Эндометриоз поражает до 10% женщин репродуктивного возраста и до 60% девочек-подростков и женщин с тазовой болью [25]. Клиническая картина различна, но часто включает один или несколько симптомов: дисменорея (болезненная менструация), глубокая диспареуния (болезненный половой акт), симптомы кишечника или мочевыделительной системы, недостаточная подвижность и хроническая тазовая боль [12, 25, 38], что значительно ухудшает качество жизни взрослых женщин и подростков [39].

Основные патологические механизмы боли, связанные с эндометриозом, по-прежнему, в значительной степени неясны, часто это обусловлено воспалением, наличием микродемиелинизированных сенсорных нервных волокон в функциональном слое эндометрия и наличием перитонеальных эндометриоидных гетеротопий по сравнению с нормальной брюшиной, а также при глубоком инфильтративном эндометриозе [27, 34, 49]. По мнению Е.А. Коган и соавт. [4], хронически повреждаемые и регенерирующие нервные волокна могут являться источником постоянной и интенсивной ноцицептивной стимуляции, лежащей в основе нейропатического болевого синдрома. Кроме этого, показано, что психоэмоциональное состояние женщин с эндометриозом в сочетании с болевым синдромом, а также степень болевого синдрома связаны с наличием высокой экспрессии PGP 9.5, NF, NGF и его рецептора NGFRp75 в очагах эндометриоза и окружающей ткани [5]. В то же время медикаментозное лечение при эндометриозе, способствующее развитию аменореи, препятствует возникновению так называемого провоспалительного каскада в ходе ежемесячной ретроградной менструации, уменьшает число нервных окончаний в эндометриоидных очагах, служит профилактикой формирования в структурах ноцицептивной системы очагов повышенной возбудимости [6]. По данным N. Tokushige и соавт. [46], гормональное лечение эндометриоза способствует статистически достоверному снижению плотности нервных волокон в эндометрии и миометрии.

Одним из нейротрансмиттеров, идентифицированных в нервных волокнах, является вазоактивный интестинальный пептид (VIP) [27, 46]. VIP широко представлен в организме человека и является плейотропным нейропептидом, состоящим из 28 аминокислот. Биологические эффекты VIP реализуются с помощью белковых рецепторов класса В G-белок — VPAC1, VPAC2 и PAC1. VIP оказывает иммуномодулирующее, расслабляющее гладкие мышцы и ангиогенное действие в дополнение к его роли в передаче боли в периферической и центральной нервной системах [13, 18, 20].

В настоящее время термин «нейроангиогенез» используется для описания совместного проявления уникальных сосудистых и нервных факторов в эутопическом эндометрии и в эндометриоидных имплантатах (гетеротопии). Хемокины, продуцируемые эктопическими эндометриальными стромальными клетками, активируют моноциты, а эндометриоидная ткань инфильтрируется активированными макрофагами и Т-клетками [23]. Местная воспалительная среда способствует синтезу и секреции из эктопического эндометрия и активированных перитонеальных макрофагов и нейтрофилов в перитонеальную жидкость нейротрофических и ангиогенных факторов роста, в частности сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) [10, 11, 18, 23, 51]. Ряд цитокинов, в частности интерлейкин (IL)-6 и -8, и другие провоспалительные биомолекулы также накапливаются в перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом [7, 41, 52].

Для роста гетеротопий необходима неоваскуляризация и увеличение плотности микрососудов (ПМС) по сравнению с окружающей тканью, внутри и вокруг перитонеальных эндометриотических имплантатов и ректовагинального инфильтративного эндометриоза [30]. Более того, сообщалось о положительной корреляции между ПМС в эндометриомах яичников и симптомами боли в тазовой области [35]. Ранее в 2006 г. мы показали повышенную локальную ангиогенную активность, в том числе ПМС, как в эутопическом эндометрии у больных с эндометриозом по сравнению со здоровыми женщинами, так и в эктопическом эндометрии с высокой пролиферативной активностью [16].

Установлено, что экспрессия VIP в эутопическом эндометрии коррелирует с болью, возникающей при биопсии эндометрия в ходе выполнения офисной гистероскопии [24]. Кроме этого, у больных наблюдалось повышение экспрессии СЭФР в эндометрии по данным иммуногистохимии и содержание СЭФР в крови.

