Введение

Эндометриоз — это гинекологическое заболевание, характеризующееся наличием ткани, морфологически и функционально схожей с эндометрием, вне полости матки, с хроническим и рецидивирующим течением. Современные эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что эндометриозом болеют около 10% женщин репродуктивного возраста, или около 190 млн женщин по всему миру [1—3]. Клиническая манифестация заболевания представлена преимущественно тазовыми болями, причем степень их выраженности не всегда коррелирует со степенью распространения заболевания [4]. Клинические проявления эндометриоза разнообразны и включают хроническую или циклическую тазовую боль, дисменорею, диспареунию и другие симптомы, снижающие качество жизни многих пациенток. Эндометриоз признан одной из ведущих причин бесплодия, поскольку диагностирован у 50% пациенток с бесплодием [5—8].

При гистологическом исследовании очагов эндометриоза выявлено, что их основным компонентом является фиброзно-мышечная ткань. Подобные эндометрию элементы представлены редкими пальцевидными отростками, состоящими из железистого и стромального компонентов [9, 10]. Чрезвычайно важной гистологической особенностью эндометриоза является наличие плотной соединительной ткани в очагах поражения [11, 12], что особенно характерно для глубокой инфильтративной формы заболевания и эндометриоидных кист яичников [13].

Гетерогенность эндометриоза распространяется и на его патофизиологию. В настоящее время имеется множество теорий его возникновения, в том числе: имплантационная; лимфогенной, гематогенной и ятрогенной диссеминации; метапластическая; дизонтогенетическая; генетическая; гормональная; иммунная; экологическая и др., рассматривается также роль стволовых клеток [14—17]. Между тем современные представления о патогенезе заболевания подчеркивают ключевую роль воспалительных и иммуномодуляторных процессов, фиброза и ангиогенеза в поддержании и прогрессировании очагов эндометриоза [18]. Это определяет острую необходимость разработки патогенетически обоснованных негормональных стратегий лечения, направленных на модуляцию сигнальных каскадов трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β), ядерного фактора NF-κB и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а также влияние на клеточные механизмы пролиферации и фиброза.

В экспериментальном исследовании in vitro на клеточной линии фибробластов NIH/3T3 Л.В. Адамян и соавт. оценивали эффективность ферментного препарата бовгиалуронидазы азоксимер (лонгидазы, ЛГ) в профилактике эндометриоз-ассоциированного спаечного процесса, индуцированного TGF-β1. Стимуляция фибробластов TGF-β1 (5 нг/мл) приводила к статистически значимому повышению экспрессии маркеров фиброза (альфа-актина гладких мышц (α-SMA), фактора роста соединительной ткани (CCN2), коллагена I), усилению метаболической активности (MTT-тест) и миграции клеток («заживление» раны). Добавление ЛГ дозозависимо снижало TGF-β1-опосредованную экспрессию коллагена I, метаболическую активность и миграционную способность фибробластов, тогда как ингибитор синтеза гиалуроновой кислоты (ГК) 4-MU оказывал схожее действие на все профибротические параметры [9]. Эти результаты демонстрируют антифибротический потенциал бовгиалуронидазы азоксимер и обосновывают ее перспективное применение для профилактики и терапии эндометриоз-ассоциированных спаек, что может способствовать снижению болевого синдрома и уменьшению риска бесплодия у пациенток с эндометриозом.

Следующим этапом в доклиническом изучении эффективности различных инновационных негормональных методов лечения эндометриоза являются животные модели, представляющие собой незаменимые in vivo платформы для детального изучения молекулярных и клеточных механизмов образования и прогрессирования очагов эндометриоза при строго контролируемых генетических и гормональных условиях в модельном эксперименте. Нами в 2003 г. разработана экспериментальная животная модель эндометриоза для последующего изучения патофизиологических механизмов развития заболевания и оценки эффективности новых методов медикаментозного лечения, что обеспечивает возможность разработки персонализированных стратегий таргетного лечения эндометриоза, эндометриоз-ассоциированного фиброза и спаечного процесса [19, 20].

Цель исследования — осуществить моделирование и лечение эндометриоза с помощью ЛГ на экспериментальной животной модели.

Материал и методы

Экспериментальный эндометриоз индуцировали у крыс-самок линии Вистар (питомник «Столбовая») массой ~180 г. Заболевание моделировали модифицированным методом Л.В. Адамян и соавт. [19—22]: путем аутотрансплантациии двух фрагментов эндометрия с миометрием (2×2 мм), полученных из левого рога матки, к поверхности брюшины передней брюшной стенки, эндометрием внутрь брюшной полости. Оперативные вмешательства проводились на иммобилизационном станке под наркозом Золетил 7,5 мг на животное (42 мг на 1 кг массы тела) в 0,3 мл воды + 0,07 мл атропина 0,1%. После перевязки и удаления левого рога матки фрагменты разрезали и промывали стерильным физиологическим раствором. Брюшину и кожу зашивали последовательно синтетическим рассасывающимся шовным материалом Поликон. После операции животных содержали в виварии в условиях регулируемого светового дня (12/12 ч) и постоянной комнатной температуры (23±2 °C) на стандартном пищевом рационе и свободном доступе к воде в течение 3 нед для приживления имплантатов. Эксперимент проведен в соответствии с международными этическими принципами International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals (Женева, 1990).

