Возрастные изменения активности овариальной ароматазы у женщин с неэндокринными факторами бесплодия и синдромом поликистозных яичников

Фермент ароматаза Р450 является основным ферментом синтеза эстрогенов. Экспрессия данного фермента начинает определяться в фетальных клетках гранулезы малых растущих фолликулов, но до рождения ее уровень остается относительно низким. В детстве экспрессия ароматазы снижена в малых растущих и преантральных фолликулах и определяется только в больших антральных фолликулах. Реализация оптимального процесса стероидогенеза происходит в постпубертатном периоде. С этого момента экспрессия ароматазы достигает максимального уровня в больших антральных и преовуляторных фолликулах [1]. Примерно после 35 лет у женщин наблюдается ускоренное истощение фолликулярного резерва яичников [1, 2]. При этом у женщин старшего репродуктивного возраста наблюдается сохранение стероидогенеза яичников. Так, вплоть до перименопаузы уровень эстрадиола (Э2) остается относительно стабильным, тогда как наблюдается резкое снижение уровней ингибина-b, антимюллерова гормона (АМГ) и числа антральных фолликулов [3—7].

Существует несколько физиологических механизмов, которые потенциально могут объяснить неизменную или более высокую секрецию Э2 при старении. Сохранение продукции Э2 предположительно могло быть обусловлено увеличением числа гранулезных клеток при физиологическом снижении числа антральных фолликулов. Однако исследования показали, что происходит не только уменьшение количества гранулезных клеток в фолликулах с повышением возраста и снижением резерва, но и усиление процесса апоптоза в них [8, 9]. Сохранение уровня Э2 с увеличением возраста женщин могло быть также связано и с повышением доступности субстратов — андростендиона (AD) и тестостерона (T). Однако нет никаких свидетельств об увеличении продукции андрогенов у пациенток старшего репродуктивного возраста по сравнению с более молодыми женщинами [10]. Предполагается, что основным механизмом поддержания физиологического уровня Э2 при увеличении возраста является повышение активности овариальной ароматазы.

Для проверки данного предположения в настоящем исследовании использован неинвазивный способ определения активности овариальной ароматазы, суть которого заключается в вычислении отношения уровней Э2 и АМГ на 2-й день менструального цикла [11]. Диагностическая значимость этого метода ранее подтверждена в протоколах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) наличием статистически значимой положительной корреляции уровня интенсивности флюоресценции ароматазы в кумулюсных клетках, полученных при трансвагинальной пункции (ТВП) при иммуноцитохимическом исследовании с активностью овариальной ароматазы, вычисленной указанным способом [12].

В то же время имеются литературные данные, свидетельствующие о том, что АМГ ингибирует каталитическую активность ароматазы, зависимой от уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), через репрессию гена CYP19 в культурах человеческих клеток гранулезы [13, 14]. В этой связи представилось целесообразным изучить активность овариальной ароматазы у пациентов в зависимости от возраста и уровня АМГ.

Цель исследования — сравнить активность овариальной ароматазы у пациенток различного возраста с неэндокринными факторами бесплодия и синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) в протоколах ЭКО.

В проспективное когортное одноцентровое исследование включены 196 пациенток, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО с использованием методики интрацитоплазматической инъекции сперматозоида с 2016 по 2018 г. У 64 женщин из 196 (1-я группа, основная) выявлен СПКЯ как эндокринный фактор бесплодия; 2-ю группу (группу сравнения) составили 132 пациентки с другими факторами бесплодия. Наличие СПКЯ являлось критерием включения в 1-ю группу. Диагноз СПКЯ устанавливали при наличии двух критериев из следующих: 1) олигоовуляция или ановуляция; 2) клиническая или биохимическая гиперандрогения; 3) поликистозное строение яичников по данным ультразвукового исследования (УЗИ) [15].

Критериями включения во 2-ю группу были трубный фактор бесплодия, наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) I—II степени и/или мужской фактор бесплодия. Критериями исключения являлись возраст до 25 лет и более 41 года, индекс массы тела (ИМТ) менее 18 кг/м² и более 30 кг/м², сниженный овариальный резерв (число антральных фолликулов менее 6, АМГ менее 1 нг/мл), сахарный диабет 1-го типа, наличие противопоказаний для проведения ЭКО согласно приказу Минздрава Российской Федерации от 30.08.12 № 107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» (с изменениями и дополнениями).

