Наряду с гормональной регуляцией в последние годы в литературе [17, 23, 24] уделяется внимание как поиску новых факторов, определяющих состояние рецептивности эндометрия, так и оценке альтернативных механизмов. Учитывая универсальность реакций, в которых участвуют интерлейкины, следует предположить, что они также могут оказывать воздействие на состояние рецептивности эндометрия [8, 12].

Сигнальные пути активации интерлейкинов, наряду с ядерной локализацией рецепторов к стероидным гормонам, могут оказывать воздействие на трансформацию эндометрия для наступления беременности [7, 22]. Насколько эти два кажущихся различных механизма регуляции оказывают взаимное влияние или независимое воздействие на рецептивность, могут ответить только прямые клинические и экспериментальные исследования [13, 15, 18].

Тем не менее наступление беременности связано с повышением эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Проблема оценки функционального состояния эндометрия актуальна, когда следует полагаться не на субъективное клиническое предчувствие врача, а использовать объективные инструменты, чтобы предвидеть возможность наступления беременности [21].

В последние годы возрастает интерес к полномасштабной оценке рецептивности эндометрия в отношении исхода беременности, например при проведении ВРТ. Это касается в первую очередь как методов оценки рецептивности, так и сопряженности результатов различных методов. Несомненно, наличие стандарта и консенсуса в его реализации может способствовать широкому внедрению как неинвазивных, так и минимально инвазивных методов исследования [9].

Проведенные нами в 2015 г. исследования экспрессии ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и стромальных клетках эндометрия и содержания мРНК ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B в ткани эндометрия у больных с бесплодием трубного происхождения показали, что при ненаступившей беременности по отношению к наступившей беременности наблюдается снижение экспрессии ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B, по данным иммуногистохимического исследования, и уровня мРНК ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B (down-regulation). Между экспрессией ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей беременностью и контрольными показателями у здоровых женщин таких различий не наблюдалось. Установленные изменения, несомненно, могут влиять на рецептивность эндометрия и приводить к развитию субфертильности у больных с бесплодием трубного происхождения [4].

В доступной литературе отсутствуют данные о статистически значимых различиях в экспрессии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в эутопическом эндометрии по данным иммуногистохимического исследования и количественной полимеразной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR) в период «окна имплантации» и содержании в сыворотке крови LIF, sLIF-R, sgp130 у больных с бесплодием трубного происхождения в зависимости от наступления беременности после проведения ЭКО/ИКСИ.

Цель исследования — изучить экспрессию LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в эутопическом эндометрии по данным иммуногистохимического исследования и qRT-PCR в период «окна имплантации» и содержание в сыворотке крови LIF, sLIF-R, sgp130 у больных с бесплодием трубного происхождения и провести анализ этих данных в зависимости от наступления беременности после проведения ЭКО/ИКСИ.

Под наблюдением находились 120 женщин репродуктивного возраста (от 20 до 37 лет) с бесплодием трубного происхождения в соответствии с МКБ- 10. Из них, согласно критериям включения и исключения, была выделена группа из 29 больных в возрасте от 24 до 37 лет (средний возраст 30,8±3,7 года) с отсутствием маточных труб по поводу внематочных беременностей или окклюзией маточных труб в связи с воспалительными заболеваниями органов малого таза, а также после оперативных вмешательств на маточных трубах, что соответствовало 1—4-й степени спаечного процесса [14]. Подбор и рандомизация больных осуществлялись совместно с проф. Л.Н. Кузьмичевым и врачом А.Н. Онищенко. Клиническая характеристика больных была представлена нами ранее [5]. Контрольную группу составили 20 женщин, которым проводилась стерилизация маточных труб лапароскопическим доступом, как это было описано ранее [10].

Критерии включения: возраст женщин от 24 до 37 лет; бесплодие трубного происхождения, верифицированное по данным лапароскопического и гистероскопического исследований. Критерии исключения: пациентки с бесплодием трубного происхождения и сопутствующей гинекологической патологией; другие виды женского бесплодия; астенотератозооспермия 3-й и 4-й степени у мужа; неудовлетворительная морфологическая оценка эмбрионов.