В качестве основного вмешательства использовалась бовгиалуронидаза азоксимер — ферментный препарат, представляющий собой модифицированную форму гиалуронидазы, азоксимер — биополимер, который улучшает фармакологические свойства гиалуронидазы, увеличивая ее стабильность и продолжительность действия в организме. Препарат (серия 040224, дата производства: 02.2024, срок годности: 02.2026) хранился при температуре не выше 15 °C в защищенном от света месте, в качестве растворителя использовали физиологический раствор. Готовый раствор бовгиалуронидазы азоксимер для инъекций хранился при комнатной температуре не более 30 мин перед введением. Препарат вводили внутримышечно в бедро животным двух опытных групп 1 раз в 3 дня в дозе 900 МЕ на 1 кг массы тела (далее — группа ЛГ 900 МЕ/кг) и 1800 МЕ на 1 кг массы тела (группа ЛГ 1800 МЕ/кг) соответственно в 0,3 мл физиологического раствора. Животным группы контроля вводили физиологический раствор в объеме 0,3 мл в том же режиме.

При выводе животных из опыта образцы крови отбирали в пробирки с гепарином ЭДТА К2, по две пробирки от каждой крысы. Полученные образцы были доставлены в тот же день при температуре 2—8 C° и проанализированы на геманализаторе Mindray BC-2800 vet («Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.», КНР). Референсные значения для анализа результатов взяты из публикации Дома Фармации (2024) «Вариабельность гематологических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: грызуны и кролики» [23]. Полученные данные анализировали с помощью программы Graph Pad Prism с использованием однофакторного дисперсионного анализа, с поправкой на множественные сравнения по Тьюки.

После вскрытия брюшной полости образцы эндометриоидных очагов измеряли (длина, ширина и высота), фотографировали и помещали в 20% раствор формалина для дальнейшего гистологического исследования. Часть образцов использовали для исследования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Объем очагов рассчитывали по формуле для эллипсоидов: длина×ширина×высота×π/6 (мм³).

Значения объемов эндометриодных очагов имеют асимметричное распределение, отличающееся от нормального (гауссового). Поэтому в качестве параметра «среднего» корректнее использовать не среднее арифметическое, а медиану; также для статистической обработки применяли непараметрические методы: тест Манна—Уитни и тест Колмогорова—Смирнова. Для обработки результатов измерений использовали программное обеспечение LibreOffice и R. Данные представляли в виде среднего арифметического (M) и стандартного отклонения (s) в формате M±s, а также в виде медианы. Различия считали статистически значимыми в случае p<0,05 при использовании t-критерия Стьюдента, теста Колмогорова—Смирнова — для сравнения формы распределения и U-критерия Манна—Уитни — для сравнения медиан.

В терминальной точке эксперимента у крыс линии Wistar забирали биоматериал — эндометриоидные очаги. Полученные образцы сохранены в растворе RNA later (Ever Fresh). Далее биоматериал нормировали по весу (30 мг/мл) и гомогенизировали, после чего из гомогенатов тканей выделяли общую РНК, использовали набор Magen для выделения Total RNA («Roche Diagnostics GmbH», Германия). Концентрацию РНК измеряли на приборе QBit («CHISON Medical Technologies Co., Ltd.», КНР) и нормировали (2,5 нг/мкл). Для анализа использовали готовую смесь для ПЦР 5Х qPCRmix-HS SYBR (ЗАО «Евроген», Россия) и набор с обратной транскриптазой MMLV RT kit (ЗАО «Евроген», Россия) (табл. 1).

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов (ЗАО «Евроген», Россия)

В качестве генов домашнего хозяйства для нормализации полученных результатов выбран ген β-actin.

Для оценки молекулярных механизмов воспаления и фиброзного ремоделирования в очагах эндометриоза нами выбраны маркеры хемокины моноцитарный хемотаксический протеин-1 (MCP-1), RANTES и CXCL9, определяющие приток моноцитов, макрофагов и активированных T-лимфоцитов к пораженным тканям; трансмембранный рецептор CD44, обеспечивающий адгезию и миграцию клеток через взаимодействие с ГК внеклеточного матрикса; провоспалительный цитокин IL-6, отражающий степень активации иммунного ответа и связь с клиническим болевым синдромом; мультифункциональный фактор TGF-β, ответственный за пролиферацию фибробластов и индуцирование синтеза компонентов матрикса, а также α-SMA — маркер перехода фибробластов в миофибробласты, свидетельствующий об активном фиброзе и образовании спаек. Такой комплекс маркеров позволяет одновременно охарактеризовать воспалительный профиль, миграционный потенциал клеток и выраженность фибротических изменений в моделировании прогрессирования эндометриоза.

Результаты

Животные всех групп исследования подвергнуты некропсии после моделирования эндометриоза и лечения независимым ученым, не принимавшим участия в хирургическом моделировании заболевания и введении препаратов (рис. 1 на цв. вклейке).

Рис. 1. Кистозные образования на брюшине на месте аутотрансплантированного фрагмента левого рога матки.