Метаанализ биомаркеров эндометрия для оценки роли боли у больных с эндометриозом установил VIP как «перспективный маркер для дальнейшего исследования» [21].

Учитывая известную роль VIP в передаче периферической боли и регуляции иммунного ответа, следует предположить о возможном участии VIP в боли, связанной с эндометриозом.

Цель исследования — оценить интенсивность экспрессии VIP и СЭФР-А в сосудах, пролиферативный индекс в сосудах и в эпителии желез, плотность CD31 и VIP в эутопическом эндометрии как в контрольной группе, так и у больных с перитонеальной формой эндометриоза без хронической тазовой боли и с болью, а также изучить содержание VIP, СЭФР-А, IL-6 в крови у обследованных больных.

Под наблюдением находились 85 больных с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, диагностированного во время лапароскопии. Рандомизация и подбор больных осуществлялись совместно с д.м.н. Т.Е. Самойловой, д.м.н. Е.Д. Дубинской, д.м.н., проф. А.С. Гаспаровым, к.м.н. М.А. Шороховой, к.м.н. М.Ф. Дорфманом, к.м.н. Н.С. Щетининой, к.м.н. А.С. Онищенко, врачом О.М. Векилян. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Письменное информированное согласие на участие больных в исследовании было получено у всех пациенток. Все больные были разделены на две группы: без наличия признаков хронической тазовой боли (34 больные) и с наличием признаков хронической тазовой боли (51).

Критерии включения в исследование: женщины репродуктивного возраста (от 27 до 37 лет); перитонеальная форма эндометриоза I—III стадии, согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины (rASRM) [42], бесплодие, отсутствие приема других гормональных препаратов для лечения наружного генитального эндометриоза на протяжении 3 мес перед началом исследования. Клинические проявления наружного генитального эндометриоза: нарушение менструальной функции (мено- и метроррагии), боли в нижних отделах живота и поясничной области различной интенсивности, диспареуния, бесплодие. Оценку боли проводили по визуально-аналоговой шкале (ВАШ), как было описано нами ранее [15].

Критерии исключения: возраст пациентки старше 37 лет, наружный генитальный эндометриоз IV стадии, аллергические реакции на гозерелина ацетат, беременность, лактация, средняя и тяжелая экстрагенитальная патология.

Всем пациенткам были выполнены оперативные вмешательства путем лапароскопии с использованием оборудования фирмы «Karl Stors» (Германия): иссечение и/или коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, разделение спаек в области малого таза, сальпингоовариолизис. В процессе операции с целью исключения внутриматочной патологии производилась жидкостная гистероскопия с помощью жесткого гистероскопа с микрогистероскопической насадкой и наружным диаметром 88 мм («Karl Stors», Германия), а также диагностическое выскабливание слизистой матки.

Больным перед оперативным лечением был проведен забор крови для лабораторных исследований. В ходе хирургической операции проведено раздельное диагностическое выскабливание полости матки и получен биоптат эндометрия. При непосредственной визуализации гетеротопий осуществлялась их биопсия.

Контрольную группу составили 53 пациентки, которым производилась стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз в этой группе исключался после тщательного исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов. Ультразвуковое и гистероскопическое исследования матки позволили исключить у пациенток этой группы наличие аденомиоза.

Ультразвуковое исследование органов малого таза у больных проводилось до оперативного лечения и после окончания курса терапии с помощью аппарата Aloka SSD-2000 с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц.

Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром до операции. Образцы сыворотки и перитонеальной жидкости хранили при –70 °С до момента исследования. Все образцы биопсии эндометрия были получены в LH+7 (±2), исходя из ежемесячной оценки фазы менструального цикла и дня менструального цикла образцов эндометрия, согласно стандартным критериям.

Иммуногистохимический анализ. Образцы тканей эутопического эндометрия разделялись на две части, одна из которых направлялась для морфологического исследования, вторая — подвергалась консервированию в растворе формалина для иммуногистохимического анализа. По данным патоморфологического исследования все полученные образцы представляли собой ткань эндометрия.