Дизайн исследования: ретроспективное одномоментное исследование, одобренное этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава Р.Ф. Информированное согласие на участие в исследовании и использование крови и ткани эндометрия было получено у всех пациентов. Клинико-лабораторное обследование пациентов проведено в соответствии с приказом МЗ РФ № 67 от 26.02.03 «О применении ВРТ в терапии женского и мужского бесплодия». Оплодотворение ооцитов осуществлялось в стандартных условиях методами ЭКО или ИКСИ. Стимуляция овуляции проводилась, как было описано нами ранее [5].

Ультразвуковое исследование органов малого таза у больных проводилось до оперативного лечения и после окончания курса терапии с помощью аппарата Aloka SSD-2000 с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц.

Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром до операции, а также после окончания курса медикаментозной терапии (через 3 мес). Образцы сыворотки хранили при –70 °С до момента исследования. Образцы ткани эндометрия для анализа экспрессии мРНК немедленно помещали в раствор RNAlater (RNAlater, «Qiagen GmbH», Голландия) и хранили при –20 °C до проведения исследований. Все образцы биопсии эндометрия были получены в LH+7 (±2), исходя из ежемесячной оценки фазы менструального цикла и дня менструального цикла образцов эндометрия согласно стандартным морфологическим критериям [19].

Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимическое окрашивание для LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 было выполнено в стандартных условиях, как это было описано нами ранее [10, 18]. Использовались следующие первичные антитела: мышиные моноклональные античеловеческие антитела к LIF, ослиные поликлональные античеловеческие антитела к LIF-Rα, ослиные поликлональные античеловеческие антитела к gp130, ослиные поликлональные античеловеческие антитела к SOCS1. Все моноклональные или поликлональные антитела имели класс IgG1. Соответствующий класс иммуноглобулина использовался как отрицательный контроль. Вторичные антитела: биотинизированные лошадиные антимышиные, лошадиные антиослиные, ослиные антикроличьи [18].

Оценка экспрессии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 и соответствующее распределение по клеточным элементам выполнены при использовании полуколичественной системы гистологической шкалы (SCORE) [16]: интенсивность окрашивания от 0 (слабое окрашивание) до 3 баллов (самое интенсивное окрашивание). Доказано, что система SCORE является надежным инструментом оценки экспрессии эндометриальных белков по отношению к количественному определению методом qRT-PCR [20].

Анализ сыворотки крови. Определение концентрации в сыворотке крови LIF, sLIFR, sgp130 проводилось с использованием стандартных реагентов в соответствии с рекомендациями производителя: QuantikineRHuman LIF (DLF00; R&D Systems), sLIFR Platinum ELISAs (BMS246; eBioscienceR, Inc., San Diego, CA, США) и QuantikineRHuman sgp130 (DGP00; R&D Systems). Определение половых и стероидных гормонов проводилось при использовании Immulite 1000 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, США), согласно инструкциям изготовителя. Определение половых и стероидных гормонов ФСГ (мE/л), ЛГ (мE/л), эстрадиола (пмоль/л), прогестерона (нмоль/л) проводилось при использовании Immulite 1000 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, США), согласно инструкциям изготовителя.

Выделение мРНК, синтез комплементарной ДНК (cDNA) и проведение qRT-PCR. Выделение мРНК осуществлялось с использованием реагентов Rneasy Mini Kit (Quiagen, Maryland, США) в соответствии с инструкцией производителя. Очистка мРНК осуществлялась с использованием Agilent bio-analyzer (Agilent technologies, Waldbronn, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Все образцы мРНК имели интегральный показатель сохранности РНК (RIN), численно равный 9, как это было описано ранее [11]. Количественный анализ РНК проводился с использованием реагентов Quant iT RNA assay kit and Qubit (Invitrogen, Carlsbad, CA, США).