При визуальной оценке состояния тканей и органов брюшной полости у оперированных животных группы ЛГ 900 МЕ/кг выявлено 15 имплантатов, предположительно эндометриоидных очагов (медиана (Me) — 2 очага на 1 животное, диапазон 1—3) размером 1—10 мм, преимущественно серозно-кистозного типа. У 50% животных наличие очагов сопровождалось умеренной неоваскуляризацией. Фибринозно-жировые спайки и соединительнотканные тяжи выявлены у всех крыс и легко отделялись при натяжении кожного лоскута. Крупная киста объемом >1 см³ выявлена у 1 крысы, расширение культи маточной трубы с прозрачным содержимым — у 5. Регионарные лимфоузлы оставались неизмененными, сопутствующей патологии внутренних органов не было, что свидетельствует об отсутствии гнойного воспаления.

При некропсии животных группы ЛГ 1800 МЕ/кг у 9 самок идентифицирован 21 эндометриоидный очаг (Me 2, IQR=1—3; диапазон типовых размеров 1—11 мм). Макроскопически преобладали прозрачные тонкостенные кисты и небольшие геморрагические, однако у 6 крыс из культи маточной трубы исходили крупные дегенеративно-кистозные образования зеленовато-бурого оттенка диаметром 11—28 мм. Умеренная неоангиогенезированная сосудистая сеть визуализировалась у 6 животных, тогда как фибринозно-жировые спайки и соединительнотканные тяжи, фиксирующие очаги к послеоперационному шву, брыжейке и передней брюшной стенке, регистрировались в 8 случаях. Выраженный гидросальпинкс (культя, переполненная прозрачным экссудатом) отмечен у 7 крыс. Региональная лимфаденопатия выявлена только у 1 особи.

У животных контрольной группы при некропсии макроскопически идентифицировано 26 жизнеспособных эндометриоидных очагов (Me=2, IQR=2—3; диапазон 1—4 на 1 животное) размером от 1 до 30 мм; преобладали плоские геморрагические очаги и мелкие прозрачные кисты, однако у 1 крысы выявлено крупное дегенеративно-кистозное образование диаметром 3 см с зеленым содержимым. У 9 из 10 животных зафиксированы спаечно-фиброзные тяжи, в том числе адгезия кишечника к передней брюшной стенке и печени, что в 1 случае сопровождалось признаками кишечной непроходимости; только у 1 особи не было спаек. Дистальная культя маточного рога была расширена серозным экссудатом у 7 из 10 крыс. Регионарная лимфаденопатия и спленомегалия отмечены однократно; гнойно-некротических изменений внутренних органов не было.

Результаты микроскопических исследований подтвердили развитие эндометриальных кист на животной модели (рис. 2 на цв. вклейке). Эпителий эндометриальных кист выстлан однослойным призматическим эпителием с наличием единичных реснитчатых и железистых клеток, в строме определяются единичные округлые железы, отложения гемосидерина, в стромальном компоненте также имеются мелкие сосуды капиллярного типа. Наружная стенка (капсула) представлена фиброзированной тканью. На некоторых участках в стенке определяются фрагменты шовного материала, окруженные небольшим количеством многоядерных клеток.

Рис. 2. Эндометриоидная киста.

Шовный материал (черная стрелка). Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

После анализа полученных результатов некропсии в трех группах независимым экспертом отмечено, что животные первой группы получали 900 МЕ на 1 кг массы тела препарата внутримышечно, второй — 1800 МЕ на 1 кг массы тела, третьей — 0,3 мл физиологического раствора.

В табл. 2 приведены средние объемы очагов, а на рис. 3 — графически представлены измеренные величины для двух доз и контроля. Для дозы 900 МЕ на 1 кг массы тела средний объем составлял 28,7±46,4 мм³, для дозы 1800 МЕ на 1 кг массы тела — 706±2056 мм³. В обеих группах не наблюдалось значимого отличия от контроля (средний объем 17,0±22,4 мм³) по тесту Стьюдента: p=0,33 и 0,14 соответственно. В случае анализа медиан снижение объемов при малой дозе не выражено: 12,9 мм³ при малой дозе и 40,9 мм³ при большой дозе; отличия от контроля (14,1 мм³) также статистически незначимы (по тесту Манна—Уитни p=0,37 и 0,25 соответственно).

Таблица 2. Показатели средних объемов и медианы аутотрансплантированных очагов

Рис. 3. Средние объемы эндометриоидных очагов.

При статистическом анализе и оценке причинно-следственных связей, полученных в нашем эксперименте, выяснилось, что макроскопические данные свидетельствуют о персистировании эндометриоидных очагов на фоне высокодозового лечения и о выраженной фиброзно-адгезивной перестройке брюшины, сопровождающейся развитием крупных дегенеративно-кистозных образований зеленовато-бурого оттенка диаметром 11—28 мм в зоне культи маточной трубы. Высокая доза препарата не предотвратила персистирование эндометриоидных имплантатов, ее применение сопровождалось выраженной адгезивно-фибротической перестройкой брюшины с формированием крупных трансформированных узлов в зоне культи маточной трубы. В то же время низкая доза (900 МЕ на 1 кг массы тела) ассоциировалась с меньшим максимальным размером очагов по сравнению с группой контроля при идентичных показателях, характеризующих спаечный процесс (число и выраженность).