Оценка экспрессии VIP в сосудах, СЭФР-А в сосудах и соответствующее распределение по клеточным элементам выполнена при использовании иммуногистохимического метода в условиях стандартного протокола, как это было описано нами ранее [16]. Результаты учитывали с помощью цифровой обработки данных и программы Image-Pro Plus (версия 4.0 for Windows) и выражали в условных единицах (усл. ед.): 0 усл. ед. — отсутствие реакции, 1 усл. ед. — от 0,1 до 33,3%, 2 усл. ед. — от 33,3 до 66,6%, 3 усл.ед. — от 66,6 до 99,9%. Процент реакции вычислялся от максимального значения экспрессии. Для визуализации использовали поликлональные антитела к VIP (AB982; «EMD Millipore Corp., MA», США) с системой визуализации EnVision G/2 System/AP, Permanent Red («Dako, Agilent Technologies») и моноклональные антитела к СЭФР-А («Dako A/S», Дания).

Определение плотности микрососудов (ПМС) и плотности VIP проводили, как описано ранее [16], в стандартных условиях с использованием иммуногистохимического метода и последующей цифровой обработкой данных с помощью программы Image-Pro Plus (версия 4.0 for Windows). Все результаты выражали в усл.ед. в мм². Для визуализации микрососудов использовали моноклональные антитела к CD31 («Dako, Agilent Technologies») и поликлональные к VIP (AB982; «EMD Millipore Corp., MA», США) с системой визуализации EnVision G/2 System/AP, Permanent Red («Dako, Agilent Technologies») в соответствии с рекомендациями производителя. Показатель плотности СD31 и VIP выражали как среднюю интенсивность окрашивания × % от площади на 1 мм².

Проведение вестерн-блоттинга. Использовали по 5 образцов ткани (~ 30 мг) эутопического эндометрия от женщин контрольной группы, эутопического и эктопического эндометрия от больных с эндометриозом без боли и с болью, как это было описано нами ранее [15]. Ткани гомогенизировали с использованием TissueLyser II («Qiagen AB», Швеция) в RIPA Lysis and Extraction buffer (Thermo Fisher Scientific), содержащие ингибиторы протеаз и фосфатаз. Суспензию центрифугировали и собирали супернатант. Концентрацию белка определяли с помощью анализа Bradford Reagent («Sigma-Aldrich Sweden AB») и спектрофотометра Epoch Microplate («BioTek Instruments, Inc.», VT, США). Денатурированные образцы белка (20 мкг, белок/проба), SeeBlue Plus2 как предварительно окрашенный белковый стандарт («Thermo Fisher Scientific») и положительный контроль клеточного лизата SK-N-SH (sc-2410; «Santa Cruz Biotechnology Inc.», TX, США) подвергались гель-электрофорезу в буфере NuPAGE MOPS SDS с помощью NuPAGE Bis-Tris 4—12% (Invitrogen, «Thermo Fisher Scientific»). По окончании электрофореза гель переносили на мембрану Immobilon-FL PVDF (EMD Millipore). Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в блокирующем буфере Odyssey (PBS) (LI-COR Biotechnology, NE, США), а затем инкубировали в течение 12 ч при 4 °C с первичными антителами. Использовали кроличьи поликлональные антитела к VIP (AB982; EMD Millipore) и мышиные моноклональные к Actinβ (C4) (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology) в блокирующем буфере Odyssey (PBS). Мембраны промывали четыре раза в TBS-Tween (pH 8,0; 0,5 М TRIS, 1,5 М NaCl, 0,1% Твин). Затем их инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темной камере с вторичными антителами (IRDye 800CW), козьи к кроличьим IgG и IRDye 680RD козьи к мышиным IgG (LI-COR Biotechnology), в блокирующем буфере Odyssey (PBS). Полосы были визуализированы с использованием инфракрасного Imager Odyssey и изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения Image Studio Lite 5.0 (LI-COR Biotechnology).

Проведение извлечения РНК и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (RT-qPCR). Суммарную РНК экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) после разрушения образцов ткани в TissueLyser II (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя и как было описано нами ранее [15]. Концентрации РНК измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 («Thermo Fisher Scientific»), а целостность РНК оценивали с помощью системы Biilanalyzer Agilent 2100 («Agilent Technologies»). В исследование были включены только образцы с целостностью РНК пять или более. Синтез первой нити комплементарной ДНК (кДНК) проводили с использованием SuperScript VILO Master Mix (Invitrogen, «Thermo Fisher Scientific») в соответствии с протоколом производителя. ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием анализаторов TaqMan Fast Universal PCR Master Mix и TaqMan Gene Expression в системе PCR в реальном времени StepOnePlus («Applied Biosystems», «Thermo Fisher Scientific»). Использовались праймеры Thermo Fisher Scientific: вазоактивный кишечный пептид (VIP, Hs00175021-m1) и человеческий β-актин (ACTB, 4326315E) в качестве эндогенного контроля. Все образцы выполнялись в трех экземплярах. Относительные изменения экспрессии генов были проанализированы с использованием метода 2-ΔΔT [31].