Синтез cDNA из ткани эндометрия осуществлялся с использованием реагентов Superscript III First Strand Synthesis для qRT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) в соответствии с рекомендациями производителя в реакции обратной транскрипции. Два микрограмма от общей РНК из ткани эндометрия использовались в реакции обратной транскрипции с применением случайных гексамеров в качестве праймеров.

Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (qRT-PCR) проводили с использованием оборудования Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Применялись праймеры, указанные в табл. 1. Цикл амплификации включал денатурацию при 95 °C в течение 3 мин, 25 циклов амплификации при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 64 °C в течение 45 с и при 72 °C в течение 1 мин. Все исследования проводились в дубликатах и были нормализованы к глицерид-3-фосфатдегидрогеназе (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase — GAPDH) как внутреннему контролю.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics v.20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, США). Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни, частный корреляционный анализ. Различия между группами считались достоверными при p<0,05.

Характеристика больных. Клинико-эмбриональные данные у обследованных больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей или ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ представлены нами ранее [4]. Статистически значимых различий у обследованных двух групп установлено не было.

Содержание в крови LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей и ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ. Как следует из табл. 2, различий в содержании sLIF-R в крови больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей и ненаступившей беременностью после ЭКО/ИКСИ и контрольной группой не было. В то же время содержание LIF и sgp130 у больных с бесплодием трубного происхождения было статистически значимо ниже по отношению к контрольной группе. Наиболее низкие и статистически значимые значения содержания LIF и sgp130 наблюдались у больных с ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ.

На основании полученных результатов был проведен множественный анализ ROC-кривых содержания LIF, sLIF-R, sgp130 в крови для прогнозирования наступления беременности у больных с бесплодием трубного происхождения после проведения ЭКО/ИКСИ (см. рисунок). Как следует из табл. 3, предикция наступления беременности зависит от границы отсечения и определяемого показателя. Так, для границы отсечения содержания в сыворотке крови LIF больше 17,7 пг/мл чувствительность составляет 72,7%, специфичность 56,6%, площадь под кривой 0,773; для sLIF-R при содержании в сыворотке крови больше 1,14 пг/мл — соответственно 90,9, 27,8%, 0,51; для sgp130 при содержании в сыворотке крови больше 231,5 пг/мл — соответственно 90,9, 27,8%, 0,76. Следовательно, наиболее значимые параметры получены для LIF как предиктора наступления беременности.

Экспрессия LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в эндометрии в норме и у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей и ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ. Из табл. 4 следует, что экспрессия в эутопическом эндометрии LIF и LIF-Rα у больных с бесплодием трубного происхождения статистически значимо снижена в поверхностном эпителии эндометрия и эпителии желез по отношению к контрольной группе. У больных с ненаступившей беременностью эти показатели были статистически значимо снижены по отношению к больным с наступившей беременностью.

Снижение уровня экспрессии SOCS1 в поверхностном эпителии было аналогично таковому LIF и LIF-Rα, а в эпителии желез достоверных различий не установлено. Не отмечено статистически значимых различий при анализе данных экспрессии gp130 в поверхностном эпителии и в эпителии желез между контрольной группой и больными с бесплодием трубного происхождения.

Экспрессия мРНК LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в эндометрии у больных с бесплодием трубного происхождения в зависимости от наступления или ненаступления беременности после проведения ЭКО/ИКСИ. Как следует из табл. 5, не выявлено статистически значимых различий в содержании мРНК LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в ткани эндометрия у больных с наступившей и ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ.

Описание достоверных корреляций между экспрессией LIF, LIF-Rα, gp130 по результатам определения этих показателей методом ИФА в крови и другими методами (ИФА, иммуногистохимический — в эндометрии и qRT-PCR — в эндометрии) у больных с бесплодием трубного происхождения и наступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ. Как следует из табл. 6, содержание LIF в крови с высоким уровнем коэффициента (r) статистически значимо коррелировало c уровнем ФСГ (r=0,450) и sgp130 (r=0,432) по данным ИФА, с уровнем LIF-Rα (r=–0,391) в поверхностном эпителии, уровнем LIF-Rα (r=–0,566) в эпителии желез, по данным иммуногистохимии, уровнем gp130 (r=0,864), по данным qRT-PCR. Содержание LIF-Rα в крови коррелировало по данным иммуногистохимии с уровнем LIF в поверхностном эпителии (r=–0,391) и уровнем LIF в эпителии желез (r=–0,566). Уровень sgp130 в крови коррелировал с содержанием LIF (r=0,432) в крови по данным ИФА и уровнем LIF (r=0,864) по данным qRT-PCR.