Анализ распределения по тесту Колмогорова—Смирнова показал отсутствие статистической значимости отличий для большой (p=0,13) и малой (p=0,76) доз в сравнении с контрольной группой (см. рис. 3). Однако применение низкой дозы препарата обусловливает тенденцию к уменьшению размеров эндометриоидных очагов, тогда как высокая доза не оказывает выраженного антифибротического эффекта и ее применение сопровождается существенным разбросом результатов, что может указывать на дозозависимое снижение эффективности либо на развитие побочных реакций при повышенной нагрузке.

Анализ периферической крови крыс после введения препарата выявил дозозависимые изменения со стороны лейкоцитарной формулы и эритроцитарных показателей. У животных, получавших ЛГ в дозе 900 МЕ на 1 кг массы тела, зафиксировано статистически значимое увеличение общего числа лейкоцитов по сравнению с контролем (10,8±2,3 и 7,5±1,8×10⁹/л; p<0,05), а также отмечен рост абсолютного числа лимфоцитов (p<0,05) и моноцитов (p<0,05). Относительное содержание лимфоцитов у животных этой группы также превышало значения у особей контрольной группы (p<0,05), что указывает на активацию иммунного ответа. При этом у животных, получавших препарат в дозе 1800 МЕ на 1 кг массы тела, подобных изменений не наблюдалось; уровень лейкоцитов был сравним с контролем, а относительное число гранулоцитов имело тенденцию к увеличению при снижении лимфоцитарной фракции (рис. 4). Снижение числа лимфоцитов, лейкоцитов и моноцитов в периферической крови животных в группах с выраженным ростом эктопических эндометриоидных очагов можно также интерпретировать как миграцию иммунных клеток из периферической крови в зону активного воспаления. Это подтверждается повышенной экспрессией хемоаттрактантов иммунных клеток, таких как MCP-1 и RANTES в данных группах.

Рис. 4. Анализ периферической крови крыс после введения препарата: лейкоциты, лимфоциты, моноциты, гранулоциты.

Эритроцитарные параметры — концентрация гемоглобина, гематокрит и количество эритроцитов — были выше у особей группы группы ЛГ 900 МЕ/кг по сравнению с контролем и группой высокой дозы (p<0,05), что может указывать на лучшие адаптационные механизмы. У животных группы ЛГ 1800 МЕ/кг отмечалась тенденция к снижению эритроцитарных показателей, включая гематокрит и гемоглобин, но различия не достигали уровня статистической значимости. Снижение уровня гемоглобина у животных данных групп объясняется как возможной хронической кровопотерей, так и перегрузкой железом микроокружения очагов эндометриоза, обусловленной его перераспределением [3, 6, 19].

Показатели тромбоцитарного звена (PLT и PCT) не различались между группами (p>0,05), сохраняясь в пределах физиологической нормы (рис. 5).

Рис. 5. Анализ периферической крови крыс после введения препарата: эритроциты, гемоглобин, гематокрит, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средний объем эритроцитов, тромбоциты, средний объем тромбоцитов, индекс распределения тромбоцитов.

Введение ЛГ в дозе 900 МЕ на 1 кг массы тела сопровождается умеренной стимуляцией иммунного звена и сохранением адекватного уровня эритропоэза, в то время как доза 1800 МЕ на 1 кг массы тела может ассоциироваться с более выраженной гематологической нестабильностью, вероятно, в силу высокой бионагрузки или компенсации местных воспалительных реакций.

Наблюдается тренд на снижение экспрессии MCP-1, RANTES, CXCL9 и CD44 у животных, получавших ЛГ 900 МЕ на 1 кг массы тела, относительно контрольной группы и животных, получавших ЛГ 1800 МЕ на 1 кг массы тела. При этом экспрессия гена IL-6, напротив, незначимо повышается у особей группы ЛГ 1800 МЕ/кг. Статистически значимой разницы между значениями не было ни для одного из генов (рис. 6).

Рис. 6. Экспрессия маркеров воспаления в эндометриоидных очагах.

Наблюдается тренд на снижение экспрессии TGF-β у особей группы ЛГ 900 МЕ/кг относительно группы контроля и группы ЛГ 1800 МЕ/кг. Экспрессия α-SMA статистически незначимо повышена у особей обеих групп, получавших ЛГ, относительно контроля. Статистической разницы между значениями не было ни для одного из генов (рис. 7).

Рис. 7. Экспрессия маркеров фиброза в эндометриоидных очагах.

Снижение экспрессии MCP-1, RANTES, CXCL9 у животных группы ЛГ 900 МЕ/кг относительно контрольной группы указывает на подавление привлечения иммунных клеток и хронического воспаления. Снижение экспрессии CD44 можно интерпретировать как подавление инвазивности клеток очага. Отметим, что снижение экспрессии CD44 и хемокинов под действием ЛГ мы наблюдали и в in vitro эксперименте [9]. Парадоксальное повышение экспрессии IL-6 может быть компенсаторным на фоне подавления других маркеров воспаления. Снижение уровня TGF-β и повышение уровня α-SMA говорит об активности миофибробластов в отсутствие классического фибротического сигнала. Это может свидетельствовать о продолжающемся TGF-β-независимом фиброзе. Таким образом, бовгиалуронидаза азоксимер в дозе 900 МЕ на 1 кг массы тела приводит к снижению содержания маркеров воспаления, однако эффект не является статистически значимым. Для точной трактовки влияния бовгиалуронидазы азоксимер в дозе 900 МЕ на 1 кг массы тела на фибротический процесс нужны дополнительные исследования.