Перед началом стимуляции яичников (на 2-й день менструального цикла) у всех пациенток определяли содержание Э2 и АМГ в сыворотке крови. Активность овариальной ароматазы определяли путем вычисления коэффициента по формуле КА=Э2/АМГ, где КА — коэффициент активности ароматазы овариальных фолликулов; Э2 — базальный уровень эстрадиола в крови на 2-й день менструального цикла в нмоль/л; АМГ — уровень антимюллерова гормона в крови на 2-й день менструального цикла в нг/мл [5].

Овариальную стимуляцию проводили по общепринятым стандартам с использованием ежедневного введения рекомбинантного ФСГ в протоколах с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона.

Через 36 ч после введения триггера овуляции проводили ТВП фолликулов и аспирацию ооцитов. При ТВП собирали фолликулярную жидкость 1 фолликула более 16 мм в диаметре без сгустков крови. Полученную жидкость центрифугировали (5000 об/мин — 10 мин), надосадочную жидкость замораживали при температуре –70 °C для последующего гормонального исследования (определения концентраций Э2 и Т, андростендиона и ингибина b).

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета прикладных программ Statistica v 12.0 for Windows (Statsoft Inc., США). Методами описательной статистики для количественных признаков с распределением, отличающимся от нормального, рассчитывали медиану (Ме), 25-й и75-й процентили. Для сравнительного анализа данных, полученных в двух группах, использовали критерий U Манна—Уитни. Корреляционный анализ осуществляли при помощи коэффициента корреляции Спирмана (Spearman R). Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05.

Из 196 включенных в исследование пациенток 64 (33%) имели эндокринный фактор бесплодия (СПКЯ), они составили 1-ю (основную) группу. Во 2-ю группу включены 65 (33%) женщин с трубным фактором бесплодия, 30 (15%) — с НГЭ, 37 (19%) — с мужским фактором бесплодия.

Средний возраст пациенток 1-й группы составил 32 (28—34) года и статистически значимо не отличался от возраста пациенток 2-й группы — 33 (30—35) года. У пациенток разных групп также статистически значимо не различались ИМТ (р=0,732), длительность бесплодия и частота первичного и вторичного бесплодия (табл. 1).

Сывороточный уровень АМГ был статистически значимо выше у пациенток 1-й группы — 8,5 (6,5—10,8) нг/мл по сравнению с аналогичным показателем у женщин 2-й группы — 1,9 (1,2—3,1) нг/мл; р<0,001. При этом базальный уровень Э2 у исследуемых обеих групп статистически значимо не различался (р=0,254). При оценке активности овариальной ароматазы (на 2-й день менструального цикла) у женщин исследуемых групп выявлены статистически значимые различия (р<0,001). Медиана коэффициента активности овариальной ароматазы у пациенток 1-й группы составила 22,5 по сравнению со 104 у женщин 2-й группы (см. табл. 1).

Результаты определения концентрации интрафолликулярного уровня половых гормонов у обследованных пациенток представлены в табл. 2.

На рис. 1 представлены

В табл. 3 представлены

Полученные нами результаты показали, что с увеличением возраста женщин сывороточная концентрация АМГ (р=0,002) снижается, тогда как базальный уровень Э2 в сыворотке крови остается в пределах физиологических значений (р=0,283). Сохранение продукции Э2 обусловлено, скорее всего, повышением активности овариальной ароматазы. Ранее опубликованные работы также подтверждают повышение активности данного фермента с увеличением возраста женщин. Так, N. Shaw и соавт. в 2015 г. описали более интенсивную экспрессию ароматазы в гранулезных клетках, выделенных из доминантных фолликулов у женщин 39 лет, по сравнению с 26-летними пациентками в отсутствие различий сывороточного и фолликулярных уровней Э2 [16]. C. Welt и соавт. в 2006 г. определяли активность ароматазы путем вычисления отношения уровня эстрона к уровню AD у пациенток разных возрастных групп (40 и 25 лет). Авторы также пришли к заключению о повышении активности овариальной ароматазы у пациенток старшей возрастной группы [10]. Повышение активности фермента, вероятнее всего, связано с компенсаторным адаптивным механизмом сохранения продукции эстрогенов в старшем репродуктивном возрасте на фоне сокращения числа антральных фолликулов. Как известно, ФСГ является главным эндогенным активатором ароматазы Р450 [1]. Повышение активности данного фермента обусловлено, вероятно, увеличением уровня ФСГ в поздней лютеиновой фазе и ранней фолликулярной фазе у женщин старшей возрастной группы. Относительно более высокий уровень ФСГ приводит к активации овариальной ароматазы и синтезу достаточного уровня эстрогенов.