Анализ сыворотки крови. Определение содержания в сыворотке крови VIP (в нг/мл), СЭФР-А (в нг/мл), IL-6 (в пг/мл) проводили с помощью иммуноферментного анализа с применением стандартных наборов (EK-064−16, «Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Ca», США; «R&D systems», США). Проведение реакции и расчет результатов осуществляли в стандартных условиях, согласно рекомендациям производителя.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни. Различия между группами считались достоверными при p<0,05.

Характеристика больных. Клинические данные у больных с перитонеальной формой эндометриоза по отношению к контрольной группе характеризовались бесплодием, хроническими тазовыми болями, метроррагиями, диспареунией, а при лапароскопии различной локализацией гетеротопий на брюшине. Результаты оценки клинических данных представлены в табл. 1. Как следует из приведенных данных, возраст и индекс массы тела в группе больных с эндометриозом без боли и с болью статистически значимо не различались. В то же время статистически значимо дисменорея наблюдалась чаще в группе без боли, а сочетание дисменореи и диспареунии чаще в группе с болью. Хроническая тазовая боль статистически значимо наблюдалась у больных с болью (4,8 балла по шкале ВАШ). Отсутствовали статистически значимые различия между группами по критериям rASRM о распространенности эндометриоза на брюшине. Эти результаты позволили провести сравнение изученных показателей в крови и в эутопическом эндометрии у обследованных больных. Детальная клиническая характеристика больных была представлены нами ранее [1—3, 35].

Содержание VIP, СЭФР-А, IL-6 в сыворотке крови у больных с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью. Как следует из табл. 2, статистически значимое повышение содержания VIP в крови отмечено у больных пациенток с эндометриозом — в 2,1 раза без боли и в 3,6 раза при наличии боли. Содержание СЭФР-А в крови показало достоверно значимые различия в сторону увеличения у больных с эндометриозом — в 2 раза в отсутствие боли и в 2,7 раза при наличии боли по отношению к контрольной группе. Содержание IL-6 в крови не имело статистически значимых различий в норме и у больных с эндометриозом и без боли, но было увеличено в 1,5 раза (p<0,001) у больных с наличием боли.

Качественная ROC-модель для VIP в сыворотке крови у больных с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью. Проведение ROC-анализа (рис. 1) для массива данных о содержании VIP в крови было показано, что у больных с эндометриозом и хронической тазовой болью площадь под кривой (AUC) составила для VIP 0,96. Используя предельное значение концентрации VIP в сыворотке 10,6 нг/мл, можно предсказать хроническую тазовую боль при эндометриозе с чувствительностью 98,6% и специфичностью 79,3%. Эти данные можно использовать и для построения объективной шкалы оценки интенсивности тазовой боли по уровню VIP в крови в отличие от субъективной шкалы ВАШ.

Пролиферативный индекс Ki-67 (%), экспрессия VIP в сосудах (SCORE), плотность на 1 мм² CD31 и плотность на 1 мм² VIP в эутопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью. Как следует из табл. 3, экспрессия VIP в сосудах эутопического эндометрия была наименьшая в норме и статистически значимо повышалась у больных с болью в 2 раза. Плотность VIP на 1 мм² была также наименьшей в норме, статистически значимо повышалась в 2,6 раза у больных с эндометриозом и достигала наибольших значений (увеличение в 3,7 раза) у больных при наличии боли.

Исследование ПМС для CD31 на 1 мм² позволило установить статистически значимое увеличение ПМС по отношению к норме у больных с эндометриозом без наличия боли в 1,7 раза, а с болью в 1,9 раза.