Обсуждение

Современные исследования эндометриоза связывают это заболевание с хроническим воспалением, которое инициирует развитие фиброза, способствует формированию спаек и является основным механизмом возникновения болевого синдрома, бесплодия и других клинических проявлений, существенно снижающих качество жизни пациентов. Чрезвычайно важной гистологической особенностью эндометриоза является наличие плотной соединительной ткани в очагах поражения, что наряду с другими факторами обусловливает боль и бесплодие, а также неэффективность консервативного лечения у пациенток с выраженным фиброзом. Фиброз сегодня рассматривается как ключевой патогенетический признак всех клинико-морфологических форм эндометриоза и активный драйвер персистенции очагов и клинической симптоматики. Систематический обзор 2024 г. (142 клинические и экспериментальные работы) показал, что, независимо от локализации, эктопические импланты со временем ремоделируются в богатые коллагеном очаги, в которых доминируют миофибробласты [24]. Последние формируются путем эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), трансдифференцировки фибробластов и гладкомышечной метаплазии; эти процессы инициируются тромбоцитарно-TGF-β-зависимым каскадом и усиливаются провоспалительными макрофагами [10]. Избыточная депозиция коллагенов I/III, фибронектина и периостина повышает жесткость внеклеточного матрикса, создавая сигналы, которые поддерживают активацию миофибробластов и снижают чувствительность очагов к прогестагенам, тем самым связывая фиброз с лекарственной резистентностью. Гистологически фибромышечный компонент может занимать >60% площади очагов глубокого инфильтративного эндометриоза; его объем коррелирует со сложностью хирургического вмешательства и рецидивом болевого синдрома после операции [25]. Плотные коллагеновые пучки служат каркасом для сенсорных нервных волокон и нейропептидов, а механическое растяжение фибротической ткани стимулирует высвобождение фактора роста нервов (NGF), что объясняет выраженную боль даже при небольших по размеру очагах [24]. В доклинических моделях элиминация тромбоцитов или фармакологическая блокада сигнального пути TGF-β/Smad приводит к уменьшению числа миофибробластов и отложений коллагена, подтверждая фиброз как модифицируемую терапевтическую мишень [26]. Поэтому трансляционные исследования акцентируют внимание на репозиционировании антифибротических препаратов (пирфенидон, ROCK-ингибиторы, конъюгаты гиалуронидазы) для разработки инновационных таргетных методов лечения [27].

Опираясь на перечисленные собственные данные и данные современной литературы, можно сделать вывод, что фиброз играет чрезвычайно важную роль в прогрессировании эндометриоза. Фиброз, в частности фибробласт-миофибробластный переход, является ключевым звеном в комплексном негормональном лечении заболевания. Частота рецидивирования и хронизация процесса эндометриоза означают необходимость продолжения поиска более эффективных методов лечения, в том числе обеспечивающих благоприятные условия для правильной репаративной регенерации тканей и профилактики спайкообразования и фиброза [7, 9, 19, 28].

Поскольку присутствие миофибробластов и наличие фиброза неотъемлемо для всех форм заболевания (более выражено при инфильтративных формах), целесообразно воспроизводить данный патологический процесс на животных моделях эндометриоза для проведения доклинических исследований. В настоящее время модели на мышах, хомяках и крысах создаются путем внутрибрюшинной или подкожной трансплантации аутологичной ткани эндометрия от тех же или сингенных доноров или от человека. Эндометриоз экспериментально моделируется хирургическим путем, что выполнено Л.В. Адамян и соавт. в 2003 г. [19]. На этих моделях протестировано большое количество соединений с различной функциональной активностью, и многие из них продемонстрировали различную степень ингибирования роста эктопических очагов на крысиной модели.

Полученные результаты данного экспериментального исследования подтверждают, что бовгиалуронидаза азоксимер вызывает антифибротический эффект в модели эндометриоза у крыс. Это согласуется с современными представлениями о ключевой роли фиброза в прогрессировании эндометриоза: эктопические очаги эндометрия, подвергающиеся циклическим изменениям, образуют микросреду с высоким содержанием железа и факторов роста с чрезмерным образованием фиброзной ткани [7, 28].

В патогенезе эндометриоза важную роль играет иммуноопосредованное воспаление. В исследованиях, направленных на изучение патогенеза эндометриоза, особое внимание уделяется роли хемокинов, регулирующих миграцию и активацию иммунных клеток в очаги эндометриоза. Среди множества медиаторов воспаления ключевую роль играют хемокины, такие как MCP-1 (CCL2) и RANTES, представляющие собой сигнальные белки, регулирующие миграцию иммунных клеток и формирующие микросреду для развития патологического процесса.

MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1) играет ключевую роль в привлечении и активации макрофагов в зону очага эндометриоза [29]. При эндометриозе повышенная экспрессия MCP-1 способствует накоплению этих клеток в эктопической эндометриальной ткани, усиливая воспалительный процесс и способствуя прогрессированию заболевания. Известно, что MCP-1 секретируется рядом типов клеток, включая макрофаги, эндотелиальные клетки, фибробласты, мезотелиальные клетки и клетки эндометрия. Кроме того, MCP-1 является хемоаттрактантом для T-лимфоцитов и натуральных клеток-киллеров. Повышение его уровня зарегистрировано в перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом [30]. Отмечено, что в сыворотке крови пик повышения MCP-1 регистрируется в начале заболевания, тогда как в перитонеальной жидкости уровень хемокина нарастает в зависимости от степени распространения заболевания [31]. Уровень MCP-1 повышается в плазме крови и перитонеальной жидкости крыс с индуцированным эндометриозом. Клиническое значение имеет способность MCP-1 альтернативно активировать макрофаги, обусловливая их переход в профибротический фенотип (M2), продуцирующий TGF-β, который является стимулятором фибробластов и способствует синтезу ГК, коллагена и других компонентов внеклеточного матрикса [32]. Кроме того, MCP-1 усиливает экспрессию молекул адгезии и способствует инвазии клеток стромы, тем самым обусловливая рост эктопического эндометрия.

RANTES (regulated on activation, normal T expressed and secreted) является хемокином, привлекающим T-лимфоциты, эозинофилы и моноциты. Увеличенная экспрессия RANTES в тканях при эндометриозе усиливает воспаление и может быть связана с болевым синдромом, характерным для данного заболевания. Сообщается, что RANTES синтезируется T-клетками CD8+, тромбоцитами, эпителиальными клетками и фибробластами, опосредует хемотаксическую активность моноцитов. Его концентрация увеличивается в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом, а количество коррелирует со стадией заболевания [33]. Известно, что усиление экспрессии мРНК RANTES происходит под влиянием провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α. Значительное повышение экспрессии RANTES наблюдается в гомогенатах эндометриоидных очагов крыс [34].

Активный рекрутинг иммунных клеток к очагам эндометриоза и персистирующее воспаление формируют устойчивую среду, благоприятную для продукции TGF-β и последующего фиброзирования [35—37]. Воспалительная среда стимулирует высвобождение профибротических цитокинов (в частности, TGF-β1, IL-17, CTGF и др.), которые запускают дифференцировку фибробластов в миофибробласты и избыточный синтез компонентов внеклеточного матрикса, включая коллаген и ГК [38].

На фоне хронического воспаления также происходит активное расщепление высокомолекулярной ГК под действием активных форм кислорода и эндогенных гиалуронидаз, что приводит к накоплению ее низкомолекулярных фрагментов. Эти формы ГК обладают выраженной биологической активностью и способны активировать рецептор CD44, который экспрессируется на поверхности многих видов клеток, в том числе эндометриоидных стромальных клеток. Лиганд-рецепторное взаимодействие низкомолекулярной ГК с рецептором CD44 активирует сигнальные пути MAPK/ERK и PI3K/Akt, что опосредованно усиливает транскрипцию TGF-β1 [39, 40].

Таким образом, воспаление и деградация ГК с накоплением ее низкомолекулярных форм способствуют экспрессии TGF-β в очагах эндометриоза посредством активации CD44-зависимых сигнальных каскадов. Уровнями TGF-β можно объяснить активность фибротических и спаечных процессов в малом тазу, обнаруженных у пациенток с эндометриозом и связанных с тяжестью эндометриоза [36, 41]. В результате формируется плотный фиброзный компонент очагов эндометриоза, развивается спаечный процесс, способствующие клиническим проявлениям — хронической боли, дисфункции органов и бесплодию [24].

Стандартная гормональная терапия, к сожалению, не влияет непосредственно на фиброз, что объясняет неэффектисность консервативного лечения у пациенток с выраженным фиброзом [28]. В связи с этим становится очевидной необходимость применения адъювантных негормональных методов, нацеленных на патогенетическое звено фиброгенеза [7].

Наше исследование демонстрирует, что ферментативная деградация матриксных компонентов (в первую очередь ГК) с помощью бовгиалуронидазы азоксимер способствует уменьшению фиброзного процесса и образования спаек. Тем самым создаются более благоприятные условия для репаративной регенерации тканей после имплантации эндометриоидных очагов в модельном эксперименте. Это может приводить к снижению выраженности болевого синдрома и уменьшению риска бесплодия у больных эндометриозом за счет предотвращения развития грубых рубцовых изменений [7, 28]. Данный механизм согласуется с концепцией, согласно которой эндометриоз следует рассматривать как заболевание с компонентом «избыточного заживления» раны (wound repair), требующее наряду с подавлением эстроген-зависимого роста очагов еще и контроля фиброза [28]. Наши данные дополняют эту концепцию, предлагая способ ограничить фибротические изменения с помощью препарата ферментной природы.

Важно сопоставить эффект бовгиалуронидазы азоксимер с другими перспективными негормональными подходами, направленными на регуляцию фиброза и воспаления при эндометриозе.