Анализ этих результатов свидетельствует о том, что содержание LIF и LIF-Rα в крови имеет соответствующую лиганд-рецепторную обратную корреляцию с содержанием LIF-Rα и LIF в поверхностном эпителии и эпителии желез эндометрия. Следовательно, изменение содержания LIF и LIF-Rα в крови приводит к соответствующим обратным изменениям в эндометрии. Нарушение этого принципа вносит диссонанс в лиганд-рецепторные взаимодействия в эндометрии, что в конечном итоге может влиять на экспрессию LIF и LIF-Rα в эндометрии и тем самым нарушать его рецептивность по отношению к эмбриону и наступлению беременности. Следует особо отметить и роль прямой корреляции между содержанием LIF и уровнем ФСГ в крови. Эта установленная особенность доказывает участие LIF в регуляции циклических изменений в эндометрии и зависимость от ФСГ. При корреляционном анализе установлена взаимосвязь между содержанием LIF в крови и содержанием gp130 (0,864) в ткани, а также содержанием sgp130 и LIF (0,864) в ткани эндометрия, что указывает на взаимовлияние содержания LIF в крови и уровня мРНК sgp130, а также уровня sgp130 в крови и содержания мРНК LIF в ткани эндометрия.

Проведенные исследования позволили сравнить результаты трех высокоинформативных методов: ИФА, иммуногистохимического и qRT-PCR. Сопоставление этих данных позволяет не только дополнять результаты друг друга, но и верифицировать изменения по отношению к контрольной группе и провести корреляционный анализ данных в стандартных условиях. Учитывая, что анализ результатов в крови носит системный характер, а методом qRT-PCR осуществлялся на основе предварительной гомогенизации ткани и экстракции из нее мРНК, не представлялось возможным учесть распределение LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 по типам клеток и их локализации. В то же время ИФА позволил установить распределение LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 по типам клеток и их локализации, но этот метод является полуколичественным и носит элементы субъективного восприятия. ИФА является методом количественного определения белков, но не позволяет уточнять их локализацию и оценивать уровень мРНК-зависимой экспрессии.

По нашим данным, у женщин с ненаступившей беременностью отмечалось снижение содержания в крови LIF и sgp130 и экспрессии LIF, LIF-Rα, SOCS1 в поверхностном эпителии и эпителии желез эндометрия по данным иммуногистохимического исследования по сравнению с женщинами, у которых наступила беременность. Результаты анализа содержания мРНК LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в эндометрии показали отсутствие статистически значимых различий у женщин с наступившей и ненаступившей беременностью.

Ранее нами были получены данные о:

— наличии cистемных и локальных изменений уровня L-селектина (L-Sel) и лиганда МЕCА-79 при трубном бесплодии в программах ЭКО/ИКСИ [5];

— влиянии на наступление беременности плотности нервных волокон и экспрессии ядерных изоформ рецепторов эстрогенов и прогестерона в эутопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза [2];

— роли растворимых и клеточных селектинов в наступлении беременности при лиганд-рецепторных взаимодействиях эмбриона и эндометрия [1];

— экспрессии ядерных изоформ рецепторов эстрогена и прогестерона в эндометрии у больных с бесплодием трубного происхождения: наступление беременности после проведения ЭКО/ИКСИ [4];

— изменении сигнальных путей LIF и IL-1 у больных с перитонеальной формой генитального эндометриоза и бесплодием.