Анализ индекса пролиферации (Ki-67, %) в эндотелии сосудов показал, что наблюдалось статистически значимое увеличение в 1,5 раза у больных с эндометриозом и наличием боли по отношению к контрольной группе. Аналогичные результаты были получены в эпителии желез. Так, в группе больных с болью по отношению к контролю наблюдались статистически значимые различия в сторону увеличения в 1,3 раза.

Экспрессия СЭФР-А в сосудах соответствовала распределению данных индекса пролиферации в сосудах. Так, не установлено статистически значимых различий между контрольной группой и больными с эндометриозом и без боли. В то же время у больных с болью наблюдалось статистически значимое увеличение экспрессии СЭФР-А (р<0,05).

Относительный уровень белка VIP (вестерн-блоттинг) и относительная экспрессия VIP mRNA (qrt-PCR) в эутопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью. Вестерн-блоттинг использовали для определения экспрессии белка VIP в эутопическом эндометрии (табл. 4). Проводилось сравнение нормального эутопического эндометрия и эутопического эндометрия у больных с эндометриозом и болью (боль–, боль+); бета-актин использовался в качестве внутреннего контроля. Результаты анализировались с использованием Image Studio Software (LI-COR, Inc) и оценивались на основании непараметрического U-теста Манна—Уитни. Полученные результаты свидетельствуют о том, что наиболее низкие значения экспрессии VIP были в нормальном эндометрии (0,09±0,06 нг/мл). При эндометриозе с отсутствием хронической тазовой боли величина экспрессии возрастает статистически значимо в 3 раза (0,27±0,12 нг/мл). При сочетании эндометриоза и хронической тазовой боли экспрессия VIP по отношению к нормативным значениям возрастает в 4,6 раза.

Результаты изучения экспрессии мРНК VIP в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриозом в зависимости от тазовой боли представлены в табл. 3. В качестве контроля использовались образцы женщин с нормальным эндометрием. Уровень экспрессии мРНК измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени и нормировали на уровень гена с помощью актина B. Каждый эксперимент повторяли три раза. Результаты проанализированы методом 2-Ct и оценивались с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Установлено, что экспрессия гена VIP в эутопическом эндометрии в норме и у больных с эндометриозом и без тазовой боли статистически значимо не различалась и составила 0,0012±0,0008 и 0,0012±0,0004 соответственно. У больных с эндометриозом и тазовой болью экспрессия гена VIP была увеличена в 4,5 раза и составила 0,0054±0,0044.

Блок-схема патологического нейроангиогенеза в эутопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью. На рис. 2 представлена модель формирования боли при патологическом нейроангиогенезе в эутопическом эндометрии при эндометриозе и хронической тазовой боли. Для формирования боли, по данным проведенного исследования, необходимо сочетание трех компонентов: избыточного нейрогенеза, избыточного ангиогенеза и пролиферации.

Избыточный нейрогенез складывается из повышенного содержания VIP в крови (ELISA, иммуноферментный анализ), высокой экспрессии мРНК VIP (PCR, ПЦР) в эндометрии, высокой экспрессии белка VIP (WB, вестерн-блоттинг) в эндометрии, высокой экспрессии VIP (IHC, иммуногистохимия) в сосудах эндометрия, высокой экспрессии VIP (IHC) в нервных волокнах эндометрия.

Избыточный ангиогенез включает повышенное содержание СЭФР-А в крови (ELISA), повышенную экспрессию СЭФР-А (IHC) в сосудах эндометрия, повышенную экспрессию СЭФР-А (IHC) в эпителии желез эндометрия, высокую ПМС эндометрия.

Проявление пролиферативной активности основано на повышенном пролиферативном индексе в эпителии сосудов и в железах. Эти данные дополняют наши ранее опубликованные результаты [16]. В соответствии с данными при высоком индексе пролиферации и ангиогенной активности в эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза наблюдалось большее число больных с хронической тазовой болью. К сожалению, в этой публикации нам не удалось подтвердить результаты данными о нейрогенезе, и поэтому этот акцент не получил должного отражения. В представленной работе роль нейрогенеза доказана.

Сопряжение сигнальных путей нейрогенеза, ангиогенеза и пролиферации приводит к формированию феномена хронической боли, связанной с эутопическим эндометрием у больных с эндометриозом. Для возникновения такой боли необходим длительный период формирования патологического нейроангиогенеза как фундамента или необходимого субстрата, без которого проявление боли не возникает.