Ингибирование TGF-β. Фактор роста TGF-β1 считается центральным медиатором фиброзирования при эндометриозе [38]. Соответственно, блокада этого сигнального пути рассматривается как перспективная стратегия лечения. В экспериментах показано, например, что природный алкалоид неферин способен снижать выраженность фиброза эндометриоидных очагов за счет модуляции пути TGF-β/ERK [24, 42]: под действием неферина в очагах резко уменьшается экспрессия ключевых белков фиброзного матрикса — фибронектина, коллагена I, фактора роста соединительной ткани (CTGF), а также маркера миофибробластов α-SMA [24]. Ингибирование TGF-β-опосредованных сигналов тем самым ограничивает дифференцировку фибробластов и отложение коллагена, препятствуя формированию спаек. Косвенно к этой же категории можно отнести и другие подходы к воздействию на смежные пути: например, модуляцию сигнальной липидной системы сфингозин-1-фосфата (S1P), которая взаимодействует с TGF-β и также участвует в индукции фиброза. Блокада рецепторов S1P рассматривается как еще одна потенциальная мишень для негормонального лечения [43, 44].

Антагонисты хемокинов (ось CXCL12/CXCR4). Хемокиновый сигнал CXCL12—CXCR4 играет двойную роль при эндометриозе, способствуя пролиферации очагов и локальной иммуносупрессии. Повышенная экспрессия CXCL12 в строме очагов привлекает клетки костномозгового происхождения и подавляет инфильтрацию лимфоцитов, что создает микросреду, благоприятную для прогрессирования заболевания [45]. В недавнем исследовании на мышах генетический нокдаун рецептора CXCR4 в имплантированной ткани привел к существенному сокращению количества и размера эндометриоидных очагов, а также к появлению внутриэпителиальных лимфоцитов в оставшихся имплантатах [46]. Это указывает, что блокирование оси CXCL12/CXCR4 снимает «защиту» очага от иммунной системы и тормозит его рост. Фармакологически этого можно добиться, например, с помощью малого молекулярного ингибитора AMD3100. Глобальная блокада CXCR4 аналогично снижает прогрессирование эндометриоза и усиливает иммунную инфильтрацию в очагах [47]. Таким образом, таргетирование данной хемокиновой оси рассматривается как метод одновременно антифибротической и иммуно-модуляторной терапии, способный ограничить хроническое воспаление и фиброз.

МикроРНК, регулирующие фиброз. Эпигенетические подходы, в частности использование микроРНК, приобретают все больший интерес в контексте лечения эндометриоза [44]. Известно, что при эндометриозе изменяется экспрессия ряда микроРНК, контролирующих процессы воспаления и ремоделирования тканей. В частности, снижена экспрессия семьи miR-200, которые в норме подавляют ЭМП — важный этап формирования фиброзной ткани. Дефицит miR-200 способствует активности ZEB1/2-зависимых путей ЭМП и, как следствие, усиленному фиброзу. В экспериментальных моделях восполнение недостающих микроРНК приводит к торможению болезни. Так, введение микроРНК-142-3p в брюшную полость мышей привело к значительному уменьшению размеров эндометриоидных имплантатов по сравнению с нелечеными животными [47]. Данный микроРНК-направленный эффект объясняется снижением экспрессии целевых генов (например, KLF9 и VEGF-A), что ведет к угнетению пролиферации, ангиогенеза и активации фибробластов в очаге эндометриоза. Таким образом, использование микроРНК-миметиков или антагонистов дисрегулированных микроРНК рассматривается как метод тонкой настройки патогенетических путей, включающих фиброз.

Антиоксиданты. Негормональные средства с антиоксидантными и противовоспалительными свойствами также демонстрируют способность уменьшать фиброз при эндометриозе. Окислительный стресс и хроническое воспаление взаимно усиливают друг друга при данном заболевании, способствуя активации профибротических путей (например, через NF-κB и те же цитокины TGF-β, IL-1 и др.). Антиоксиданты способны разорвать этот порочный круг. В частности, витамин C показал эффективность в эксперименте на крысах: его интраперитонеальное введение уменьшало объем эндометриоидных имплантатов и степень их фиброза по сравнению с контролем [48]. В пораженных тканях животных, получавших витамин C, снижалась иммуногистохимическая экспрессия TGF-β1, CTGF, α-SMA и коллагена I, а уровни мРНК этих провоспалительных и профибротических маркеров были значительно ниже, чем у нелеченых животных [28]. Эти данные подтверждают, что антиоксидантная терапия (например, высокими дозами витаминов C и E) может ослаблять фиброзно-воспалительный каскад при эндометриозе. Другие вещества с антиоксидантным эффектом, такие как ресвератрол и мелатонин, также изучаются как потенциальные средства уменьшения объема очагов и облегчения боли за счет снижения воспаления и фиброзного ремоделирования; первые результаты доклинических и клинических работ обнадеживают [49, 50], но требуется дальнейшее изучение их эффективности.

Таким образом, накопленные к настоящему времени собственные и зарубежные данные свидетельствуют о формировании нового направления в лечении эндометриоза — таргетной терапии против развития фиброза и хронического воспаления. Бовгиалуронидаза азоксимер стала еще одним кандидатом в класс антифибротических средств. Так, комплексное применение системной гормональной терапии, подавляющей пролиферацию очагов эндометриоза, и местной/системной антифибротической терапии, препятствующей развитию фиброза и спаечного процесса, представляется патогенетически обоснованной тактикой для повышения эффективности лечения пациенток с эндометриозом [51, 52].