Все эти данные с учетом полученных результатов позволили представить сравнительную фенотипическую характеристику экспрессии PGP9.5, ЭР, ЭР-α, ЭР-β, ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, IL6-Rα, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, L-Sel, MEСA-79 в эндометрии у больных с бесплодием трубного происхождения и больных с эндометриозом и бесплодием (табл. 7). Из табл. 7 следует, что у больных с бесплодием трубного происхождения при ненаступлении беременности по отношению к наступлению беременности отмечается низкая экспрессия в эндометрии в периоде «окна имплантации»: ЭР-α, ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, MEСA-79 и высокая экспрессия L-Sel. В то же время у больных с бесплодием и эндометриозом при ненаступлении беременности по отношению к наступлению беременности наблюдается низкая экспрессия в эндометрии в периоде «окна имплантации»: ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, MEСA-79 и высокая экспрессия ЭР-α, PGP9.5, L-Sel. Следовательно, при бесплодии трубного происхождения отмечаются менее выраженные изменения в эндометрии в период «окна имплантации» по сравнению с больными с перитонеальной формой эндометриоза. Несомненно, что более высокий процент наступления беременности после проведения ЭКО/ИКСИ у больных с бесплодием трубного происхождения по отношению к больным с эндометриозом объясняется именно этими различиями [6]. Различия и схожесть в изменениях сигнальных и, как следствие, метаболических путей в реализации функциональной активности эндометрия при бесплодии трубного происхождения и перитонеальной форме эндометриоза убедительно доказывают роль эндометриального фактора в развитии этой патологии.

Pro et contra. Могут ли эти изменения влиять на состояние эмбриона 3—5-го дня развития в период его естественного нахождения в полости матки до начала процесса нидации, учитывая, что при проведении ЭКО/ИКСИ эти взаимодействия за счет инкубирования in vitro исключены? Нами в 2015 г. проведено первое сравнительное исследование по активации у эмбрионов 3-го и 5-го дней культивирования сигнального пути LIF/LIFR/gp130 [3]. Показано, что полученные результаты могут служить дополнительными диагностическими признаками оценки жизнеспособности и функциональной активности эмбриона. Возможность контролировать активацию сигнального пути LIF/LIFR/gp130 у эмбрионов открывает дополнительные ресурсы дозированного включения в состав среды культивирования необходимых индукторов для повышения качества эмбрионов и является новым направлением в контролируемом развитии эмбрионов перед переносом их в полость матки. Учитывая, что для начала развития беременности необходимо участие клеточных структур матери, необходимо и создание системы картирования фенотипических признаков эутопического эндометрия, позволяющей контролировать систему взаимодействия между эмбрионом и клеточными структурами, окружающими его после внесения в полость матки при проведении ЭКО/ИКСИ. Эти исследования являются весьма перспективными для повышения эффективности ВРТ.

Таким образом, проведенные исследования содержания LIF, sLIF-R, sgp130 в крови, экспрессии LIF, LIFR, gp130, SOCS1 в поверхностном эпителии и эпителии желез эндометрия и содержания мРНК LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в ткани эндометрия у больных с бесплодием трубного происхождения показали, что при ненаступившей беременности по отношению к наступившей беременности наблюдается снижение содержания в крови LIF, sgp130, экспрессии LIF, LIF-Rα, SOCS1 по данным иммуногистохимического исследования и отсутствие изменения уровня мРНК LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1. Установленные изменения, несомненно, могут влиять на рецептивность эндометрия и приводить к развитию субфертильности у больных с бесплодием трубного происхождения. Результаты определения в крови содержания LIF и экспрессии LIF, LIF-Rα, SOCS1 в поверхностном эпителии и эпителии желез эутопического эндометрия перед назначением лечения у больных с бесплодием трубного происхождения могут служить дополнительными показателями в оценке фертильности и эффективности лечения.

Благодарности. Выражаем благодарность ass. professor Anneli Stavreus-Evers и professor Matts Olovsson, Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие в обсуждениях и поддержку. Работа выполнена по теме: «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами и фертильностью у женщин с и без эндометриоза» (госрегистрация России в НТИМИ № 0465/03/10). Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской Королевской Академией наук, Шведским медицинским Исследовательским Советом (гранд № 8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы, Швеция, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России и Минздравом России.