Боль по-прежнему является преобладающим симптомом при эндометриозе и может иметь различное происхождение: ноцицептивная, невропатологическая и воспалительная или, вероятно, комбинация всех трех [36]. Первоначальные сообщения об уникальном присутствии сенсорных нервных волокон в эутопическом эндометрии у женщин с эндометриозом были поставлены под сомнение, вполне вероятно, что нервные волокна эндометрия коррелируют с болью независимо от основного заболевания [22, 40]. Однако усиление иннервации перитонеальных эндометриоидных гетеротопий и при глубоком инфильтративным эндометриозе может быть более тесно связано с эндометриозом и воспалением и соответственно с болью в области малого таза [10, 32, 45, 50]. Воспаление вызывает нейроангиогенез, присущий эндометриозу, и экспрессию белков, участвующих в ангиогенезе, с активацией провоспалительных и клеточных механизмов регенерации, таких как VEGF, простагландин Е2, СОХ-2, IL-6 и АКТГ. Эти результаты были продемонстрированы в гетеротопиях при эндометриозе и в перитонеальной жидкости на модели химерной мыши с использованием человеческой эндометриоидной линии клеток [9]. Длительное воспаление вызывает изменения микрососудистого фенотипа эндотелиальных клеток, которое напрямую играет решающую роль в ангиогенезе и связано с состоянием иммунных реакций [19]. Несмотря на то что уровень VIP повышен при воспалении, существуют и другие механизмы, посредством которых VIP стимулирует ангиогенез. VIP стимулирует синтез индуцированного ишемией VEGF в клетках карциномы предстательной железы и культивируемых микрососудистых эндотелиальных клетках, но может также давать проангиогенный эффект, не зависящий от гипоксии [17, 28, 51]. Будущие исследования могут выявить, играет ли VIP роль регулятора: в образовании кровеносных сосудов эндометрия, в нормальной регенерации после менструации, является результатом хронического воспаления при эндометриозе или и то и другое.

Результаты настоящего исследования показывают, что ангиогенная активность, полуколичественно выраженная как ПМС, существенно увеличивается в эутопическом эндометрии у женщин с эндометриозом и наличием боли по сравнению с контролем и больными с эндометриозом без хронической тазовой боли. Иммуногистохимические исследования показали усиление окрашивания VIP у больных с эндометриозом и наличием боли. Нейроангиогенез включает нейронное продуцирование СЭФР-А и стимуляцию роста кровеносных сосудов вместе с прорастающими нервами, и, наоборот, сосуды могут производить наведенные сигналы для роста аксонов [26]. Особый интерес в контексте проведенного исследования представляют факты о том, что парасимпатические VIP-содержащие нервные волокна следуют за кровеносными сосудами и регулируют вазодилатацию [48]. Из этого следует, что иммуногистохимическое окрашивание для VIP будет увеличиваться в ткани с более высокой ПМС. В наших образцах эндометрия VIP-иммунореактивность наблюдалась главным образом в кровеносных сосудах, но также в нервных волокнах и, возможно, иммунных клетках в строме. Необходимо более детальное исследование для уточнения источников продукции VIP в эндометрии и их относительной важности.

Поскольку иммуногистохимические исследования при эндометриозе чувствительны к аберрациям из-за гетерогенности исследуемой популяции, качества образцов тканей и методологических несоответствий, мы дополнили наше исследование с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга. Уровень VIP-пептидов в эутопическом эндометрии по данным вестерн-блоттинга подтвердил результаты иммуногистохимического исследования. В то же время экспрессия мРНК не поддерживала различий между больными с эндометриозом и отсутствием боли и нормой, по данным иммуногистохимии и вестерн-блоттинга. Отмечалось только небольшое увеличение уровня VIP мРНК у больных с эндометриозом и наличием боли по сравнению с двумя другими когортами пациентов. Являются ли эти несоответствия реальными различиями или это зависит от размера выборки образцов для анализа qPCR и WB? Учитывая, что для нахождения статистических различий использовался критерий Манна—Уитни, данное положение правомерно.