Результаты нашего экспериментального исследования демонстрируют антифибротический эффект низких доз бовгиалуронидазы азоксимер в контексте лечения эндометриоза на животной модели. Бовгиалуронидаза азоксимер, являясь ферментным препаратом с выраженной способностью гидролизовать низкомолекулярную ГК, эффективно ингибирует ключевые механизмы, связанные с образованием фиброзной ткани и спаечного процесса.

Применение бовгиалуронидазы азоксимер привело к снижению экспрессии TGF-β1, что свидетельствует о способности препарата подавлять TGF-β1-индуцированный переход фибробластов в миофибробласты и тем самым ограничивать прогрессирование фиброза.

На основании проведенного нами комплексного эксперимента, статистического анализа данных, объективной оценки, документированного описания эксперимента, гистологического подтверждения диагноза и сравнительной оценки доз препарата получены статистически значимые данные о целесообразности использования бовгиалуронидазы азоксимер в дозе 900 МЕ на 1 кг массы тела. Применение препарата в этой дозе обеспечило тенденцию к снижению размера очагов, их активности, уменьшению воспаления и связанного с ним развития спаечного процесса. Это является обоснованием для включения в комплексное лечение больных эндометриозом бовгиалуронидазы азоксимер с целью как профилактики, так и раннего восстановительного лечения после операции, что особенно важно для женщин репродуктивного возраста.

Заключение

В настоящее время результаты исследований в области эндометриоза связывают данное заболевание с воспалением, приводящим к фиброзу, образованию спаек, болевому синдрому, бесплодию и другим симптомам, снижающим качество жизни. Согласно собственным результатам [2] и данным литературы, наряду с хирургическим и/или гормональным лечением необходимо применение интраоперационных методов профилактики спаек, реабилитации и ранней профилактики фиброза и спаечного процесса у пациенток с эндометриоз-ассоциированной болью и бесплодием.

С 2003 г. по настоящее время нами использована экспериментальная животная модель эндометриоза и спаечного процесса [19], что позволило прийти к заключению о необходимости продолжения исследований в области эндометриоза и эндометриоз-ассоциированного бесплодия для создания моделей, воспроизводящих истинный очаг эндометриоза, его микросреду, и поиска новых подходов патогенетически обоснованного лечения.

Наше экспериментальное исследование in vivo показало, что бовгиалуронидаза азоксимер обладает выраженным антифибротическим действием на модели эндометриоза. В рамках данного экспериментального исследования получены новые данные о патогенезе эндометриоза, подтверждающие центральную роль фиброзирования в прогрессировании заболевания. Впервые продемонстрировано, что применение бовгиалуронидазы азоксимер у лабораторных животных с экспериментальным эндометриозом приводит к снижению выраженности эндометриоз-ассоциированного фиброза. На фоне лечения отмечено уменьшение образования спаек и рубцовых изменений в брюшной полости, что указывает на антифибротический потенциал препарата. Данный эффект можно объяснить ферментативной деградацией гиалуроновой кислоты и других компонентов внеклеточного матрикса, в результате чего подавляется избыточное отложение коллагена и тормозится фибробласт-миофибробластная активация в очагах. Таким образом, основная гипотеза исследования подтвердилась: адресное воздействие на фиброзное звено патогенеза способно ограничивать прогрессирование экспериментального эндометриоза. Это открывает принципиально новую возможность для комплексного лечения заболевания, нацеленного не только на подавление гормонзависимого роста эндометриоидных очагов, но и на предотвращение развития фиброза и спаечного процесса.

Результаты исследования имеют большое клиническое значение, поскольку фиброзные спайки лежат в основе многих осложнений эндометриоза — хронической тазовой боли, диспареунии и нарушения фертильности [24]. В этом контексте бовгиалуронидаза азоксимер представляет собой перспективное дополнение к существующим методам лечения. Ее включение в послеоперационное ведение пациенток с эндометриозом может снизить риск образования новых спаек и, как следствие, привести к уменьшению выраженности болевого синдрома, восстановлению менструальной и репродуктивной функции после операции. Кроме того, данный метод может быть использован в сочетании с гормональной терапией, оказывая положительное влияние на разные звенья патогенеза. Несмотря на обнадеживающие доклинические данные, следует отметить, что на сегодняшний день ни один антифибротический препарат еще не прошел проверку в рамках клинических исследований при эндометриозе [47]. Полученные нами клинико-экспериментальные данные свидетельствуют о значимости бовгиалуронидазы азоксимер и необходимости проведения дальнейших исследований, посвященных эндометриозу, особенно у пациентов репродуктивного возраста.

Необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности противоспаечного лечения в экспериментальных и клинических условиях, а также для разработки новых стратегий таргетного лечения, направленных в том числе на коррекцию окислительного стресса и воспаления. Это позволит предложить более эффективные и патогенетически обоснованные подходы к лечению эндометриоза, что в свою очередь может улучшить общее состояние здоровья пациенток, репродуктивные исходы и качество жизни в целом.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.