту содержания глутаминовой кислоты после инкубации цистеина с альфа-кетоглутаровой кислотой [8]. Содержание цистеина, метионина и глутаминовой кислоты определяли на автоматическом анализаторе ААА-400 (Microtechno, Чехия). Подготовку проб и анализ проводили согласно инструкции к анализатору, используя натрий-цитратные буферные растворы с pH 3,26, 4,25 и 5,28. Идентификацию аминокислот, расчет площади пиков и определение концентрации осуществляли по результатам анализа соответствующих стандартных образцов (Sigma Aldrich, США) для калибровки прибора.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью лицензионного пакета программ Statistica 6,0 (Stat. Soft. Inc.). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро—Уилка свидетельствует об их нормальном распределении. Данные представлены в виде среднего значения (М) и среднего квадратического отклонения (SD). Статистическую значимость различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию t Стьюдента для независимых выборок. Корреляционный анализ выполнен с использованием критерия Пирсона и расчетом коэффициента корреляции «r». Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Полученные данные свидетельствуют, что при ЗРП (развивается на фоне дисфункции плаценты) нарушаются процессы синтеза и катаболизма H₂S в плаценте и околоплодных водах (таблица).

Содержание ферментов, аминокислот, их производных в плаценте (мкмоль/г) и околоплодных водах (мкмоль/л) при физиологической и осложненной беременности, M±SD

Примечание. Статистическая значимость различий между показателями основной и контрольной групп: * — p<0,05, ** — p<0,01; *** — p<0,001.

В плаценте из 4 изученных ферментов у пациенток основной группы снижается активность цистатионин-бета-синтазы (CBS) на 37,3%, меркаптопируваттрансферазы (3MST) на 35,1% и цистеинаминотрансферазы (ЦисТ) — на 34,1%. В то же время активность цистатионин-гамма-лиазы (CSE) практически не отличается от таковой при физиологической беременности.

Очевидно, при ЗРП основную роль в нарушении синтеза H₂S играет CBS, которая активирует конденсацию цистеина с гомоцистеином и образование цистотионина [9]. Цистеин является основной аминокислотой, участвующей в метаболизме H₂S и зависящей от фермента его обмена — ЦисТ. Уровень обоих этих показателей значительно снижается при ЗРП (на 39,6 и 34,1% соответственно), что усиливает модификацию активности CBS и, следовательно, нарушает образование газотрансмиттера H₂S и выполнение его функций, таких как контроль за процессами пролиферации, апоптоза, дифференции клеток. Эти процессы особенно важны для обеспечения нормального роста и развития плода.

Важно отметить, что именно в комплексе с ЦисТ функционирует фермент 3MST, в результате этого комплексирования продуцируется 3-меркаптопируват и затем синтезируется H₂S [10]. Уменьшение активности ЦисТ при ЗРП, в свою очередь, усиливает отрицательный эффект действия 3MST. Известно, что снижение количества цистеина негативно влияет на обмен антиоксиданта глутатиона [11], приводя к сдвигу баланса анти- и прооксидантов. Как показали ранее проведенные нами исследования, при дисфункции плаценты, на фоне которой развивается ЗРП, происходит снижение антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, что нарушает регуляцию плацентарных редокс-процессов и ухудшает энергообеспечение фетоплацентарного комплекса (ФПК) [12, 13].

Относительно неожиданным явилось увеличение концентрации метионина на 28,5%. Эта аминокислота также участвует в метаболизме H₂S путем трансметилирования, в результате которого образуется гомоцистеин, цистатионин и затем непосредственно H₂S [14].

Повышение содержания метионина, в отличие от других участников метаболизма H₂S, уровень которых, напротив, снижается, очевидно, связано с уменьшением его участия в синтезе донора метиловых групп и аллостерического активатора CBS — аденозилметионина и синтезе гомоцистеина [15, 16]. Это предположение подтверждается установленной нами отрицательной динамикой аденозилметионина и практически отсутствием отклонения в уровне гомоцистеина.

Что касается околоплодных вод, играющих ведущую роль в параплацентарном обмене, то в них происходят однонаправленные, но менее выраженные, чем в плаценте, изменения в содержании изученных ферментов. Так, уровень CBS, 3MST, ЦисТ снижается на 27,5, 27,7 и 29,4% соответственно. Уменьшается также количество аминокислоты цистеина на 35,4%. Что касается снижения уровня цистеина, то, кроме указанных последствий, негативное влияние может иметь уменьшение содержания цистеина в реакции синтеза аминокислоты таурина, обладающего мембранопротективными и антиоксидантными свойствами [17]. О функционально-метаболическом значении таурина в процессе гестации свидетельствует то, что его концентрация в ФПК превышает концентрацию эссенциальных аминокислот в 2—3 раза [18].

Результаты корреляционного анализа выявляют взаимозависимость изученных показателей. Прямая корреляция установлена между активностью CBS и уровнем цистеина в плаценте (r=0,82; p<0,01) и околоплодных водах (r=0,80; p<0,01). Обратная корреляция выявлена для CBS и метионина в плаценте и околоплодных водах соответственно (r=–0,85 и –0,82; p<0,01), а также между метионином и аденозилметионином (r=–0,84; p<0,01). Такая тесная корреляция свидетельствует о значении аминокислот, участвующих в метаболизме H₂S, в функционировании фермента CBS и, следовательно, в нарушении синтеза газотрансмиттера H₂S.

Подытоживая полученные результаты, можно еще раз отметить, что статистически значимые изменения различных составляющих метаболизма H₂S в плаценте и околоплодных водах при ЗРП нарушают многочисленные функции газотрансмиттера, в том числе внутри- и межклеточной сигнализации и коммуникации, влияющие на общий гомеостаз в ФПК. Последствия этих молекулярно-клеточных отклонений могут влиять на течение пре- и постнатального, а также неонатального периодов развития, включая модификацию мембранно-транспортных процессов и ухудшение трофики плода, важных патофизиологических механизмов развития ЗРП [19, 20].

Заключение

Развитие ЗРП происходит на фоне нарушения в плаценте и околоплодных водах метаболизма газотрансмиттера сероводорода. Изменяется содержание ферментов, участвующих в синтезе сероводорода, среди которых наблюдается наиболее выраженное снижение содержания ферментов цистатионин-бета-синтазы и меркаптопируваттрансферазы, а также аминокислоты цистеина — основного субстрата синтеза газотрансмиттера. Снижается и активность фермента обмена цистеина — цистеинтрансферазы. Отрицательная динамика активности ферментов усиливается за счет уменьшения уровня аденозилметионина — аллостерического активатора цистатионин-бета-синтазы.

Выявленные изменения обмена сероводорода приводят к нарушению его многочисленных функций, в том числе к нарушению регуляции дифференциации, пролиферации, апоптоза клеток, что может сопровождаться патологическими изменениями мембранно-транспортных процессов и приводить к ухудшению трофики плода.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Погорелова Т.Н., Гунько В.О.

Сбор и обработка материала — Никотина А.А.

Статистическая обработка — Крукиер И.И., Решетникова Э.А.

Написание текста — Погорелова Т.Н., Палиева Н.В.

Редактирование — Саркисян О.Г.

Authors declare lack of the conflict of interests.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Pogorelova T.N., Gun’ko V.O.

Data collection and processing — Nikashina A.A.

Statistical processing of the data — Krukier I.I., Reshetnikova E.A.

Text writing — Pogorelova T.N., Palieva N.V.

Editing — Sarkisyan O.G.

¹КФ — международная классификация ферментов.