Наиболее интересным с клинической точки зрения является вопрос о связи концентрации IL-6 в крови с болью по аналогии с гипотезой о роли воспаления в нейроангиогенезе. Ряд авторов [44, 53] указывают на то, что IL-6 является как экстренным регулятором патологической боли, так и триггером локальной боли. В проведенной работе показано, что содержание IL-6 в крови повышено у женщин с хронической тазовой болью, что свидетельствует о наличии признаков воспаления в области малого таза, которое в свою очередь поддерживается высокими значениями ПМС в гетеротопиях при перитонеальной форме эндометриоза [16]. В исследовании I. Velasco и соавт. [47] установлено, что у больных с эндометриозом наблюдался более высокий уровень IL-6, чем у женщин с доброкачественными, не эндометриоидными кистами яичников. Более того, концентрация IL-6 коррелировала с интенсивностью дисменореи и хронической болью в области таза. В более раннем исследовании [40] было установлено, что женщины с эндометриозом имеют повышенные значения уровня IL-6 в перитонеальной жидкости, что коррелировало с результатами лапароскопических исследований по распространению эндометриоза и спазмами в области таза, однако связь с болью обнаружить не удалось. В проведенном исследовании основным показанием для лапароскопии было бесплодие, а не боль. Оценку тяжести тазовой боли и дисменореи проводили в соответствии с ограничением трудоспособности и диспареунией. Оценку боли проводили по шкале ВАШ от 0 до 10 баллов, средняя оценка боли у 51 женщины с болью составила 4,8 балла.

Наши результаты показали присутствие VIP в волокнах малого сенсорного нерва, а также его участие в воспалительных процессах, что указывает на предполагаемую роль VIP в реализации боли, связанной с эндометриозом. Это предположение частично подтверждается связью между иммуногистохимическими данными в эндометрии и оценкой боли во время гистероскопической биопсии, продемонстрированной А. Di Spiezio Sardo и соавт. [21]. Авторы исследовали экспрессию панели маркеров нервных волокон в эндометрии у женщин с и без эндометриоза/аденомиоза, у которых боль была более 5 баллов по шкале ВАШ. Обнаружено самое высокое соотношение между болью и исследуемыми маркерами у пациентов с эндометриозом/аденомиозом при иммуногистохимическом окрашивании VIP не только в нервных волокнах, но и в сосудах и стромальных клетках. Однако авторами не предпринималась попытка проверить иммуногистохимические результаты с помощью количественного анализа и, следовательно, эти данные должны интерпретироваться с осторожностью.

В представленной работе был проведен цикл исследований по экспрессии VIP в эутопическом эндометрии с использованием методов иммуногистохимического окрашивания, вестерн-блоттинга, ПЦР и оценки его содержания в крови. На основании полученных результатов была сформирована гипотеза о наличии у больных с эндометриозом и хронической тазовой болью схожих признаков сверхэкспрессии VIP и нейродегенерации. Следовательно, эндометриоз следует отнести к ассоциированным с VIP заболеваниям: випома (синдром Вернера—Моррисона), рассеянный склероз, артриты, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) [8, 14, 29, 33, 43]. Последующие исследования природы этого явления позволят подтвердить или опровергнуть высказанное предположение. Несомненно, что тазовая боль при эндометриозе не является только проявлением патологического нейроангиогенеза, но может быть ее существенной составляющей.

Таким образом, показано, что больные с эндометриозом и хронической тазовой болью имеют более высокую экспрессию VIP в эутопическом эндометрии, чем больные с эндометриозом без хронической боли. Экспрессия VIP в эндометрии является самой низкой в контрольной группе. У больных с эндометриозом в крови содержание VIP повышено в 2 раза у пациенток без боли и в 2,7 раза у пациенток с наличием боли по отношению к контролю. Содержание VIP в крови при концентрации более 10 нг/мл позволяет предсказать хроническую тазовую боль при эндометриозе с чувствительностью 98,6% и специфичностью 79,3%. В будущем функциональные исследования в эндометрии могут выявить роль VIP в патогенезе эндометриоза с хронической тазовой болью для обоснования потенциальной терапевтической цели.

Благодарности. Выражаем благодарность professor M. Olovsson, PhD C. Moberg, PhD Th. Kunovac Kallak, E. Davey Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие в обсуждениях и поддержку. Работа выполнена по теме: «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами эутопического и эктопического эндометрия и тазовой болью у женщин с эндометриозом», учетный номер Минобрнауки в НТИМИ 0431/01/15. Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской королевской академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (гранд № 8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы, Швеция, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России и Минздравом России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.