Отношение Э2/Т в фолликулярной жидкости отображает активность ароматазы в гранулезных клетках яичника. В настоящем исследовании нами не обнаружено связи между данным показателем и возрастом пациенток. Скорее всего, это связано с определением содержания половых стероидных гормонов в фолликулярной жидкости на фоне овариальной стимуляции с использованием высоких доз экзогенного ФСГ, а также после применения триггера финального созревания фолликулов, который приводит к подавлению экспрессии ароматазы. Таким образом, полученные значения отношения уровня Э2 к уровню Т отражают активность овариальной ароматазы в стимуляции, что может кардинальным образом отличаться от состояния активности этого фермента в естественных условиях. Данные N. Klein и соавт. при сравнении гормональных показателей фолликулярной жидкости, полученных в натуральном цикле у пациенток 40—45 и 25—35 лет, свидетельствуют о повышении активности овариальной ароматазы (отношение уровня Э2 к уровню Т) у возрастных пациенток (р<0,03) [17].

Выработка Э2 яичниками зависит не только от активности ферментов, но и от наличия андрогенного субстрата, количества фолликулов и гранулезных клеток. Литературные данные свидетельствуют о более низких уровнях андрогенов в сыворотке крови у женщин с увеличением возраста, при этом уровни фолликулярного T могут как уменьшаться, так и не различаться у женщин разных возрастных групп [16]. C. Welt и соавт. отметили снижение уровня AD в поздней фолликулярной фазе в сыворотке крови у женщин 40 лет по сравнению с 25-летними [10]. Нами не обнаружена статистически значимая связь между возрастом пациентки и концентрацией Т в фолликулярной жидкости, однако концентрация интрафолликулярного AD статистически значимо снижалась. N. Klein и соавт., например, при сравнении уровней андрогенов в фолликулярной жидкости пришли к выводу, что пациентки старшей возрастной группы имеют статистически значимо более низкую концентрацию AD и Т при одинаковых уровнях Э2 [17]. Эти данные свидетельствуют о снижении андрогенного субстрата с увеличением возраста.

У пациенток с СПКЯ активность овариальной ароматазы статистически значимо ниже, чем у женщин группы сравнения. Литературные данные также свидетельствуют о снижении активности ароматазы у пациенток с СПКЯ [18—21]. Вероятнее всего, такое снижение обусловлено способностью АМГ ингибировать каталитическую активность ФСГ-зависимой ароматазы через репрессию гена CYP19 в гранулезных клетках [14]. Кроме того, сохранение сниженной активности овариальной ароматазы, отсутствие статистически значимой связи между ее активностью и возрастом у женщин с СПКЯ подтверждают возможное участие снижения активности фермента в патогенезе заболевания.

Таким образом, активность овариальной ароматазы возрастает с повышением возраста и снижением овариального резерва. Возрастное увеличение активности ароматазы Р450 компенсирует физиологическое снижение овариального резерва и позволяет поддерживать достаточный уровень эстрадиола, который необходим для нормальной жизнедеятельности организма. Отсутствие связи активности овариальной ароматазы у пациенток с СПКЯ и возрастом может свидетельствовать об участии данного фермента в патогенезе заболевания.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — П.П., А.М., И.Ю.

Сбор и обработка материала — П.П., Н.Н., Е.А., И.Д., Е.М., И.О.

Статистический анализ данных — П.П., Н.Н., Е.А., И.Д., Е.М., И.О.

Написание текста — П.П.

Редактирование — А.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Яковлев Павел Павлович — e-mail: iakovlevpp@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-1443-9623

Ткаченко Наталия Николаевна — к.б.н., заведующая лабораторией эндокринологии отдела эндокринологии репродукции. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург

Коган Игорь Юрьевич — https://orcid.org/0000-0002-7351-6900

Комарова Евгения Михайловна — к.б.н., м.н.с., эмбриолог отделения ВРТ ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург

Лесик Елена Александровна — к.б.н., с.н.с., эмбриолог отделения ВРТ ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург

Мекина Ирина Дмитриевна — к.б.н., с.н.с. отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург

Крихели Инна Отаровна — к.м.н., научный сотрудник отделения вспомогательных репродуктивных технологий. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург

Гзгзян Александр Мкртичевич — https://orcid.org/0000-0003-3917-9493

Автор, ответственный за переписку: Яковлев Павел Павлович — e-mail: iakovlevpp@gmail.com;
https://orcid.org/0000-0003-1443-9623